Fare Hipokampal Doku Ex Utero Elektroporasyon ve Organotipik Dilim Kültür

Özet

Burada, hipokampal gelişim sırasında belirli genlerin düzenleyici mekanizmalarını incelemek için bir araç sağlayan bir protokol sunuyoruz. Ex utero elektroporasyon ve organotipik dilim kültürünün kullanılması, tek hücrelerde ilgilenilen genlerin ekspresyonunun yukarı ve aşağı regülasyonuna izin verir ve gelişim sırasında kaderlerini takip eder.

Özet

Fare genetiği, gelişim sırasında belirli genlerin rolünü belirleyen güçlü bir araç sunar. Elde edilen fenotiplerin immünohistokimyasal ve moleküler yöntemlerle analiz edilmesi, potansiyel hedef genler ve sinyal yolakları hakkında bilgi sağlar. Spesifik düzenleyici mekanizmaları daha da aydınlatmak için, belirli bir dokunun sadece az sayıda hücresinin aşırı ekspresyonu, ablasyonu veya belirli genlerin yeniden eklenmesi yoluyla manipüle edilmesine izin veren ve gelişim sırasındaki kaderlerini takip eden bir sistem gerekir. Bunu başarmak için hipokampal yapıların, özellikle dentat girusun ex utero elektroporasyonu, ardından organotipik dilim kültürü böyle bir araç sağlar. Mozaik delesyonları oluşturmak için bu sistemin kullanılması, ilgilenilen genin progenitör hücre proliferasyonu veya nöronal farklılaşma gibi hücre özerk gelişimsel süreçlerini düzenleyip düzenlemediğini belirlemeye izin verir. Ayrıca, silinen geni veya hedef genlerini yeniden tanıtarak fenotiplerin kurtarılmasını kolaylaştırır. In utero elektroporasyonun aksine, ex utero yaklaşımı, dentat girus gibi beynin daha derin katmanlarını başarılı bir şekilde hedefleme oranını artırır. Genel olarak, ex utero elektroporasyon ve organotipik dilim kültürü, endojen koşulları yansıtan yarı doğal bir ortamda düzenleyici mekanizmaları incelemek için güçlü bir araç sağlar.

Giriş

hipokampus bir hafıza ve öğrenmede önemli rol yanı sıra duygusal davranış oynar. Bir ana işlevi sinir sisteminin yüksek plastisite gerektiren uzun süreli belleğe kısa süreli hafıza konsolidasyon oluşur. hipokampus dentat girus giriş bilgileri için birincil ağ geçidi gibi davranır ve yetişkinlik ^1,2 genelinde de devam eden nöron iki beyin bölgelerinden biri olduğunu. Hipokampal yapının geliştirilmesi geç embriyojenez sırasında ve özellikle de ilk 3-4 hafta postnatal ³ sırasında meydana gelir. Dentate erken gelişimi sırasında kök hücre havuzu yetişkin nöron ⁴ yanı sıra postnatal için gerekli kurdu olan gyrus. Gelişmekte nöronlar postnatal yanı sıra yetişkin nöron sırasında olgunlaşmamış ve nihayet olgun nöron progenitör hücrelerin çeşitli aşamalardan kök hücreden, çeşitli aşamalardan geçer. Nöron ifadesi farklı aşamalarındaBelirli genler hipokampal devresi ^5,6 içine olgunlaşmasını ve yeni nöronların entegrasyonu sağlamak için gereklidir.

Bu genlerin çoğunun ifade desen ve fonksiyon tanımlayan izin fare genetik ve immünohistokimyasal olarak fenotip analizinin yanı sıra moleküler yöntemler kullanılarak. Ilave mikroarray analizi gibi kromatin immunoprecipitation (ChIP) potansiyel doğrudan ve dolaylı hedef genlerin ^7,8 hakkında bilgi verdi. Ancak, kıvrımlarının gelişiminde özellikle hipokampal gelişim düzenleyici mekanizmaları ile ilgili pek çok açık sorular, hala vardır. Aşağı veya yukarı-regülasyonu faiz ve / veya hedef genlerin ve gelişim sırasında kaderlerini takip geninin spesifik genlerin hücre az sayıda manipülasyon izin gerekli bir sistem nasıl düzenlendiği ileri fikir edinmek için. Utero elektroporasyon shRNAs, ilgi veya Cre recombina genlerinin cDNAse böyle bir araç sağlar. Elektroporasyon için kullanılmalıdır arzu edilen DNA ya da küçük RNA'ların sentezleme plazmidlerin varlığını sağlamak. Bu yaklaşım çok başarılı nedeniyle derin beyin tabakalarında hipokampal yapıların konumuna dentat girus gelişimini inceleyen bir daha zorlu bir yaklaşım kortikal gelişimini ^9,10 okuyan uygulanan, ancak mesafesindedir.

