Yöntem makalesi

Bir ile Bulaşıcı Süngerimsi Ensefalopati Türler Engelleri değerlendirilmesi

7.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52522

⸱

10 Mart 2015

 ,  ,  ,  , 
1USGS National Wildlife Health Center, 2Department of Soil Science, University of Wisconsin–Madison, 3Laboratory of Immunology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 4Merial Veterinary Scholars Program, School of Veterinary Medicine, University of Wisconsin–Madison, 5Department of Neurology, University of British Columbia

Bu makalede

Özet

Prion hastalıklarının türler arası bulaşmasının önündeki engeli ölçmek zordur ve tipik olarak hayvan zorluklarını veya biyokimyasal analizleri içerir. Burada, tür engellerini tahmin etme yeteneğine sahip bir in vitro prion protein dönüşüm testi sunuyoruz.

Özet

Bulaşıcı süngerimsi ensefalopatilerin (TSE'ler, prion hastalıkları) türler arası geçişini anlamaya yönelik çalışmalar, tipik olarak uzun ve maliyetli in vivo hayvan mücadele çalışmalarına dayandıkları için zordur. Prion tür engellerinin ölçülmesine yardımcı olmak, böylece hayvan kullanımını azaltmak ve hayvan biyo-tahlillerinden daha hızlı sonuçlar sağlamak için bir dizi in vitro test geliştirilmiştir. Burada, dönüşüm verimlilik oranı (CER) testi adı verilen hızlı bir in vitro prion dönüşüm testi için protokolü sunuyoruz. Bu tahlilde, enfekte olmamış bir konakçı beyinden alınan hücresel prion proteini (PrPC), iki substrat üretmek için hem pH 7.4 hem de 3.5'te denatüre edilir. pH 7.4 substratı TSE ajanı ile inkübe edildiğinde, proteinaz K (PK) dirençli duruma dönüşen PrPC miktarı, orijinal konakçının TSE ajanına olan tür bariyeri tarafından modüle edilir. Buna karşılık, pH 3.5 substratındaki PrPC, herhangi bir TSE ajanı tarafından yanlış katlanır. İki substrattaki PK'ye dirençli prion proteininin miktarını karşılaştırarak, konakçının tür bariyerinin bir değerlendirmesi yapılabilir. CER testinin, laboratuvar farelerinin bilinen prion tür bariyerlerini doğru bir şekilde tahmin ettiğini ve örnek olarak, vaşakların (Lynx rufus) ak kuyruklu geyiklere (Odocoileus virginianus) kronik israf hastalığı ajanına duyarlı olabileceğini düşündüren bazı ön sonuçlar gösteriyoruz.

Giriş

Bulaşıcı sünger tipi ansefalopatiler (TSEler prion hastalıkları, vs.), hayvanlarda ve insanlarda çeşitli etkiler uzun kuluçka dönemleri ile ölümcül nörodejeneratif hastalıkların bir grubudur. TSElerin varsayılan etiyolojik ajan bir enfeksiyon, hastalık ile ilişkili olarak PrP ​​(PrP C) normal hücre formunun şablon odaklı dönüştürme yoluyla kendi kendine yayılma kapasitesine sahip konakçı prion proteini (PrP), bir yanlış katlanmış izomer oluşur enfekte konak 1 merkezi sinir sistemi dokularında biriken formu (PrP TSE). Bulaşıcı memeli prionların genellikle türler arası iletim olayları 2 sınırlayıcı "TSE tür engeli" kavramına yol açmıştır bir türe özgü bir şekilde, konak-to-host dan iletir. prion tür bariyer biyolojik belirleyicileri iyi anlaşılmış değildir. Bulaşıcı PrP TSE ve ana PrP Cı C arasında amino asit dizisi benzerliğibir kuvvetle dönüşüm 3-5 gerçekleşir, ancak in vivo 6,7 gözlenen tüm prion iletim olayları açıklamak için yetersiz kalır mı etkilemektedir.

