Yöntem makalesi

İleri Genetik tanımak makrofajlar kullanılarak Ekranlar

9.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52556

⸱

12 Mart 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, New York Medical College

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

İleri genetik, hücre otonom bağışıklığına direnç için önemli olan hücre içi patojenlerdeki genleri tanımlamak için güçlü bir yaklaşımdır. Mevcut yaklaşım, bağışıklık kaçışı için önemli olan yeni Toxoplasma gondii genlerini tanımlamak için doğuştan gelen bağışıklık hücrelerini, özellikle makrofajları kullanır.

Özet

Toksoplazmozun etkeni olan toxoplasma gondii, zorunlu bir hücre içi protozoon patojendir. Parazit, hemen hemen her sıcak kanlı omurgalı hücre tipini istila eder ve çoğalır. Bir konak hücrenin parazit istilası sırasında, parazit, içinde çoğaldığı fagositozdan bağımsız olarak konak hücre zarından kaynaklanan bir parazitohoröz vakuol (PV) oluşturur. IFN'ye bağımlı doğuştan gelen ve hücre aracılı bağışıklık, enfeksiyonun nihai kontrolü için önemli olsa da, nötrofiller, monositler ve dendritik hücreler dahil olmak üzere doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, parazitin enfeksiyonun erken dönemlerinde sistemik yayılması için araçlar olarak da hizmet edebilir. Enfekte makrofajlarda aktivasyonu takiben uygunluk kusuru olan parazit mutantlarını, ancak naif makrofajlarda normal invazyon ve replikasyonu tanımlamak için ileri bir genetik ekranda, konakçı doğuştan gelen bağışıklık tepkisini, bu durumda makrofajları kullanan bir yaklaşım tanımlanmıştır. Böylece ekran, makrofaj aktivasyonunun etkilerine direnme yeteneklerinde belirli bir kusuru olan parazit mutantlarını izole eder. Makale, enfekte makrofajların aktivasyonunu takiben mutant parazitlerin iki geniş fenotipini tanımlamaktadır: parazit stazı ve parazit bozunması, genellikle amorf vakuollerde. Parazit mutantları daha sonra, hücre otonom bağışıklığının indüklenmiş aracılarına direnç için özellikle önemli olan sorumlu parazit genlerini tanımlamak için analiz edilir. Makale, teorik olarak, spesifik antimikrobiyal mediatörlere direnç için önemli olan parazit genlerini hedeflemek için değiştirilebilen ileri genetik ekran için genel bir yaklaşım sunmaktadır. Ayrıca, parazit mutantının duyarlı olduğu spesifik makrofaj antimikrobiyal mediatörlerini değerlendirmek için bir yaklaşımı da açıklar. Enfekte makrofajların aktivasyonu, kronik enfeksiyonu sürdüren taşizoitten bradisotit aşamasına parazit farklılaşmasını da teşvik edebilir. Bu nedenle, tanımlanan parazit geninin kronik enfeksiyon oluşumundaki önemini değerlendirmek için metodoloji sunulmuştur.

Giriş

Toxoplasma gondii (T. gondii) zorunlu hücre içi, protozoa patojendir. Bu toksoplazmozis etkeni, bağışıklık sistemi baskılanmış kişilerde bir sağlık tehlikesi olduğunu. Ayrıca Cryptosporidium ve Cyclospora dahil insanları enfekte diğer apicomplexan patojenlerin model sistemidir. Toksoplazmozis en yaygın parazit bradyzoite veya Ookist sahne ile kontamine yiyecek veya su yenmesi yoluyla elde edilir. Yemeye bağlı olarak bu aşamalar konakçı hücreler içinde replike ve sistematik olarak yaymaktadır parazitin tachyzoite aşamasına dönüştürün. T-hücreleri, IFN-γ ve daha az bir ölçüde, nitrik oksit 1-4'e, enfeksiyonun kontrol edilmesi için önemlidir, ancak takizoit bir bölümü olarak, hastalık yok etme yeteneğine sahip değildir doku kistlerinin içinde korunur bradyzoite aşamasına dönüştürmek Uzun ömürlü bir kronik enfeksiyon ile sonuçlanır. Aslında, hiçbir terapötik kronik kist s karşı etkili vardırHastalığın tage. Şiddetli toksoplazmozis birincil ve akut enfeksiyon hızla kopyalayan tachyzoite sahne özelliğine geri dönüştürme parazitin bradyzoite aşamasına nedeniyle kalıcı enfeksiyon reaktivasyonuna en sık olduğunu.

Doğuştan gelen bağışıklık yanıtının karşısında Erken yaşam parazit yeterli parazit numaralarını ulaşmak için, yanı sıra kronik enfeksiyon kurulmasını sağlamak için, uzak sitelere ulaşmak için izin önemlidir. T. gondii olasılıkla çoğaltmak ve enfeksiyon erken yaymak için onun yeteneğine katkıda konak savunma mekanizmaları ile mücadele stratejilerini gelişti. İlk olarak, T. gondii diğer hücre içi patojenlere 5-9 kıyasla konak hücrenin endositik ve ekzositik süreçler büyük ölçüde ayrılmış olan parazit işgali sırasında benzersiz bir PV oluşturur. Ayrıca, tüm başarılı hücre içi patojenler T. gibi gondii f hoşgörülü bir ortam yaratmak için konak hücreye değiştirirya da büyüme. Bu hücre aktivasyonunu 10-15 düzenleme için önemli olanlar da dahil olmak üzere, konakçı hücre transkripsiyon faktörlerinin değiştirerek yeniden programlama konakçı hücre gen ekspresyonunu içerir. ROP16 16-19 GRA15 20 GRA16 21 ve GRA24 22 tüm T ile enfekte olmuş konakçı hücrelerin kaskadlar transkripsiyon yanıtı düzenlemek ve hücre sinyal önemli olduğu gösterilmiştir gondii. Farklı fenotip ile parazit suşları arasındaki genetik haçlar kullanarak Son çalışmalar bağışıklıkla ilgili GTPases (IRGS) 16,19,23-26 kaçırma da dahil olmak üzere parazit genotip-bağımlı özellikleri altında yatan parazit genlerin belirlenmesi oldukça verimli olmuştur. Çok virulent Tip I genotip sıçangil IRGS kaçınmak için mekanizmalar geliştirmiştir ise farelerde, bağışıklıkla ilgili GTPazlar (IRGS) Tip II ve kontrol parazit III genotip için önemlidir. Ancak, parazit antimikrobiyal medya kaçmasına mekanizmaları gelişti olduğu da açıktırbu mekanizmaların bazıları IRGS ve buna ek olarak ları parazit genotipleri 27,28 boyunca muhafaza edilebilir. Buna ek olarak, çok az T. karşı hücre otonom bağışıklık kritik aracılarının hakkında bilinen İnsan toksoplazmozis sırasında gondii. Tachyzoite konukçu bağışıklık yanıtları ile tetiklenebilir dönüşüm bradyzoite için sırasında hücre otonom bağışıklık aracılarının direnç için önemli bir Parazit genler de hayatta kalmak için önemli olabilir. Örneğin, yüksek düzeyde nitrik oksit edilen enfekte olmuş makrofaj parazit kopyalanmasını bastırdığı, ancak, aynı zamanda kist üretimi 30-32 sonuçlanan dönüşüm bradyzoite için tachyzoite uyarabilir.