Organotipik dilim kültür ardından Ex utero elektroporasyon bu sorunu aşmak ^11,12 bir yaklaşımdır. Aksine utero elektroporasyon değil bütün embriyo ancak kafa nedenle hipokampus ve dentat girus doğru shRNA / DNA doğrudan daha uygun bir şekilde elektrotlar yerleştirmek için izin kullanılan mi. Grubumuz başarıyla dentat girus gelişimi ⁸ sırasında transkripsiyon faktörü Bcl11b rolünü incelemek için ex utero elektroporasyon istihdam. Bcl11b r tarafından dentat girus gelişiminde ikili bir rolü vardırimmünohistokimya ile gösterilmiş olduğu üzere, progenitör hücre çoğalması aynı zamanda farklılaşma egulating. Bundan başka, bu işlemlerde Bcl11b katılımı için bir mekanizma olarak tanımlamak için, Polleux grubunun ^11,12 protokoller, protokol bölümünde aşağıda anlatıldığı gibi dentat girus çalışma ayarlanmıştır. İlk yaklaşımda soru Bcl11b özerk nöronal hücre farklılaşması hücre düzenleyen olup olmadığını ele alındı. İkinci bir yaklaşım Desmoplakin, Bcl11b doğrudan hedef gen, Bcl11b fenotip kurtarmak için yeterli olup olmadığı incelenmiştir.

Protokol

NOT: Tüm hayvan deneyleri Alman yasalarına uygun olarak yürütülmüştür ve Tübingen devlet daireleri tarafından onaylandı.

Mikropipetler, Çözümler ve Membran 1. Hazırlık

1. Mikropipetler hazırlanması
   1. Aşağıdaki program ile bir mikropipet çektirmenin kullanarak cam mikropipetler çekin: Heat: 540, Pull: 125, Hız: 20 ve Gecikme: 140. iğne uzunluğu miktarda 5,5 cm.
   2. Bir microgrinder kullanılarak Konik iğneleri 4 mm, uygun bir uç boyutu elde edildi. Ipuçları zarar görmemesi için bir kutu ya da 15 cm Petri kabındaki iğneler saklayın.
2. Çözümler hazırlanması
   1. Plazmid DNA Çözelti
      1. Üreticinin protokolüne göre bir Endotoksin serbest Maxi prep kiti kullanarak istenen cDNA, konstrüktünü ihtiva eden plazmid DNA hazırlanması.
      2. DNA (GFP başak vektör olmaksızın) 3 ug / ul nihai konsantrasyona kadar çözelti veya 4 ayarlama ug /ul endotoksinde (GFP başak vektörünün 1 ug) Hızlı Green (nihai konsantrasyon% 0.05) ihtiva eden Tris-EDTA tampon maddesi boşaltın.
   2. Laminin Stok çözümü
      1. 1 ml'lik bir son hacme kadar steril su içinde laminin, 1 mg eritin. -80 ° C'de 100 ul alikotları ve mağaza hazırlayın.
   3. Poli-L-Lizin Stok Çözeltisi
      1. 1 mg / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar steril su, 50 ml poli-L-lisin, 50 mg eritin. -20 ° C'de 1 ml'lik numuneler hazırlayın ve mağaza hazırlayın.
   4. Hank Dengeli Tuz Çözeltisi doldurun (Tam HBSS)
      1. _CaCl2, 10 mi, 100 mM MgSO ₄ 10x HBSS 100 mi, 1 M HEPES tamponu, 2.5 ml (pH 7.4), 1 M, D-glikoz, 30 mi, 100 mM, 10 ml birleştirilerek tam HBSS hazırlayın ve 4 1 ml M NaHCO _3. 4 ° C'de 1 L ve saklamak için steril su ekleyin.
         NOT: Otoklav tüm çözümler 1 M HEPES tampon bekliyoruz ve 1 M D-glikoz, fil vardırter sterilize.
   5. Dilim Kültür Orta
      1. Bazal Orta Eagle 35 ml tam HBSS 12.9 mi (1.2.4), 1 M, D-glikoz, 1.35 ml, 200 mM L-glutamin, 250 ul ve 500 ul ekleyerek dilim kültür ortamı hazırlayın penisilin-streptomisin 50 ml'lik bir nihai hacim elde etmek. 4 ° C'de bir son% 5 konsantrasyon ve saklamak için at serumu ekleyin.
   6. Düşük bir erime noktası (SAT) Agaroz
      1. Agaroz yüksek güçte 1-2 dakika boyunca bir mikrodalga fırın içinde ısıtılması ve ardından tam HBSS, 50 ml (1.2.4) LMP 2 g ekleyerek% 4 LMP agaroz çözelti hazırlayın. 39 ° C - 37 ° C'deki bir su banyosu içinde, bu çözüm tutun. 4 ° C ve yeniden de çözüm saklayın.
   7. Paraformaldehyde Çözüm
      1. Bir çeker ocak içinde 1 x PBS, 100 ml paraformaldeid 4 g ekleyerek% 4 paraformaldehit (PFA) solüsyon hazırlanır. 60 ° C'ye ısıtın çözeltisi ve çözelti C olana kadar, 1 N NaOH ile bir kaç damlaemizle.
   8. Permeabilizasyon Çözüm
      1. 4 ° C'de% 0.3 Triton X-100 ve mağaza içeren 1x PBS 300 ml BSA, 9 g eritin. Uzun süreli depolama için% 10 sodyum azid ekleyin.
3. Membran Ek'lerin Kaplama
   1. 12 ml'lik bir son hacme kadar laminin stok çözeltisi (1.2.2) ve steril su içinde poli-L-lisin stok çözeltisi (1.2.3) bir alikotu bir kısım seyreltin.
   2. Steril su içeren her 2 ml 6 yuvalı plakalara membran geçme yerleştirin. Zarın üzerine kaplama solüsyonu 1 ml ilave edilir ve bir% 5 _CO2 inkübatöründe 37 ° C'de O / N inkübe edin.
   3. İnkübasyondan sonra membran steril su ve kuru, 1 ml ile üç kez ekler yıkayın. Kuru 6 oyuklu bir plaka içerisinde dört hafta boyunca 4 ° C'de aynı gün ya da mağaza Kaplanmış zar, monte edilmelidir.