Böylece, TSE tür engellerin karakterizasyonu büyük ölçüde hayvan meydan çalışmaları güvenerek etti: diğerinden prionlara verilen bir türe naif hayvanların teşhir ve hastalığın başlangıcında ve iletim verimliliği göstergeleri olarak saldırı hızı ortaya çıkan kuluçka süresi ölçme. Insan olmayan primat, PrP C ifade eden fareler da çalışma 8, bu tür kullanılır. transgenik fare üretimi ve uzun süreli prion biyoanalizlerin yanı sıra, hayvan kullanımının etik hususlar ile ilgili maliyetler, TSE türleri engellerin deneysel soruşturma engeller vardır. TSEler insan türü bariyer değerlendirilmesi, insan PrP C ifade etmek üzere geliştirilen fareler üzerinde dayanır. Bu fareler insan TSElerinin veya t değişikliklere yenik uzun kuluçka dönemleri gerektirirhızlı hastalık başlangıcı 9 o insan PrP C molekülü. Bu farelerde insan olmayan TSEler için İnkübasyon süreleri zorlu negatif sonuçların yorumunu yapıyor normal fare ömrü ötesine uzanabilir. Sigara insan primatlar da insan türü engelleri incelenmesi için vekiller olarak kullanılmıştır, ama insan konakta ilerlerken bu çalışmalar tam hastalığı özetlemek olmayabilir hayvan deneyleri ve insan olmayan primatların diğer türleri gibi aynı sorunlarla doludur.

Hayvan biyodeneyler bir TSE için bir türün hassasiyetini ölçmek için "altın standart" yöntemi kalır, ancak engeller, maliyetler ve bu canlı hayvan çalışmalarının etik alternatifler soruşturma mecbur var. PrP TSE tarafından seribaşı bir proteinaz K (PK) dirençli devlet (PrP res) ev sahipliği PrP C dönüşüm değerlendirilmesine dayanmaktadır in vitro tahliller, bir dizi gelişmiş ve TSE sp araştırmak için kullanılmıştırecies engelleri 10-12. In vitro tahlillerin örnekleri, hücre içermeyen dönüşüm tahlilleri, protein siklik amplifikasyon (PMCA) yanlış katlanması ve dönüşüm verimliliği oranının (CER) deney 10-14 içerir. Bu testlerin hiçbiri doğal enfeksiyondan sonra tür engelleri katılan hesap periferik faktörler içine alırken, tüm TSEler için potansiyel duyarlı ana belirlemek için yararlı olabilir.

Burada normal beyin homojenatlanndaki elde edilen iki denatüre PrP substratı tezgah üstü prion dönüştürme reaksiyonlarında kullanıldığı CER tahlili için protokol, (Şekil 1) 13 sunulmaktadır. PH değeri 7.4 'de denatüre alt-tabaka PrP Cı sadece bir tür bariyer 14 yokluğunda reaksiyona içine ekildi PrP TSE PrP res dönüştürülebilir. Bunun aksine, pH 3.5, diğer alt-tabaka PrP C denatürasyonu PrP res aşağıdaki kuluçkalama dönüştürülmesini sağlarve herhangi bir türden elde edilen PrP TSE ile dönüşüm için bir kontrol olarak işlev görür. pH 3.5 substratın pH 7.4 alt-tabaka görece PrP res PrP C dönüşüm oranı tür bariyer bir ölçü sağlar. Bu da, CER deneyi, çeşitli TSElerin laboratuar farelerin türler arası bilinen tahmin eder ve kronik bitkinlik hastalığını (CWD) ve diğer TSEler 14 Hammond koyun dahil olmak üzere birçok memeli türünden, bir tür bariyer tahmin çabalarında deneyi kullandık bulmuşlardır 15. Yararlı Bu metodoloji bulacaksınız TSE türleri engelleri ya da PrP C -to-PRP res dönüşüm değerlendirilmesi hızlı tarama sağlayan bir araç ilgilenen Müfettişler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

USGS Ulusal Yaban Hayatı Sağlığı Merkezi'nde gerçekleştirilen Hayvan çalışmaları Laboratuar Hayvan Refahı kurallar NIH Ofisi uyarınca ve kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi protokol # EP080716 altında yapıldı. Avcı-hasat hayvanlardan dokular Wisconsin veya Doğal Kaynaklar Michigan Müdürlüklerinden hediye edildi.

