Farelerde Kararlı Yüksek seviyeli Kemik İliği Kimerizm Yaratma için miyelosupresif Ajan olarak Busulfan

Özet

Busulfan koşullandırmasının, bir alıcı farenin kemik iliğinin, ışınlamanın yokluğunda her yerde yeşil floresan proteini eksprese eden donör farelerden alınan kemik iliği hücreleri ile değiştirilmesine izin veren bir protokolü açıklıyoruz. Bu teknik, merkezi sinir sistemindeki kemik iliği hücresi birikimini incelemek için yararlıdır.

Özet

Kemik iliği nakli (KİT) genellikle alıcı farelerin kemik iliği (BM) bölmesini, donör farelerden izole edilen farklı bir biyobelirteç eksprese eden BM hücreleri ile değiştirmek için kullanılır. Bu teknik, alıcı fareler içindeki donör kaynaklı hematopoietik hücrelerin tanımlanmasına izin verir ve çeşitli biyokimyasal teknikler kullanarak donör hücrelerini izole etmek ve karakterize etmek için kullanılabilir. BMT tipik olarak, donör hücre aşılaması için alıcı farelerin BM bölmesinde niş alan oluşturmak için toplam vücut ışınlaması ile miyeloablatif koşullandırmaya dayanır. Burada tarif ettiğimiz protokol, kemoterapötik ajan busulfan ile miyelosupresif koşullandırma kullanır. Özel tesislerin kullanılmasını gerektiren ışınlamadan farklı olarak, busulfan koşullandırması, toplam 60-100 mg / kg'lık bir doz uygulanana kadar 20 mg / kg busulfan intraperitoneal enjeksiyonları kullanılarak gerçekleştirilir. Ayrıca, miyeloablatif ışınlama toksik yan etkilere sahip olabilir ve alıcı farelerin hayatta kalması için donör hücrelerin başarılı bir şekilde aşılanmasını gerektirir. Buna karşılık, bu dozları kullanan busulfan koşullandırması genellikle iyi tolere edilir ve fareler donör hücre desteği olmadan hayatta kalır. Donör BM hücreleri, her yerde yeşil floresan proteini (GFP) eksprese eden farelerin femurlarından ve tibialarından izole edilir ve şartlandırılmış alıcı farelerin lateral kuyruk venine enjekte edilir. BM kimerizmi, BMT'yi takiben periferik kandaki GFP + hücrelerinin sayısının ölçülmesiyle tahmin edilir. Kimerizm seviyeleri >% 80 tipik olarak nakilden 3-4 hafta sonra periferik kanda gözlenir ve en az 1 yıl boyunca yerleşik kalır. Işınlamada olduğu gibi, busulfan ve BMT ile koşullandırma, özellikle nörodejenerasyonun fare modellerinde, merkezi sinir sistemi (CNS) içinde donör BM'den türetilmiş hücrelerin birikmesine izin verir. Bu busulfan aracılı CNS birikimi, toplam vücut ışınlamasından daha fizyolojik olabilir, çünkü busulfan tedavisi daha az toksiktir ve CNS iltihabı daha az kapsamlı görünmektedir. Bu hücrelerin, CNS'ye terapötikler sağlamak için genetik olarak tasarlanabileceğini varsayıyoruz.

Giriş

Son zamanlarda, merkezi sinir sistemindeki (MSS) mikroglia ve kemik iliği (BM) kaynaklı hücrelerin (BMDC'ler) rollerine hem hastalık sırasında hem de normal yaşlanma ile ilgili önemli bir ilgi olmuştur. CNS'nin yerleşik bağışıklık hücreleri olan mikroglia'nın, embriyogenez¹ sırasında ilkel miyeloid progenitörlerin girişini takiben CNS'de geliştiği bilinmektedir. Mikroglia, miyelomonositik soylarının yönlerini yetişkin yaşamına kadar korur. Kanıtlar, BMDC'lerin mikroglial havuza katkısının sağlıklı yetişkin hayvanlarda minimum olduğunu gösterse de¹, BMDC'lerin çeşitli nörodejeneratif hastalıkların ilerlemesinde oynadığı rol belirsizliğini korumakt....

Protokol

NOT: Etik Beyanı: Bu protokol gözden ve Simon Fraser Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı (UACC; izin numaraları 1037K-1060K-12 ve 03) ve Hayvan Bakımı, NIH Kılavuzu için Kanada Konseyi ile uyumlu olduğunu Bakım ve Laboratuvar Hayvanları Kullanım ve AET Konsey Direktifi.

1. Özel Hususlar

NOT: Busulfan sitotoksik olduğunu. Kulp ve malzeme güvenlik bilgi formunda ve kurumsal kurallarına göre imha ediniz.

1. Bir laminar akış başlığı içinde aseptik tüm teknikleri yapın.
2. Bu tür bir çekme paketi, ve bunun otoklavlama gibi uygun bir ambalaj malzemesi içinde sararak kullanımdan önc....

Sonuçlar

60-100 mg verilmesi / busulfan kg genellikle iyi tolere edilir fareler tarafından. Ancak, hayvanlar tipik olarak yeme teşvik etmek ışınlanmış ayçiçeği tohumu gibi davranır ile takviye gerekebilir Klima fazı (~% 5-10) ve dolayısıyla diyet sırasında kilo. Periferik kanda>% 80 GFP + hücrelerinin kimerizmin ve BM Düzeyleri 60-100 mg / kg busulfan ⁷ kullanarak sürekli ulaşılabilir olmalıdır. Laboratuvarımız başarıyla periferik kan ve kemik iliğinde>% 80 GFP + hücreler ile 100'den fazla kimerik fareler ol.......

Tartışma

Busülfan condition kolaylıkla saptanabilen hematopoietik hücrelerin farelerde yüksek düzeyde BM kimerizmin üretimi sağlar. Bu koşullandırma ışınlama tesisleri için gerek kalmadan gerçekleştirilebilir. Üstelik, bu protokolde belirtilen busulfan dozlarda myelosupresyon iyi ışınlama miyeloablatif dozlarda neden toksik yan etkileri en aza indirerek, tolere edilir, ve böylece daha vardır, genç yaşlı, ya da hastalıklı farelerde BM şimerizmi üretmek için daha uygun bir teknik olabilir ışınlama miyeloablatif duyarlı. Busulfan i.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Busulfex	Otsuka Kanada İlaç A.Ş.	DIN 02240602	Kullanmadan hemen önce busulfanı steril PBS ile 3 mg / mL'ye seyreltin. Busulfan sitotoksiktir. MSDS'ye ve kurumsal yönergelere göre ele alın ve atın.
ACK Lizing Tampon Ömrü	Teknolojileri	A10492-01	Diğer lizis tamponu ikame edilebilir, ancak inkübasyon sürelerinin buna göre ayarlanması gerekebilir
Fetal Sığır Serumu Yaşam Teknolojileri		12483-020