2. DNA Enjeksiyon ve E15.5 Elektroporasyon ve E18.5 Embriyolar

1. % 5 izofluran ile doyurulmuş ve bir buharlaştıncıya bağlı bir anestezi bölmesi içine yerleştirilerek dişi fare şeklindeki bir saat anestezisi. 1 L / dakikalık bir hızda, izofluran ve oksijen sirküle. 2-4 dakika ya da fare pençeleri arasında sıkıştırarak test edildiği bilinçsiz kadar kutuya hayvan tutun.
2. Embriyonik gün servikal dislokasyon (E) 15.5 18.5 veya tarafından bilinçsiz fare Euthanize. Embriyoları ¹³ içeren rahim inceleyin ve soğuk komple HBSS 15-20 ml içeren bir Petri kabı içine yerleştirin.
   NOT: Bu noktadan itibaren, buz üzerinde embriyo ve dokuları tutmak.
3. Soğuk tam HBSS içeren ikinci bir Petri kabı içine uterin boynuz ve yerden her embriyo ayırmak için bir makas kullanın.
4. Bir mikroskop altında, rahim kas duvarı ve ince forseps (# 55) ve bir makas kullanarak plasentayı sever. Dikkatle sarısı kesesi embriyo serbest bırakın.
5. Decapitat Bonn bir makas kullanınSadece 60 ° açıyla ön ayakları üzerinde e embriyolar. Deney embriyoların genotipleme gerektiriyorsa, genomik DNA izolasyonu için bir doku numunesi (kuyruk küçük bir parça) toplar.
6. Temiz ve kuru bir Petri kabı baş aktarın. Kafası 60 ° açı decapitated olmuştu Çünkü sırt tarafı yukarı yerleştirildiğinde, baş bir tarafa eğin gerekir.
7. Bregmaya hemisfer yakın ortasına dikkatli bir iğne yerleştirin (Şekil 1A, B). 5-8 bakliyat uygulayarak, darbe başına 10-15 milisaniye süresince basınç 30 £ kullanarak Picospritzer III pedala basarak DNA çözüm (3 veya 4 ug / ul at) yaklaşık 2-3 ul enjekte edilir. puls süresi ve sayısı, daha fazla zaman gerektiren küçük açıklıklar iğne açıklığının çapına bağlıdır. Her darbe arasındaki aralık 1 sn tutarlar.
8. Elektrotlar yerleştirerek önce EMBR kafasına tam HBSS birkaç damla uygulamakyo. "Negatif" terminali enjekte ventrikül ve embriyonun kafasının (Şekil 1C, D) kulak altına enjekte ventrikül karşı tarafında "pozitif" elektrod ile aynı tarafta kalacak şekilde elektrotlar yerleştirin. 50 V 5 bakliyat uygulayın
   1. E 18.5 için E 15.5 için 3 mm elektrotları ve 5 mm elektrotları kullanın.