1. Çözüm hazırlanması

Not: Aşağıda listelenen çözümler aşağıda Bölüm 2 CER deney alt-tabakanın hazırlanması için gereklidir. Daha yüksek konsantrasyonu, stok çözeltilerinden, bu çözümlerin her birinin hazırlanması; stok çözeltileri için tavsiye edilen konsantrasyon listelenen her biri ilgili kimyasal tanımlamanın sonra parantez içinde verilmektedir. Kullanılana kadar 4 ° C'de Yüzey hazırlığı ve mağaza üzerine taze tüm çözümleri hazırlayın.

  1. 100 mM s: liziz tamponu için, 10 mM Tris içinde, pH 7.5 (1M Tris, pH 7.5 stok çözeltisi tavsiye edilir) aşağıdaki içeren bir çözelti hazırlamakde sodyum klorid (NaCI, 1 M stok çözelti), 10 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA, 500 mM EDTA, pH 8.0 stok çözelti),% 0.5 NP-40 (% 10 stok çözelti),% 0.5 deoksikolat (DOC,% 10 stok çözeltisi ).
  2. Dönüşüm tamponu sağlamak için,% 0.05 sodyum dodesil sülfat (SDS,% 10 stok çözelti) ve% 0.5 Triton X-100 1, fosfat tamponlu tuzlu su içinde (% 10 stok çözelti) (PBS, 10, pH 7.4 stok çözelti) ihtiva eden bir çözelti hazırlayın.
  3. Chaotropic çözümler için, guanidinhidroklorid 1x PBS (GdnHCl, 8 M stok) (10x stok çözelti) iki 3 M çözüm hazırlamak. Konsantre edilmiş hidroklorik asit (HCl) ile 3.5 ± 0.05'e çözümlerden biri pH ayarlayın. İkinci çözeltinin pH değeri pH 7,4 ± 0,05 kalmasını kontrol edin ve konsantre HCI veya sodyum hidroksit (NaOH), gerekirse kullanarak ayarlayın.