ToxoDB T. için fonksiyonel bir genomik veritabanı gondii o topluluk açıklamaları da dahil olmak üzere yayınlanmış ve yayınlanmamış genomik ölçekli veri dizisi parazit genomunun için bilgi ve erişim sağlanması açısından alan için kritik bir kaynak olarak işlev, gen exp ression ve proteomik verileri 33. Birçok Protozoal patojenlere benzer, genomun çoğunluğu potansiyel fonksiyonları içgörü sağlamak için gen homoloji dayalı hiçbir bilgi varsayımsal genlerin oluşur. Böylece, ileri genetik bağışıklık kaçırma, kist dönüşüm ve parazit patogenezinde yanı sıra farklı gelişim evreleri arasındaki dönüşüm için kritik diğer işlevler için önemli yeni parazit genleri tanımlamak için güçlü bir araçtır. Ileri genetik ek kuvveti bağışıklık kaçırma ve kist oluşumuna sahip patojenezindeki özgül görevler için önemli olan genler için bir parazit sorgulamak için göreceli olarak önyargılı bir yaklaşım olarak kullanılabilir olmasıdır. Mutasyon profil için yeni nesil dizileme son gelişmeler kimyasal ve sokma hem mutajenezin 34-37 kullanarak ileri genetik çalışmalar sorumlu parazit genlerin belirlenmesi için seçim yöntemi yaptık.

ntent "> Özellikle de dirençli kist aşamasında karşı aktif olabilir bu. Bu amaçla doğru, in vitro kemirgen parazite karşı hücre özerk bağışıklık mekanizmalarının etkinliğini artırmak için kullanılabilir T. gondii güvenlik açıklarını tespit etmek önemlidir makrofaj enfeksiyonu ve aktivasyon modeli, özellikle saf makrofajlarda edilen enfekte olmuş makrofaj aktivasyonu, ancak şu T. gondii, uygunluk olumsuz parazit mutasyonlara tanımlamak amacıyla geliştirilmiştir. Bu makrofaj ekran için T. gondii, sokma mutantlan bir kütüphane sorgulamak için kullanılmıştır, sonuçta nitrik oksit 27,28 direnç için önemli bir T. gondii, genlerin belirlenmesi. enfekte makrofajlar, nitrik oksit, özellikle belirgin bir duyarlılık aktivasyonuna bozulmuş dirençli T. gondii, mutantlarının bir panelinin izolasyon, tespit için ekranın yardımcı oldu direnç için önemli parazit genlerkemirgen IRGS 28 için açıklanan direnç mekanizmaları dışında diğer hücre özerk bağışıklığın arabulucular için. Araya sokulan mutajenez teorik olarak rastgele her paraziti klonu mutasyonlar ve mutasyon site daha kolay tanımlama sınırlı sayıda üretilmesi açısından kimyasal mutagenez fazla avantajlara sahiptir. Bununla birlikte, T plasmid ekleme genomik yerinin tanımlama gondii sokma mutantlan, uygulamada, bir çok durumda 37 şaşırtıcı bir şekilde zor olmuştur. Bir genin bir plasmid yerleştirilmesi aynı zamanda, tipik olarak, tek nükleotid değişiklikleri ile sonuçlanan kimyasal mutagenez aksine bir genin işlevini bozması muhtemeldir. Birden fazla tek nükleotid polimorfizmini oluşturur Ancak, kimyasal mutagenez, N-etil-N-nitroso üre (TRK) ya da etilmetan sülfonat (EMS) ya sahip (araya sokulan mutajenez ile karşılaştırıldığında, parazit genomunun büyük bir kısmının, daha yüksek bir yetenek sunabilir mutant 34 başına 10 -100) tahmin, 38. Ayrıca, tüm genom profili son gelişmeler mümkün mutasyona uğramış bir parazitin 34,38 tanımlanmış fenotip sorumlu en olası aday genleri tanımlamak için yeni nesil sıralama kullanmaya yaptı. Ne olursa olsun mutagenez yaklaşımı, makrofaj aktivasyonu direnç parazit geninin rolü onay sonuçta moleküler Koch önermeleri yerine getirmek için gen silme ve tamamlanmasını gerektirir.