Beyin 3. Diseksiyon

1. Elektroporasyondan sonra, ince forseps bir çift yardımı ile baş deri soyulabilir. Yay makas kullanılarak kafatasının orta hat beyincik ortasında küçük bir kesi yapmak.
2. Kesi içine yaylı makas yerleştirin ve sagital sütür boyunca uzunlamasına kesin. Kafatasını kalkmasına ve ince forseps kullanarak kafatası beyni ayırın. 15-20 ml soğuk komple HBSS çözeltisi içine bütün beyin aktarın.
3. Bu arada,% 4 LMP agaroz dökünAyrılabilen uzak kalıp içine, bir su banyosu içinde 37-39 ° C'de tutuldu.
4. Küçük kepçe spatula ile tam HBSS dışarı beyin alın ve ince doku kağıt veya Kimwipes kullanarak HBSS aşırı boşaltın.
5. Agaroz içine yavaşça bütün beyin yerleştirin ve ince bir iğne ile konumunu ayarlamak. Agaroz katılaşmış ve blok (koronal bölümleri için koku ampuller kadar gelin) kesitli kadar buz üzerinde kalıp tutun.

4. Vibratome Kesit ve Dilim Kültür

1. LMP agaroz blokları Trim ve 'süper tutkal' kullanarak numune aşamasına tutkal onları. Tutkal sonra kuru transfer vibratome tampon tepsiye örnek aşamasıdır ve blok çözeltisi batırılır kadar HBSS tamamlamak soğuk buz ile doldurun.
   NOT: kesit önce% 70 etanol ile tüm enstrüman ve ekipman yüzeyleri sterilize edin.
2. Takip gibi yeni bir bıçak kullanarak 250 mikron kalınlığında vibratome bölümleri hazırlayın.
   1. Blok wi TrimAşağıdaki ayarları inci; Frekans - 60 Hz, genlik - 0.7 mikron, hız 16-18 mm / sn. Yavaş hızda (9 mm / sn) yukarıdaki ayarlarla istenilen doku içeren bölümleri kesin. Beyin gelen kesit başlayarak, beyin 5-7 bölümleri toplamak.
   2. Bükük spatula yardımı ile HBSS tamamlamak ve tüm bölümleri (Şekil 1E) tahsil edilene kadar buz üzerinde tutmak soğuk buz 5 ml içeren bir temiz 6 kuyu kültür çanak bölümleri aktarın.
3. Bölümlerin yönelimleri için, zar üzerinde bölümleri yerleştirmeden önce tam HBSS 100 ul ile çapraz bir şekilde membran ıslatın.
4. (Membran üzerine bölümüne itmek için forseps kullanabilir sonra forseps ile bölümün bir köşesini pick up ve spatula üzerine çekin ve) membran üzerine bükülmüş bir spatula kullanarak bölümleri aktarın. Bir zar üzerinde beş bölümden kadar yerleştirin ve (forseps kullanarak Şekil 1F düzenlemek). Birbirleri ile bölümleri üst üste etmeyin.
   1. Bir pipet kullanarak zarın kapalı HBSS fazlalığı alın. Burada kullanılan özel membranları ve çerçeveye bağlı olarak doku temas ancak orta kapsamadığı sağlar doku kültür plakasının içine yerleştirilir.
5. Dilim kültür ortamında (1.2.5) (Şekil 1G, lH), 1.8 ml su ihtiva eden bir 6 yuvalı plaka halinde membran geçme yerleştirin. 11 DIV veya 14 DIV için% 5 _CO2 ile 37 ° C 'de kültür kaplarına inkübe edin. Yarım orta (0,9 ml), her ikinci gün değiştirin.
   NOT: Bu aşamada, bromodeoksiüridin gibi reaktifler ekleyerek (BrdU 10 uM nihai konsantrasyon) Etiketleme kültür zaman, ilk 20 saat boyunca ortama hücreler proliferasyon için.