2. CER Testi Yüzey Çiftleri hazırlayın

  1. Ilgi türlerin sağlıklı olmayan TSE-enfekte beyin dokusu elde edilir ve% 10 ağırlık başına hacim hazırlamakAşağıdaki yöntemlerden herhangi biri kullanılarak parçalama tamponu içinde homojenatı (ağ / hac): Dounce, boncuk değirmeni veya havan ve dibek homojen hale getirilmesi. Ayrıca, şırınga-ve-iğne homojenizasyon onları tabi tabaka aspire ve 27 G şırınga iğne ile kolaylıkla sınırdışı edilebilir kadar artan göstergesi iğneler kullanarak homojenatları ortaya çıkan rafine.
    1. Kemirgenler ve diğer küçük memeliler hazırlanan yüzeyler için, bütün beyin (ler) homojenize; Daha büyük memeliler hazırlanan yüzeyler için, homojenatları hazırlamak için obex (beyin sapı) doku kullanın. Beyin homojenatının miktarını seçerken, Aşama 2.6 protein çökelmesi için kullanılan santrifüj kapasitesinin en fazla% 50 hazırlar.
    2. Edinilmiş beyin dokusunun kalitesi sorgulanabilir ise, SDS-PAGE 16 ve immunoblot 17 alt tabakaya önce hazırlık PrP ​​C düzeylerini değerlendirmek.
  2. Ayrı etiketli plastik konik tüpler iki eşit hacimlerde içine beyin Homojenat bölün. (GdnHCl EkleBeyin homojenatı 1 hacim oranı: pH 3.5 ya da 1, her bir tüpe 7.4 ya da 1 PBS içinde 3 M solüsyonu).
  3. Iki çözeltinin pH değeri kontrol edin. Konsantre HCI kullanılarak 0.05 ± pH, pH 3.5, substratın pH ayarlayın. Diğer alt-tabakanın pH'ı, pH 7.4 ± 0.05 olarak kalmasını sağlamak ve HCI veya NaOH ile gerektiğinde gerekli olduğu yerde pH'ı ayarlamak. Asit veya bir baz makul ilavesiyle pH değerleri aşılması kaçının.
  4. 5 saat boyunca oda sıcaklığında (RT), bir ucu-üzerinde-ucunda karıştırıcı çözüm döndürün.
  5. Her konik bir tüp içinde alt-tabaka çözeltiler metanol dört hacmi eklenerek proteinin çökeltilmesi, girdap, iyice karıştırılmakta ve 16-18 saat süre ile -20 ° C 'de inkübe etmek.
  6. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 13,000 x g'de santrifüj ile tortu örnekleri. Dikkatle süzün ve Süpernatantlar atmak ve metanol pelet buharlaşmasına izin verin. Tüp içine sarıldı metanol emmede yardım sağlamak için pamuk uçlu aplikatörler kullanın. Pelet over-dr izin vermeyiny ve metanol artık görünür bir kez, bir sonraki adıma geçin.
  7. Dönüşüm tampon maddesi içinde yeniden süspanse Protein peletleri. Aşama 2.2 Her tüpe dağıtılmıştır beyin homojenatı başlangıç ​​malzemesinin miktarına eşit dönüşüm tampon bir miktar kullanın.
    NOT: Bu dönüşüm tampon hem de pH 3.5 ve 7.4 ile muamele edilmiş alt-tabaka preparatlar protein pelet yeniden askıya almak için (deterjan düşük seviyeleri ve fizyolojik bir pH'a sahip) Yukarıdaki adım 1.2 tanımlanan bir çözelti kullanılır kritiktir.
  8. Bir cuphorn sonikatörde Kısaca sonikasyon altyapı solüsyonları, (% 30 maksimal gücü ° 'de 10 sn), 0.5 içine kısım - etiketli bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde, 1.0 ml hacim. Her bir alt-tabakanın bir tümbölen üzerinde bir kalite kontrol immüno (adım 2.9) yapın. CER tahlili (Bölüm 4) gerçekleştirmek için hazır olana kadar -80 ° C'de diğer alikotları saklayın.
  9. Kullanmadan önce CER substrat çiftleri (Şekil 2) kalite kontrolünü gerçekleştirin. Bu adımlar CER alt-tabakalar provid sağlamakDönüşüm çalışmalarında E en iyi sonuçlar.
    1. İki yüzeylerde PrP C karşılaştırılabilir miktarda olun. 10-25 SDS-PAGE 16 tarafından her alt tabakanın ul ve 17 imünolekeleme PrP seviyelerini karşılaştırın. 7.4 ve 3.5 alt-tabakalar birbirinin% 10 ~ dahilinde pH protein seviyeleri, alt-tabaka çiftlerinin CER çalışmalarda kullanım için uygun ise.
      NOT: PrP immünblotlarında geniş PrP C bozulma kanıt göstermek gerekir. PrP imünoreaktivite özellikle> 20 kDa olmalıdır. Bu moleküler kütleye daha az Grupları bozunma ürünleri olabilir. Bantlama desen substrat çiftleri arasında kabaca eşit olmalıdır.
    2. Her iki alt tabaka PrP Cı duyarlı PK olması gerektiği gibi, 100 ug / ml bir son konsantrasyonda PK ile her bir alt tabaka 10-25 ul tedavi ve ısı bir çalkalayıcıda 1 saat süreyle 37 ° C'de 1000 rpm'de örnekleri özet. SDS-PAGE 16 ve 17 imünolekeleme kalan herhangi bir sinyal PrP değerlendirin.PrP res ile Yüzeyleri CER çalışmalarında kullanılmak için uygun değildir.

3. TSE Ajan tohumları hazırlayın

  1. Çevrede türünden TSE ile enfeksiyona uğramış beyin dokusu elde edilir ve 1 x PBS, pH 7.4 içinde homojenat yukarıdaki adım 2.1 listelenen yöntemler kullanılarak (a / h), 10% hazırlar.
    Not: Tohumlar aynı zamanda merkezi sinir sistemi dışındaki diğer TSE ile enfeksiyona uğramış doku elde edilebilir, bununla birlikte, TSE ile enfeksiyona uğramış periferik dokularda türetilen tohumlar ile beyin türevi substratların dönüşüm etkinliği daha deneysel yayınlanmış literatürde değerlendirilmemiştir.
  2. 100 içine Homojenat (ler) elde edilen kısım - hazır olana kadar -80 ° C de, 0.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde 300 ul hacim ve mağaza CER deneyi gerçekleştirmek için.