parazit ve makrofaj hem genetik manipülasyonu vasıtasıyla bir genin işlevini incelemek yeteneği T. ileri genetik ile tanımlanan genlerin çoğu önemlidir gondii, hem de diğer patojenler halen bilinen fonksiyonlar ile başka proteinler için bir dizi homolojisi için çok az varsayımsal genler olarak karakterize edilir. Bu yazı, bir mutant içinde kesintiye uğramış gen, bir bilinen ya da direnç için önemli olup olmadığını tespit etmek için kullanılabilir, genel bir yaklaşımın ana hatlarıHücre özerk dokunulmazlık bilinmeyen aracısı. Ev sahibi antimikrobik faktörler ilk analiz, vahşi tip ve uyarılabilir nitrik oksit sintaz (iNOS), gp-91 pHOx (NADPH oksidaz) özel gen silme olanlara karşı vahşi tip farelerden makrofajlar mutant parazitlerin yaşam değerlendirilerek yapılır ve Belirli bağışıklıkla ilgili GTPases (IRGS). Belirlenen parazit genler nitrik oksit, reaktif oksijen ara veya bağışıklıkla ilgili GTPases 28 sırasıyla veya bilinmeyen bağışıklık mekanizması dahil olup olmadığını direnç için önemli olmadığını gösterecektir. Mevcut protokolde tarif edildiği, IFN-γ ve LPS, her iki ile enfekte makrofajlar, aktivasyonu, öncelikle nitrik oksidin 28 direnç için önemli parazit genin izolasyonu ile sonuçlanır. makrofaj aktivasyonunun yokluğunda nitrik oksit neden farmakolojik ajan (nitrik oksit donörleri) tarafından tanımlanan genlerin çoğu yeniden önemli olduğunu gösterdinitrik oksit yerine makrofaj aktivasyonu 28 ile ilişkili ek arabulucular ile uyum içinde nitrik oksit direncin.

Bir ve iki in vitro enfekte olmuş kemik iliğinden türetilmiş makrofaj aktivasyonu takiben spor defektli parazit mutantlarını izole etmek için tasarlanmış bir ön genetik ekran tarif Adım. Bir parazit, çoğaltma azaltır, ancak tam olarak vahşi tip T replikasyonunu inhibe etmez makrofaj aktivasyonu için kullanımı deneysel olarak IFN-γ ve LPS'nin dozu belirlemek için bir doz titrasyon analizi tarif Adım Parazit mutantların kütüphanenin oluşturulması için kullanılan gondii ebeveyn suşu. İkinci adım 96 oyuklu plakalar içinde makrofajlar mutant klonların ileri genetik ekran tarif etmektedir. Üçüncü adım, her mutant kusur parazit yaşam etkileyip etkilemediğini, çoğaltma değerlendirmek ve 96 gözlü levhalar bir taramada tespit edilen her bir mutantın fenotipi teyit etmek için bir yaklaşım anahatlarımakrofaj aktivasyonuna karşılık olarak ya da kist üretimi. Dördüncü adım, parazit mutan özellikle hassas olan bağışıklık mediatörleri tanımlamak üzere, belirli antimikrobiyal yollarındaki delesyonu olan farelerin kemik iliği türevli makrofajlar kullanımını tarif eder. Adım beş enfekte farelerin beyinlerinde kist üretiminin tarafından değerlendirilir gibi bir parazit mutant da in vivo patogenezinde tehlikeye olup olmadığını belirlemek için bir yaklaşım özetlemektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Hayvanların kullanımını içeren tüm protokoller New York Medical College Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapıldı.
NOT: seyreltme 38, fare kemik iliği kökenli makrofajlar 39 izolasyonunu, T. büyümesini sınırlayıcı kimyasal mutagenez 38, parazitlerin izolasyonu için Ayrıntılı protokoller İnsan sünnet derisi fibroblast gondii (HFF) makrofajlar hücreler ve kist üretim ve temel immünoflüoresans analizi (IFA) 32 başvurulur. (% 10 fetal dana serumu, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Yüksek Glikoz Kartal Ortamı) D10 ortam içinde% 5 CO2 içinde 37 ° C 'de, tüm hücre kültünü gerçekleştirmek . Hücre izolasyonların ve hücre kültürü boyunca steril tüm reaktifleri tutun.

IFN-γ ve Concentr belirlemek için LPS 1. doz titrasyonuations İleri Genetik Ekran için infekte makrofajların aktivasyonu için kullanın