İmmünofloresan Boyama Ardından Bölüm 5. Sabitleme

1. Kesmek için temiz ve keskin neşter bıçağı kullanın ve yönüne bağlı olarak membranlar Döşemebölümler.
2. % 4 PFA (1.2.7) 1 ml ihtiva eden bir 24 yuvalı plaka zar ile birlikte bölümleri aktarın. 15 dakika her biri için 1 x PBS ile 3 kez yıkanmasından sonra, oda sıcaklığında 1 saat boyunca bölümler inkübe edin. Hafifçe çalkalama ile 4 ° C'de permeabilizasyon çözeltisi ile bölümleri O / N inkübe edin.
3. Ertesi gün, permeabilizasyon çözeltisi içinde seyreltilmiş uygun primer antikorlar ile bölümleri inkübe O / N veya yumuşak çalkalama ile 4 ° C'de 48 saat karıştırıldı.
4. 1x PBS ile 15 dakika boyunca bölümleri 3 kez yıkayın ve permeabilizasyon çözeltisi içinde seyreltilmiş uygun ikincil antikorlar ile 4 ° C'de O / N inkübe edin.
5. Sekonder antikor ile inkübe edildikten sonra, 10 dakika süre ile DAPI lekelemesi yoluyla, ardından 15 dakika boyunca 1 x PBS ile bir kez bölümleri yıkayın.
6. 15 dakika her biri için bölümleri 1x PBS ile 3 kez yıkayın ve slaytlar mikroskop transfer. ImmunoMount ekleyin ve yavaşça bölümlerin üstüne bir lamel. 4 ° C ve se de slaytlar O / N kurulayınoje ile ark.
   NOT: Her zaman 4 ° C'de slaytlar tutun.
   1. Konfokal mikroskopi (Şekil 1I) tarafından dilim kültürleri analiz.

Sonuçlar

Transkripsiyon faktörü Bcl11b ablasyonu projenitör hücre çoğalması ve azaltılmış dentat girus boyutu ve hücre sayısı ile sonuçlanan nöronal farklılaşma kayıplarına neden olur. Ayrıca mutant nöronlar öğrenme ve bellek bozukluğu ⁸ neden hipokampal devresine entegre başarısız. Eski utero elektroporasyon kullanılmıştır bu süreçlerde Bcl11b düzenleyici mekanizma (lar) ile ilgili soruları cevaplamak için.

Soru hitaben Bcl11b hücre-özerk E15.5 Bcl11b ^{flox / flox} hipok...

Tartışma

hipokampus öğrenme ve hafızada önemli bir işleve sahiptir. dentat girus da nöron gelişimi sırasında aynı zamanda yetişkinlik boyunca sadece oluşur iki beyin bölgelerinden biridir. Doğum sonrası ve bir çok yaygın faktörleri söz konusu eden benzer bir şekilde, yetişkin hipokampal nöron ilerler. Bu faktörlerin düzenleyici mekanizmaların tanımlanması da yeni tedaviler ve önleyici tedbirlere yol açacaktır nörodejeneratif hastalıkların anlaşılmasında çok yararlı olacaktır. Bu bilgiyi edinmek için bir tek hücre manipüle ve Org...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Alevli / Kahverengi Mikropipet Çektirme	Sutter Instruments Company (ABD)	P-97
İnce Cam Pipetler	Warner Instruments	G100F-4
Mikroöğütücü	Narishige, Japonya	EG-44
Anestezik Braket ünitesi	Harvard Aparatı	PY2 34-0412
Halovet Buharlaştırıcı	Harvard Aparatı	PY2 34-0398
Fluovac Sistemi	Harvard Aparatı	PY2 34-0387
IMS Fluosorber	Harvard Aparatı	PY2 34-0415
Anestezi Odası	Harvard Aparatı	PY2 34-0460
Elektroporatör	BEX Company	CUY21 DÜZENLE
Disk elektrotlu cımbız	BEX Company	LF650P3	3 mm elektrotlar için E15.5
Disk elektrotlu cımbız	BEX Company	LF650P5	E18.5
Picospritzer III	Parker Hannifin Corporation	P/N 052-0500-900
HM 650 V Titreşimli Bıçaklı Mikrotom, 230 V	Thermo Scientific	920120
Diseksiyon Mikroskobu	Carl Zeiss Mikroskopi Gmbh	Stemi SV8
Ters Mikroskop	Leica	Leica DM IL LED
Konfokal Mikroskop	Leica	Sp5II
6 kuyulu çanak	BD Falcon	#353502
6 kuyulu çanak	CELLTAR	#657160
Doku kültürü ekleri	BD Falcon	#353090
Hızlı Yeşil	Sigma	F7252
Laminin	Sigma
Poli-L-lizin	Sigma	#P5899
Yaylı makas	Güzel Bilim Araçları	15003-08
Ekstra İnce Bonn Makas	Güzel Bilim Araçları	14084-08
Forseps	Dumont #55	11255-20 Inox
HBSS 10x	Yaşam Teknolojisi	14180-046
BME	Yaşam Teknolojisi	41010-26

#L2020 arası