4. CER Testi

Not: CER deney bir türden ("tohum" olarak verilen), PrP TSE nispeten küçük bir miktarının ilave edilmesini içerirkısmen pH 3.5 ya da 7.4 ya da C'da denatüre edilmiş olan başka bir türden (enfekte edilmemiş beyin "alt-tabaka" olarak verilen), PrP ° C'lik bir kıyasla, daha fazla içine. Uzun bir çalkalama enkübasyon süresinin ardından, her bir reaksiyon PrP TSE PrP C şablon odaklı dönüştürme PrP res kalan PK sindirim hem de immün algılama sonra densitometrik sinyali ile değerlendirilir. Daha önce pH değeri 3.5 vs 7.4 de denatüre yüzeylerde PrP res seviyelerini karşılaştırılması tür engeli bir ölçü sağlar. Bu deney prosedürü bir deneme genel görünüşü Şekil 1'de verilmiştir.

  1. Yavaş yavaş bulaşmamış CER substrat çiftleri çözülme buz yatağı (yaklaşık 1 saat çözülme zamanı) üstüne yerleştirerek ve TSE-enfekte tohum çözümleri (tahlil daha önce hem pH 3.5 ve 7.4 de denatüre yüzeylerde eşit hacimlerde gerektirir).
  2. Tamamen çözülmüş sonra, aspirat ve ardından aracılığıyla her bir taban çözüm sınırdışı27 G iğne şırınga birkaç kez yeniden homojenize. Kısaca, 30% maksimum güç ° 'de 10 saniye boyunca her bir TSE ile enfeksiyona uğramış tohum çözeltisi sonikasyon. Dönüşüm reaksiyonları hazırlarken buz üzerinde tüm çözümleri tutun.
  3. TSE ajanı başına Etiket 5 ayrı düşük bağlanma, ince duvarlı PCR tüpleri test edilir.
  4. PH 3.5 hazırlanmış, pH 7.4 ve (b) CER alt-tabaka hazırlanır: (a) CER alt-tabaka 95 ul% 10 TSE ile enfeksiyona tohum çözeltisi 5 ul ekleyerek, bu tüpler dönüşüm reaksiyonları hazırlayın.
    1. Her deney örneği için, önce her iki pH değeri 3.5 ve 7.4 de denatüre CER substrat çiftleri paralel reaksiyonlar hazırlamak.
    2. Ampirik belirlenmesi yoluyla enfekte olmamış beyin yüzeye TSE ajanı tohum oranları optimize. Ortak tohum: kullanılan alt-tabaka oranları 100 ul toplam reaksiyon hacmi korumak ve 1:99 ul 2:98 ul ve 5:95 ul bulunmaktadır. Çoğu uygulama için, 5:95 ul tohumu: Yüzey hacim oranı uygun ve inci ne sunulmuştur edilirprotokoldür.
  5. Aşağıdaki gibi, TSE maddesi başına üç kontrol numuneleri, test edilen hazırlayın: (a) giriş PrP res için bir kontrol olarak 95 ul dönüşüm tamponu,% 10 TSE ile enfeksiyona tohum çözeltisi 5 ul; (b) pH değeri 3.5 ve non-spesifik olmayan şablonu dönüşüm için kontrol olarak (C), pH 7.4'te hazırlanan 95 ul substrata 5 ul dönüşüm tampon eklemek.
  6. Kısaca iyi tohum ve alt tabakayı karıştırmak için kapalı PCR tüpünde her örnek vorteks. PCR tüp kapağına sıkışan reaksiyon karışımının herhangi hacmi kaldırmak için düşük hızda tezgah üstü mini santrifüj bir anlık darbe ile izleyin.
  7. PCR tüpleri kabul donanımlı bir tezgah üst termo-çalkalayıcı içine ayrı ayrı etiketli PCR tüpleri yükleyin örnekleri. 24 saat boyunca 37 ° C'de 1000 rpm'de örnekleri çalkalayın.
  8. Izlenerek (ağırlık / hacim) ve FK-100 ug / ml 'lik bir nihai konsantrasyona kadar% 2'lik bir nihai konsantrasyona kadar Sarkosyl ilave sarsma. Özet örnekleri termo-karıştırıcısı içinde 1 saat boyunca 37 ° C'de 1,000 rpm'de.
    NOT: PrP C PK sindirim örneklerin sonrası dönüşüm yardımları için Sarkosyl eklenmesi. Giremeyen numuneler (4.5 Adım) yanlış pozitif sinyaller neredeyse Sarkosyl eklenmesiyle ortadan kalkar.
  9. 17 immunoblotting SDS-PAGE 16 her bir numune içinde Kalan PrP res 5 dakika boyunca 95 ° C'ye kadar, SDS-PAGE numune tampon maddesi, ısı örnekleri ekleyin ve çözmek.
    Not: Örnek tampon ve ısıtma ek olarak, örnekler hemen işlenebilir veya örnekleri -20 ° C'de saklandı veya -80 ° C önce immunoblotting sonra. Burada sunulan tüm veriler Novex NuPAGE jel ve transfer sistemleri kullanılarak üretildi. CER tahlilinden Tüm örnekler örnek tamponu ve üreticinin talimatlarına uygun olarak indirgeme maddesi ile muamele edilmiştir. Numuneler daha sonra 5 dakika boyunca 95 ° C'de ısıtıldı ve her numune için 30 ul% 12 Bis-Tris hazır jel yüklenmiştir.
  10. Bir tedbir olarak dönüşüm verimliliği oranı (CER) hesaplayıntür bariyer. Dansitometri 17 ile PrP res Tedbir seviyeleri ve pH 3.5 örnek olduğu pH 7.4 numunenin toplam yoğunluğunu bölmek. Bir yüzdesini üretmek için 100 ile çarpın.
  11. Belirli bir TSE ajanı ile bir tür için ortalama CER ± standart sapma oluşturmak için bağımsız deneysel çoğaltır gelen verileri derlemek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