  1. Kültür fare kemik iliğinden türetilmiş makrofajlar O / N bölme başına D10 ortam 250 ul içinde 3 x 10 5 hücre / ml'lik bir konsantrasyonda, sekiz bölme cam slaytlar. Kemik iliğinden izole sonra makrofajlar iki hafta birini kullanın.
    NOT: Oda slaytlar arttırıcı RS yıkama bir büyüme var satın alınır.
  2. Bir T25 doku kültürü şişesi içinde yetiştirilen insan sünnet derisi fibroblast (HFF) hücrelerinden elde edilen yabani tip parazitler saymak için bir hemasitometre kullanarak. D10 ortam içinde, ml başına 5 x 10 5 vahşi tip parazitler bir konsantrasyonda yeniden süspanse parazitleri. Makrofajlar O / N çoğaldı gibi 1: Bu konsantrasyon yaklaşık 1 enfeksiyon çokluğunda neden olur. Polipropilen parazit sopa gibi parazitler ile tüm manipülasyonlar için polistiren ya da PET tüpleri kullanın.
  3. Odacık slaytlar D10 ortamları çıkarın ve 250 ul ile değiştirinvahşi tip parazitlerin süspansiyon. Yavaşça her odanın iç yüzü aşağıya bakacak şekilde akmasına olanak sağlayarak sürgünün her bölmeye parazit süspansiyonu ekleyin. Makrofajlar protokol sırasında herhangi bir noktada kurumasına izin vermeyin.
  4. 4 saat boyunca% 5 CO 2 37 ° C'de bir kuluçka odası slayt kapağı ve yer ile parazit ile enfekte Kapak odası slaytlar istila ve bir PV kurmak parazit için zaman tanımak için.
  5. Doz titrasyon için steril tüplerde D10 ortam 1 ml LPS ve IFN-γ-yonunun seyreltileri yapmak. Doz için titrasyonlar LPS ya da IFN-y konsantrasyonu sabit ya da tutmak için diğer uyarıcı 40 değişir.
    1. Örneğin, mi başına 10 ng LPS LPS sabit tutmak ve IFN-γ (0, 1 ünite / mi, 10 birim / ml, 100 birim / ml, 1000 birim / ml) konsantrasyonu değişebilir. IFN-y mi, 100 birim / sabit γ ve LPS (0, 0.1 ng / ml, 1 ng / ml, 10 ng / ml, 100 ng / ml) konsantrasyonu değişebilir tutun. 2 dakika olmadan için kısaca sonikat LPS stokseyreltme öncesinde bir banyo sonikatör (değil bir ucu sonikatör) ısıtma.
      Not: Sonikasyon hücreleri barındırmak için uygun şekilde bağlanan olmayabilir LPS tarafından oluşturulan misel agrega bozmak için tavsiye edilir.
  6. 4 saat odası slayt parazitler ve yapışık makrofajlar arasındaki ko-kültür başladıktan sonra, her odasında D10 ortamı atmak ve D10 medyada IFN γ ve LPS uygun dilüsyonlarının 300 ul ile değiştirin. Makrofaj aktivasyon üstü yokluğunda, parazit çoğaltma değerlendirmek için tek D10 ortamı ile bir kontrol içerir.
  7. 24-30 ilave saat boyunca% 5 CO2 içinde 37 ° C'de bir kuluçka makinesi içinde oda slayt kapak ve yer ile yeniden kapak bölme kayar.
    NOT: İnkübasyon süresi parazit gerginlik bağlı olarak 6-12 saat arasında değişebilir vahşi tip parazit ırkının iki katına süresine bağlıdır. Bir zaman noktası Naif makrofajlar erimesini asalak önce seçilir ama yeterince uzun, en az 3-4 dou etkinleştirmek içinBling süreleri.
  8. Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde bir% 2.5 formaldehid çözeltisi olun. Slaytı ortamı atılır ve% 2.5 formaldehid çözeltisi 300 ul ile değiştirin. Oda sıcaklığında 20 dakika için düzeltildi.
  9. Iki odasının başına PBS 300 ul ile durulayın slayt (ler). Her durulama için, slayt PBS atmak ve slayt yapıştırılır makrofajlan bozmamak için her slayt odasının iç yüzü aşağı yavaşça yeni PBS ekleyin. Boyamadan önce kurumasını slaytlar önlemek için hazne slaytta odası ve yer kapağının başına PBS 300 ul ekleyin.
    Not: Slaytlar boyamadan önce, bu noktada 3 gün 4 ° C'de yerleştirilebilir.
  10. T. boyama protokolü mikroskobik (IFA) tarafından gondii algılama.
    1. PBS içinde% 0.2 Triton X-100 çözeltisi (permeabilizasyon tamponu) olun. Triton X-100 çözeltisi içine hareket etmesini sağlamak için 37 ° C su banyosu ve kısa bir süre için girdap bunun bir tüp içinde çözelti yerleştirin. IskartaPBS odası slaytlar ve permeabilizasyon tamponu 300 ul ile değiştirin. 30 dakika için oda sıcaklığında bırakın.
    2. PBS (engelleme çözeltisi) içinde% 10 keçi serumu ihtiva eden bir çözelti yapmak. Slayt permeabilizasyon tampon atın ve odasına başına çözüm engelleme 300 ul ile değiştirin. 30 dakika için oda sıcaklığında bırakın.
      Not: fetal buzağı serumu, tüm boyama protokollerinde keçi serumu ile ikame edilebilir.
    3. T., flüoresan-konjuge antikor 1000 seyreltme: bir aşamalı İFA boyama protokolü, bir 1 yapmak çözümü engelleme gondi. Slayt engelleme çözüm çıkarın ve odasına başına antikor çözeltisi 150 ul ekleyin. Kurumasını önlemek için hücrelerin slaytı üzerinde kapak slayt değiştirin. Oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.
      Not: Antikor konsantrasyonu deneysel kaynağına bağlı olarak belirlenmelidir. Antikor doğrudan bir florokrom konjuge veya kullanıcı tarafından bir florokrom konjuge satın alınan edilir.
      1. Iki aşamalı bir İFA boyama içinT. bir konjuge olmayan bir antikor ile protokol Toxoplasma gondii ve floresan konjuge sekonder antikor, T. karşı konjüge edilmemiş birincil antikor, 150 ul leke slaytlar oda sıcaklığında 1 saat süre ile blokaj tamponu içinde gondii vardır. 300 PBS ul artı% 1 keçi serumu (yıkama tamponu) ile 3x durulayın.
      2. Birincil antikor için kökenli türleri için özel floresan-konjuge sekonder antikor, 150 ul ekle. Kurumasını önlemek için hücrelerin slaytı üzerinde kapak slayt değiştirin. Oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.
    4. Durulayın slaytlar PBS artı% 1 keçi serumu (yıkama tamponu) ile 3x. Her durulama için, onun içeriğini boşaltarak odası slaytlar çözüm kaldırmak ve yıkama tamponu 300 ul ile değiştirin.
    5. Durulayın slaytlar PBS 300 ul 2x.
    6. Üreticinin talimatlarına göre bölme slayt odasına çıkarın.
    7. Montaj DAPI içeren ortam montajı (4'6-diamidino-2-fenil slaytlarindol, dilactate) ve 22 mm x 50 mm örtücü kısım.
  11. Faz kontrast ve floresan mikroskobu kullanarak slaytları inceleyin. Iyi odasının başına 100 PV'lerinin az inceleyerek vakuol başına parazitlerin ortalama sayısını belirler. ekran için IFN γ ve LPS seçilen doz, vahşi tip parazit (Şekil 1) çoğaltma bastırmak için yeterli olması gerekir, ama engel değil.

Enfekte Makrofagların Spor Hata ardından Aktivasyon ile Parazit Mutantlarının 2. izolasyonu

NOT: rastgele T. bir kütüphane gondii mutantlar ileri genetik ekran için gereklidir. T. rastgele mutajenezi gondii kimyasal (TRK / EMS) veya araya sokulan mutajenez 27,28,38 tarafından gerçekleştirilebilir. Sınırlayıcı seyreltme ve D10 ortam 32,38 200 ul bir hacim içinde yapışık HFF hücreleri ihtiva eden 96 oyuklu plakalar içinde tek tek klonlar büyümesi mutagenez, klon parazitler et.Bu mikroskop ile makrofajlarda parazit elenmesi için 96-yuvalı plakalar mikroskopik olarak elenmesini sağlamak için optik taban sahip olması kritiktir. Tarama için Faz kontrast ve floresan mikroskobu, 96 gözlü levhalar faz kontrast 4, 10, 20 ya da uzun bir çalışma mesafesi için donatılmış 40X objektif bir ters flüoresan mikroskop gerektirir boyandı. Bir 4X objektif tüm çok iyi görülebilen, ancak parazitlerin iyi çözünürlük 20X objektif ile elde edilir için yararlıdır.

  1. Ikiye 96 oyuklu doku kültür plakaları içinde birleşik HFF hücreleri içinde büyür tachyzoite mutantlarının başına 50 ul D10 ortam 100 ul (1-2 hafta yalıtılmasından sonra) fare kemik iliğinden türetilmiş makrofajlar içeren 96 gözlü levhalar çoğaltırlar.
    Not: her bir her transfer parazit sayısını zorunda kalmamak için, parazit kültür hacmine göre parazit 96 oyuklu plakalar içinde başlangıç ​​ekranını yapın. Bu nedenle, 2.6 mikroskopi analizi wheth üzerinde nitel dayanırer parazitler genellikle çoğaltılmış çoğaltılmış veya değil. Adım 3 makrofajları enfekte vahşi tip veya mutant parazitlerin eşit sayıda kullanılarak oda slaytlar mutantların fenotipi teyit etmek için bir yaklaşımı tarif eder.
    1. Doğrudan de her zaten D10 medya parazitleri ekleyin. Parazit çoğalması için bir pozitif kontrol olarak yabani tip takizoit iki kuyu Infect.
  2. Parazitler hücreleri istila ve PV oluşturmak için zaman tanımak için 4 saat boyunca bir inkübatör (37 ° C ve% 5 CO 2) içine enfekte hücreleri yerleştirin.
  3. Plaka içeriğini boşaltarak bir plaka ortamı çıkarın. Parazitler için bir deterjan cidal içeren bir ıskarta havzası içine plaka ortamı dökümü bilek tek kapağı kullanın.
    1. Medya ve bir çok kanallı pipet için steril bir havzayı kullanarak "makrofaj aktivasyon medya" 100 ul ekleyin. For Kademe 1 de tespit edilen optimal LPS konsantrasyonu ve IFN-γ kullanınrophage aktivasyon medya. Benzer şekilde yinelenen kontrol plaka ortamı çıkarın ve D10 medya 100 ul ile değiştirin.
  4. Ek 24-30 saat için bir kuluçka makinesi (2, 37 ° C ve% 5 CO) içine enfekte hücreleri yerleştirin.
  5. IFA için 96-yuvalı plakalar için boyama protokolü.
    1. Plaka ortamı atılır ve PBS içinde% 2.5 Formaldehit 100 ul ile değiştirin. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. Formaldehid ve çok kanallı bir pipet için steril bir havza kullanın.
    2. Plaka formaldehit çözüm atın ve plaka formaldehit durulama 100 ul PBS ekleyin.
    3. Plaka çözümü atın ve her kuyuya (% 0.2 Triton X-100 ile PBS) permeabilizasyon tamponu 100 ul ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir.
    4. Plaka çözümü atın ve her kuyuya (% 10 keçi serumu ile PBS) çözümü engelleme 100 ul ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir.
    5. P çözüm atınGeç. Ekleme / oyuk bir floresan-konjuge anti-T, 50 ul gondii antikorunun sulandırılmış 1: 1000 artı% 1 keçi serumu. Ve bir rocker plaka kapağı ile oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.
      1. Alternatif olarak T karşı bir konjüge edilmemiş birincil antikor kullanımı gondii 1.10.3.1 tarif edildiği gibi bir floresan-konjuge sekonder antikor ile boyanarak, ardından.
    6. Plaka antikor çözeltisi atılır ve 100 ul / göz PBS artı% 1 keçi serumu ile değiştirin. Yalnız PBS ile 2 ek durular ardından bu durulama 3x gerçekleştirin. Her çukurdaki PBS içinde 200 ul boş ve kurutma kuyu önlemek için 96 oyuklu bir plaka üzerinde kapağı yerine takın.
      Not: parafilm sarılmış ve mikroskopi ile analizden önce 3 güne kadar 4 ° C 'de yerleştirilebilir kapaklı plaka.
  6. Bir 20-40X objektif kullanarak bir ters flüoresan mikroskop altında hücre inceleyin. Na & çoğaltmak Seç mutantlar# 239; makrofaj plaka ettik ama ağırlıklı olarak "aktif makrofajlar" bir parazit / vaküole ötesine çoğaltmak için başarısız veya amorf veya "aktive makrofajlar" parçalanır görünür.
    Not: vakuol başına vahşi tip parazit sayısı, ideal IFN-γ ve kullanılan LPS'nin dozu bağlı olacaksa da vakuol başına yaklaşık 4 parazitler olduğu; büyüme bastırma ancak aktivasyon uyaran çoğaltma tam inhibe yansıtan bir sayı.

Hata Enfekte Makrofagların Aktivasyonu takiben Parazit Survival Düzeyi veya çoğaltma de ise 3. belirleme Mutantlarına değerlendirin