CER testinin başarılı kullanımı dönüşüm reaksiyonlarında kullanılan substrat çiftlerinin kalitesine büyük ölçüde bağlıdır. Bu nedenle, alt-tabaka çiftini CER hazırlanması için prosedürler takip edilerek, bir kalite kontrol immünoblot (Şekil 2) yapılmalıdır. Her iki yüzeyler için, tahlil imünoblotlama ile 10-25 ul. PrP Cı her alt-tabaka olarak kolaylıkla tespit edilebilir ve PrP C düzeyleri ikisi arasında yaklaşık olarak aynı olmalıdır. Immünoreaktivite 20 kDa üzerinde ağırlıklı ola...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokolün başarıyla tamamlanması için, dikkat substrat hazırlanması (adım 2.1.2) ve dönüşüm reaksiyonlarının (adım 4.4.2) için madde oranı için tohum için kullanılan bulaşmamış beyin dokusunda PrP C seviyelerine dikkat edilmelidir. Bizim tecrübelerimize göre, beyinleri sürece PrP C immunoblotting (Şekil 4) ile mevcut olduğu gibi, önemli bir dönem otopsi sonrası CER substrat olarak kullanılmak üzere elde edilebilir. Aslında, bazı otoliz CER çalışmalar için kullanılan bobcats bey...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