  1. Aktarım HFF hücreleri ihtiva eden T25s 96 oyuklu plakalar (gözün tamamının içeriği) arasından parazit mutantlar seçilir ve çoğalmasını sağlar.
  2. Kültür, kemik iliği türevli makrofajlar O / N D10 ortamı 250 ul içinde 3 x 10 5 hücre / ml'lik bir konsantrasyonda 8 bölme cam slaytlar. Pa karşılaştırmak için bir slayt hazırlayınnaif makrofajlar rasite çoğaltma ve ek slayt enfekte makrofajların aktivasyonu takip parazit çoğaltma karşılaştırmak için.
  3. Hasat tachyzoite parazitleri ve hemositometrede saymak. 5 × 10 4 T. ekle gondii de 4 saat süre ile D10 ortam ve kültürde makrofajların ihtiva eden bir bölmeye parazitleri. Bir kontrol olarak yabani tip ebeveyn parazitler ile bir kuyu ekleyin. Naif makrofajlarda parazitlerin çoğaltma izlemek için aktivasyon ortamı almayacaksınız, aynı parazit klon ile aynı çoğaltmak slayt aşılamak.
  4. Suret odası slaytlar 1 D10 medya atın ve "aktivasyon medya" 250 ul ile değiştirin. Diğer çoğaltmak odası slayt D10 medya atın ve D10 medya 250 ul ile değiştirin. Üzerine odası slayt kapağı ile "aktif" ve "naif" makrofaj slayt hem kuluçkaya bir Additi için 37 ° C ve% 5 CO 2 deÖnal 24-30 saat.
  5. Aşama 1 'de tarif edildiği gibi dokunulmamış odalı IFA boyama gerçekleştirme saptamak Permeabilize ve İFA boyama ve parazitlerin analizi için blok kayar.
    1. T. membran bağlantılı 1 (LAMP1) veya Lysotracker ve antikor lızozomal için bir antikor ile eş leke hücreleri enfekte makrofajlar aktivasyon lizozomlarında (Şekil 4) ile mutant PV'lerinin füzyon tetikliyor olup olmadığını gondii değerlendirmek için.
    2. Erken makrofaj aktivasyonu 28 Aşağıdaki belirgindir parazit mutant değişiklikleri tespit etmek IFA boyama parazit / PV içinde belirli bölme / organellere antikorları kullanın.
      NOT: Bu tür değişiklikler makrofaj aktivasyonu aşağıdaki mutant eksik yaşam / çoğaltma temelini mekanizması içgörü sağlayabilir.
  6. Bir 100X faz petrol objektif ve floresan mikroskobu kullanarak slaytları inceleyin.
    1. Belirleyerek parazit çoğaltma değerlendirin100 rastgele vakuollerde PV başına parazit sayısı. İstatistiksel analiz için, 100 hücre arası boşlukların her birinin en az 2 sayısını yapın.
    2. Genel Her iki floresan analizi kullanılarak parazit morfolojisi yanı sıra faz kontrast mikroskobu değerlendirin. Faz 100x hedefi altında Görünüm parazitleri. Sağlıklı parazitler parazitler sıkıca yakın oturan parasitophorous vacuole'nin içinde kapalı olması. Faz yoğun jantlar veya amorf parazitler ile amorf geniş vakuoller sahip Parazitler parazit ölüm yerine çoğaltma sadece bir kusur (Şekil 1 ve 3) öneririz.

4. Enfekte Makrofagların aktivasyonu Mutant Parazitler Duyarlılık bilinen anti-mikrobiyal Mediyatörlere ile ilişkili olup olmadığını değerlendirin

  1. - / -, Gp91-pHOx - vahşi tip C57 / BL6 farelerinde gelen iNOS, kemik iliği türevli makrofajlar izole / - veya Irgm1 / Irgm3 - / - fareler 32.
  2. Kültür, ilgili kemik iliği kaynaklı macrophages O / D10 ortamı 250 ul içinde 3 x 10 5 hücre / ml'lik bir konsantrasyonda 8 bölme cam slaytlar N.
  3. Aşama 3'te tarif edildiği gibi, parazit mücadelesi IFA boyama ve analizi ile devam edin.
  4. Hayatta ve enfekte makrofajlar aktivasyonunu aşağıdaki çoğaltmak mutant parazitlerin yeteneği GTPases 28 ile ilgili reaktif oksijen veya nitrojen türlerinin ya da belirli bağışıklığın yokluğunda restore olup olmadığını belirleyin.
  5. Spesifik anti-mikrobiyal arabulucular sadece makrofajlar aktivasyon 28 diğer arabulucular ile uyum içinde hareket halinde HFF hücreleri veya naif makrofajlar mutant parazitleri zarar veya kendileri tarafından yeterli olup olmadığını değerlendirmek için, nitrik oksit vericisi olarak farmakolojik ajanlar, kullanın.

5. Değerlendirin Mutant Parazit Bozukluklarını Kronik Enfeksiyon Defekt olsun

  1. T25s co yetişen yabani türü, mutant veya hedeflenen gen silinmiş parazitler takizoit YalıtmakHFF hücrelerinin ntaining. Parazitler taze HFF kültürleri lize gerekir.
  2. Hemasitometre kullanarak parazitleri sayın. Intraperitonal (IP) enjeksiyon ile 200 ul içinde verilen bir parazit subletal doz mi uygun başına bir konsantrasyonda Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içinde yeniden süspanse parazitleri.
  3. 200 ul hacmi intraperitoneal (İP) ile parazitleri enjekte etmek için 1 ml tüberkülin şırınga ve 25 G iğne kullanın. Doz parazit yabani tip suşu fare genotipine bağlıdır.
    NOT: parazitin Tip I genotipleri ne olursa olsun parazit doz enfeksiyonun akut aşamasında farelere öldürücü ve T. kemoterapi yokluğunda kronik enfeksiyon çalışmalar için uygun değildir gondii paraziti çoğaltma bastırmak için.
  4. Otuz gün parazit mücadeleden sonra, standart bir boyut Fare kafesi, en fazla 5 m içerebilir (bir uncrowded odası içinde bir basınçlı tanktan CO2 inhalasyonu ile fareler kurbanBuz, sonra servikal dislokasyon).
  5. Kurulan prosedürleri 41-43 kullanılarak fare beyni izole edin.
    1. Ön tarafta fare yatırın. Alan sterilize etmek için% 70 etanol ile baş püskürtün.
    2. Beyin sapı kesmek için keskin bir makas kullanın. Daha sonra sığ bir sağ etrafında yanal kesme ve beyin sapı tabanından başlayarak kafatasının sol tarafında yapmak için diseksiyon makas kullanın. Yavaşça beyin maruz kafatasını geri soyma için forseps kullanın.
    3. Yavaşça beyin özgür koku siniri kesmek için kafatası beyin ve tabanı arasındaki beyin ve yer makas kaldırın. Steril forseps veya steril PBS 10 ml içeren bir bakteriyolojik Petri plaka bir spatula ve yeri ile beyin kaldırın.
  6. Sağ ve sol hemisfer arasında merkezi aracılığıyla steril bir bisturi ile yarısında beyin kesin.
  7. 1 ml PBS ihtiva eden küçük bir harç beyin yarısı ekleyin. Için havan kullanınGeniş delik 20-200 ul pipet geçebileceği beynin ince bir doku süspansiyon yapmak.
    NOT: Doku kesitleri histopatolojik için gerekirse beynin diğer yarısı 1 saat% 2.5 formaldehit sabit olmalıdır.
  8. 1.7 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, beyin lisatı, 100 ul koyun. Boyama için beyin süspansiyonu düzeltmek için beyin lizatını içeren tüpe PBS içinde% 2.5 formaldehit 1 ml ekleyin. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  9. Bir mikrosantrifüjde 5 dakika boyunca 8000 x g'de lizat santrifüj ve dikkatli bir şekilde süpernatant atılır.
  10. Lizat (% 10 keçi serumu, PBS içinde% 0.2 Triton X-100) ile geçirimli hale / Bloke edici tamponun 1 ml ilave edilir. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  11. Santrifüj 5 dakika boyunca 8.000 xg'de lizat ve süpernatant kaldırmak.
  12. FITC-konjüge Dolichos biflorus agglutin (DBA) 200 ul ekle. PBS içinde lektin artı% 10 keçi serumu, 100 seyreltme: 1 kullanın. Yavaşça pipetleme lizat tekrar süspansiyon. Kuluçkaya yatmakoda sıcaklığında 1 saat karıştırıldı.
    Not: DBA parazit kist duvar CST1 bağlanan bir liganddır.
  13. Santrifüj 5 dakika boyunca 8.000 xg'de lizat ve süpernatant atın. Pelet PBS 1 ml ilave edilir. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. PBS yıkama 3x tekrarlayın. Bir pipet kullanarak nihai yıkama aşağıdaki süpernatantı.
  14. Bir mikroskop lamı üzerine lekeli beyin lisatından ve yerin 5 ul hazırlamak için geniş bir delik 20-200 ul pipet kullanın. Beyin lizat ıslak montaj oluşturmak için 25 x 25 mm kapak kayma ile slayt monte edin. Beynin 5 ul her lizata kullanarak 3 suret slaytlar olun.
  15. 10X objektif (Şekil 6) kullanarak floresan mikroskobu ile her 5 ul aliko başına kist sayısını.
    NOT: Bazı kistler bazı (kist başına 1-2 parazitler) çok küçük ise büyük (8 veya daha fazla parazit yaklaşık) vardır. Küçük kistlerin sayısı karşısında büyük her slayt ama belge sayısı başına kist toplam sayısını sayın.
  16. Kistler det sayısını ekleyansıtılmaktadır (sadece beynin yarım lizatından haline getirilmiştir), toplam seyreltme faktörü x 2 ile üç farklı 5 ul hacimde ve çarpma beyin başına toplam kistlerin sayısını tahmin etmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Toxoplasma gondii naif makrofajlar serbestçe çoğaltır ve 6-12 saat parazit suşu bağlı arasında iki katına zaman vardır. 1 aktif kemik iliği kökenli makrofajlar karşı naif temsilcisi parazitleri göstermektedir. Şekil 2 HFF parazitlerin genel morfolojisi gösterir 2, 4, 8, 16 ve 32 parazitler / PV hücreler ev sahipliği. Mevcut protokolde, parazit naif makrofajlar istila ve enfekte makrofajlar için güçlü aktivasyon uyaran, LPS ve IFN-teslim öncesinde doğmakta parasitophorus çarpıtm...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Açıklanan protokol fare kemik iliğinden türetilmiş makrofajlar ve T. izole etmek için ileri genetik aktivasyonunu kullanan olmayan bir önyargılı bir yaklaşım sağlar yeteneklerini bir kusur ile gondii mutantlar enfekte makrofajlar aktivasyonunu hayatta kalmak için. mutantlar aşağıdaki makrofaj aktivasyon fenotip tipik iki geniş kategorilerden birine girer: 1) parazitler sağlam görünen, fakat PV başına 1 parazitin ötesine çoğaltmak için başarısız; 2) parazitler bozulmuş görünür ve ferah, amorf PV'ler...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların birbiriyle rekabet eden hiçbir mali çıkarı yoktur.