John Olsen (Wisconsin Doğal Kaynaklar Departmanı), Tom Cooley, Daniel O'Brien ve Steve Schmitt'e (Michigan Doğal Kaynaklar Departmanı) ve Dr. Daniel Walsh'a (USGS Ulusal Yaban Hayatı Sağlığı Merkezi) doku edinimi konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca tanı testi hizmetleri için Wisconsin Eyalet Hijyen Laboratuvarı'na ve ekipman kullanımı için Dr. Tonie Rocke ve ekibine (USGS Ulusal Yaban Hayatı Sağlık Merkezi) teşekkür ederiz. Ticaret, ürün veya firma adlarının herhangi bir şekilde kullanılması yalnızca açıklama amaçlıdır ve ABD Hükümeti tarafından onaylandığı anlamına gelmez.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%12 Bis-Tris SDS-PAGE jellerYaşam TeknolojileriNP0342
0,5 mm Zirkonyum oksit boncuklarSonraki İlerlemeZROB05Diğer boncuk çeşitleri de etkilidir
Antikorlarçeşitli tedarikçilerİlgilenilen türlerden PrPres immünoblot tespiti için uygun primer ve sekonder antikorları seçin
Boncuk homojenizatörSonraki İlerlemeBBY24M
SantrifüjBeckman Coulter369434Sıcaklık kontrollü yüksek hız
Konik tüplerherhangi bir marka
Pamuk uçlu aplikatörUlineS-18991
Cuphorn sonicatorIsı Sistemleri-UltrasonikW-380Isı Sistemleri-Ultrasonik, Inc. artık Qsonica, LLC
Densitometri yazılım programıUVPVision Works LS Görüntü Alma ve Analiz yazılımıNIH ImageJ gibi diğer programlar da çalışacaktır
Dounce homojenizatörKimble Chase885300
Uçtan uca karıştırıcıLabnet InternationalH5600
Etilendiamintetra asetik asitBoston BioproductsP-770Tehlikeli kimyasal: göz tahrişi
Guanidin hidroklorür, 8 MThermo Fisher Scientific24115Tehlikeli kimyasal: akut toksisite, cilt tahrişi, göz tahrişi
Isıtma bloğuFisher Scientific11-718
Hidroklorik asitSigma-Aldrich435570Tehlikeli kimyasal: güçlü asit
Lityum dodesil sülfat numune tamponu, 4xYaşam TeknolojileriNP0008Tehlikeli kimyasal: cilt ve solunum yolu tahrişi, ciddi göz hasarı, yanıcı katı
MetanolFisher ScientificA454-4Tehlikeli kimyasal: akut toksisite, yanıcı sıvı
Mikrosantrifüj tüpleriherhangi bir marka
Mini-santrifüjLabnet InternationalC1301
N-lauroyl-sarkozin (sarkosil)Sigma-Aldrich L-5125Tehlikeli kimyasal: akut toksisite, cilt tahrişi, göz hasarı
Nonidet P-40AmrescoM158Tehlikeli kimyasal: cilt tahrişi, göz hasarı
SDS-PAGE jel sistemiYaşam TeknolojileriNuPAGE elektroforez sistemiDiğer SDS-PAGE sistemleri de
PCR tüpleri (düşük bağlayıcı)çalışacaktırAxygenPCR-02-LC
Havaneli homojenizatörFisher Scientific03-392-106
pH metreSentronSI600
Polivinildiflorür membranMilliporeIPVH00010
Proteinaz KPromegaV3021Tehlikeli kimyasal: cilt ve göz tahrişi, solunum hassasiyeti, organ toksisitesi
SDS-PAGE numuneleri için indirgeyici ajan, 10xLife TechnologiesNP0009
Sodyum klorürFisher Scientific7647-14-5
Sodyum deoksikolatSigma-Aldrich D6750Tehlikeli kimyasal: akut toksisite
Sodyum dodesil sülfatThermo Fisher Scientific28364Tehlikeli kimyasal: akut toksisite, cilt tahrişi, göz hasarı, yanıcı katı
Sodyum hidroksitSigma-AldrichS5881Tehlikeli kimyasal; güçlü baz
ŞırıngaBD BiosciencesçeşitliHomojenize edilecek substrat hacimlerine uygun şırınga boyutu kullanın
Şırınga iğneleriBD Biosciencesçeşitli
Thermoshaker (PCR tüp çalkalayıcı)Hangzhou Tüm Sheng InstrumentsMS-100
Tris tabanıBio Basic77-86-1Tehlikeli kimyasal: cilt, göz, solunum yolu tahrişi
Triton X-100Integra Chemical CompanyT756.30.30Tehlikeli kimyasal: akut toksisite, göz tahrişi
GirdapBalıkçı Bilimsel12-812

Kaynaklar

  1. Colby, D. W., Prions Prusiner, S. B. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a006833(2011).
  2. Hill, A. F., Collinge, J. Prion strains and species barriers. Contrib Microbiol. 11, 33-49 (2004).
  3. Scott, M., et al. Transgenic mice expressing hamster prion protein produce species-specific scrapie infectivity and amyloid plaques. Cell. 59 (5), 847-857 (1989).
  4. Prusiner, S. B., et al. Transgenetic Studies Implicate Interactions between Homologous Prp Isoforms in Scrapie Prion Replication. Cell. 63, 673-686 (1990).
  5. Telling, G. C., et al. Prion Propagation in Mice Expressing Human and Chimeric Prp Transgenes Implicates the Interaction of Cellular Prp with Another Protein. Cell. 83, 79-90 (1995).
  6. Hill, A. F., et al. The same prion strain causes vCJD and BSE. Nature. 389 (6650), 448-450 (1997).
  7. Torres, J. M., et al. Elements modulating the prion species barrier and its passage consequences. PLoS One. 9 (3), e89722(2014).
  8. Groschup, M. H., Buschmann, A. Rodent models for prion diseases. Vet Res. 39 (4), 32(2008).
  9. Korth, C., et al. Abbreviated incubation times for human prions in mice expressing a chimeric mouse-human prion protein transgene. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4784-4789 (2003).
  10. Kocisko, D. A., et al. Species specificity in the cell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3923-3927 (1995).
  11. Raymond, G. J., et al. Evidence of a molecular barrier limiting susceptibility of humans, cattle and sheep to chronic wasting disease. EMBO J. 19 (7), 4425-4430 (2000).
  12. Fernandez-Borges, N., de Castro, J., Castilla, J. In vitro studies of the transmission barrier. Prion. 3 (4), 220-223 (2009).
  13. Zou, W. Q., Cashman, N. R. Acidic pH and detergents enhance in vitro conversion of human brain PrPC to a PrPSc-like form. J Biol Chem. 277 (46), 43942-43947 (2002).
  14. Li, L., Coulthart, M. B., Balachandran, A., Chakrabartty, A., Cashman, N. R. Species barriers for chronic wasting disease by in vitro conversion of prion protein. Biochem Biophys Res Commun. 364 (4), 796-800 (2007).
  15. Morawski, A. R., Carlson, C. M., Chang, H., Johnson, C. J. In vitro prion protein conversion suggests risk of bighorn sheep (Ovis canadensis) to transmissible spongiform encephalopathies. BMC Vet Res. 9, 157(2013).
  16. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2014).
  17. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2014).
  18. Chandler, R. L. Encephalopathy in mice produced by inoculation with scrapie brain material. Lancet. 1 (7191), 1378-1379 (1961).
  19. Browning, S. R., et al. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
  20. Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. Experimental infection of sheep and goats with transmissible mink encephalopathy virus. Can J Vet Res. 51 (1), 135-144 (1987).
  21. Rubenstein, R., et al. Immune surveillance and antigen conformation determines humoral immune response to the prion protein immunogen. J Neurovirol. 5 (4), 401-413 (1999).
  22. Castilla, J., et al. Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions. Cell. 134 (5), 757-768 (2008).
  23. Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27, 95-125 (2006).
  24. Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5 (3), 150-153 (2011).
  25. Ladner-Keay, C. L., Griffith, B. J., Wishart, D. S. Shaking Alone Induces De Novo Conversion of Recombinant Prion Proteins to beta-Sheet Rich Oligomers and Fibrils. PLoS One. 9 (6), e98753(2014).
  26. Mathiason, C. K., et al. Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease. J Virol. 87 (4), 1947-1956 (2013).
  27. Seelig, D. M., et al. Lesion Profiling and Subcellular Prion Localization of Cervid Chronic Wasting Disease in Domestic Cats. Vet Pathol. , (2014).
  28. Stewart, P., et al. Genetic predictions of prion disease susceptibility in carnivore species based on variability of the prion gene coding region. PLoS One. 7 (12), e50623(2012).
  29. Russell, W. M., Burch, R. I. The Principles of Humane Experimental Technique. Metheun. , Methuen. (1959).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

T r Bariyeri De erlendirmesin Vitro AnalizD n m Verimlilik OranProteinaz K DirenciSDS Page mmunoblotBeyin Dokusu HomojenatTSE Ajan nk basyonuPrP C Denat rasyonuCER Analiz Protokol

İlgili makaleler