Teşekkürler

T. gondii mitokondrisini tespit eden antikor için Dr. Peter Bradley'e özel teşekkürler. Çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü Hibe AI072028 tarafından desteklendi ve DGM'ye AI107431 ve tropikal tıp çalışmaları için New York Tıp Koleji'ne cömert bir bağışta bulundu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DMEMHiklonSH3008101https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Kimlik=29101& productId=3255471& DIS
Türü=0& highlightProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& searchType=
ÜRÜN& hasPromo=0
Hyclone FBSTermoSH3091003https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Kimlik=29104& productId=11737973& DIS
Türü=0& highlightProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& searchType=
ÜRÜN& hasPromo=0
Hidroklon DPBSTermoSH3002802 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Kimlik=29104& productId=2434305& DIS
Türü=0& highlightProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& searchType
=PROD& hasPromo=0
Hidroklon L-glutaminTermoSH3003401 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Kimlik=29104& productId=3311957& DIS
Türü=0& highlightProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& searchType
=PROD& hasPromo=0
Hyclone Pen strepThermo SV30010 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=1309668
6& catalogId=29104& matchedCat
No=SV30010& fromSearch=1&
searchKey=SV30010& highlightPro
ductsItemsFlag=Y& endecaSearch
Query=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3DSV30010%2B%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D& xrefPartType=Kimden& tasarruf= 0.0& xrefEvent=1407777949003_0
& searchType=PROD& hasPromo=0
Hyclone Hanks BSSTermoSH3003002https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Kimlik=29104& productId=3064595& DIS
Türü=0& highlightProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& searchType=
ÜRÜN& hasPromo=0
LPSLİSTESİ biyolojikler201http://www.listlabs.com/products-tech.php?cat_id=4&product_id=81&keywords
=LPS_from_%3Cem%3EEscherichia_coli%3C/em%3E_O111:B4
IFN-γPepro Tech Inc50-813-664https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?itemdetail='item'&storeId=10652&
productId=2988494& catalogId=29
104& matchedCatNo=50813664&
fromSearch=1& searchKey=murine+ifn+pepro+tech& highlightProductsItemsFlag
=Y& endecaSearchQuery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3Dmurine%2Bifn%2Bpepro%2Btech%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D& xrefPartType=Kimden& tasarruf
=0,0& xrefEvent=1407778210608_
12& searchType=PROD& hasPromo
=0
Oda slaytlarıThermo177402https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Kimlik=29104& productId=2164545& DIS
Türü=0& highlightProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& searchType=
ÜRÜN& hasPromo=0
96 kuyulu optik plakalarThermo165306https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Kimlik=29104& productId=3010670& DIS
Türü=0& highlightProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& searchType=
ÜRÜN& hasPromo=0
96 oyuklu doku kültürü plakalarıFisher353072https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Kimlik=29104& productId=3158736& DIS
Türü=0& highlightProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& searchType=
ÜRÜN& hasPromo=0
Doku kültürü flast T25Fisher156367https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=127039
67& catalogId=29104& matchedCat
No=12565351& fromSearch=1&
searchKey=156367& highlightProdu
ctsItemsFlag=Y& endecaSearchQu
ery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3D156367%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D& xrefPartType=Kimden& tasarruf
=0,0& xrefEvent=1407778974800_
0& searchType=PROD& hasPromo
=0
Ted Pella EM sınıfı formaldehitTed Pella18505http://www.tedpella.com/chemical_html/chem3.htm#anchor267712
Triton X-100FisherBP151https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Kimlik=29104& productId=3425922& DIS
Türü=0& highlightProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& searchType=
ÜRÜN& hasPromo=1
Alexa 488 - protein konjugasyon kitiYaşam TeknolojileriA20181http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A10235
keçi serumuMP BiyomedikalICN19135680https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Kimlik=29104& productId=2133236& DIS
Türü=0& highlightProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& crossRefData
=ICN19135680=2& searchType
=PROD& hasPromo=0
Vectashield montaj ortamıVector LabsH1200https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=428
FITC ile konjuge dolichosVector LabsFL-1031https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=188
LAMP1'e karşı AntikorGelişimsel Çalışmalar Hybridoma Bankhttp://dshb.biology.uiowa.edu/LAMP-1
LysoTrackerLife TeknolojilerL-7526https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L7526?ICID=search-product
C57BL6 farelerJackson Laboratuvarları664http://jaxmice.jax.org/strain/000664.html
gp91 phox nakavt farelerJackson Labaoratories2365http://jaxmice.jax.org/strain/002365.html
iNOS nakavt fareleriJackson Laboratuvarları2609http://jaxmice.jax.org/strain/002609.html
sodyum nitroprussidACROS OrganicsAC21164-0250 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Kimlik=29104& productId=2627727& DIS
Türü=0& highlightProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& searchType=
ÜRÜN& hasPromo=1
DETA NONOateACROS OrganicsAC32865-0250https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Kimlik=29104& productId=2252389& DIS
Türü=0& highlightProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& searchType=
ÜRÜN& hasPromosyon=1
Monoklonal fare anti-Toxoplasma gondii AbFitzgerald Industries International10T19Ahttp://1degreebio.org/reagents/product/1069274/?qid=652947

Kaynaklar

  1. Scharton-Kersten, T. M., Yap, G., Magram, J., Sher, A. Inducible nitric oxide is essential for host control of persistent but not acute infection with the intracellular pathogen Toxoplasma gondii. J Exp Med. 185 (7), 1261-1273 (1997).
  2. Schluter, D., et al. Inhibition of inducible nitric oxide synthase exacerbates chronic cerebral toxoplasmosis in Toxoplasma gondii-susceptible C57BL/6 mice but does not reactivate the latent disease in T. gondii-resistant BALB/c mice. J Immunol. 162 (6), 3512-3518 (1999).
  3. Khan, I. A., Matsuura, T., Fonseka, S., Kasper, L. H. Production of nitric oxide (NO) is not essential for protection against acute Toxoplasma gondii infection in IRF-1-/- mice. J Immunol. 156 (2), 636-643 (1996).
  4. Khan, I. A., Schwartzman, J. D., Matsuura, T., Kasper, L. H. A dichotomous role for nitric oxide during acute Toxoplasma gondii infection in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13955-13960 (1997).
  5. Mordue, D. G., Desai, N., Dustin, M., Sibley, L. D. Invasion by Toxoplasma gondii establishes a moving junction that selectively excludes host cell plasma membrane proteins on the basis of their membrane anchoring. J Exp Med. 190 (12), 1783-1792 (1999).
  6. Mordue, D. G., Sibley, L. D. Intracellular fate of vacuoles containing Toxoplasma gondii is determined at the time of formation and depends on the mechanism of entry. J Immunol. 159 (9), 4452-4459 (1997).
  7. Coppens, I., et al. Toxoplasma gondii sequesters lysosomes from mammalian hosts in the vacuolar space. Cell. 125 (2), 261-274 (2006).
  8. Joiner, K. A., Fuhrman, S. A., Miettinen, H. M., Kasper, L. H., Mellman, I. Toxoplasma gondii: fusion competence of parasitophorous vacuoles in Fc receptor-transfected fibroblasts. Science. 249 (4969), 641-646 (1990).
  9. Dobrowolski, J. M., Sibley, L. D. Toxoplasma invasion of mammalian cells is powered by the actin cytoskeleton of the parasite. Cell. 84 (6), 933-939 (1996).
  10. Kim, S. K., Fouts, A. E., Boothroyd, J. C. Toxoplasma gondii dysregulates IFN-gamma-inducible gene expression in human fibroblasts: insights from a genome-wide transcriptional profiling. J Immunol. 178 (8), 5154-5165 (2007).
  11. Lang, C., et al. Impaired chromatin remodelling at STAT1-regulated promoters leads to global unresponsiveness of Toxoplasma gondii-Infected macrophages to IFN-gamma. PLoS Pathog. 8, e1002483(2012).
  12. Kim, L., Butcher, B. A., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii interferes with lipopolysaccharide-induced mitogen-activated protein kinase activation by mechanisms distinct from endotoxin tolerance. J Immunol. 172 (5), 3003-3010 (2004).
  13. Leng, J., Butcher, B. A., Egan, C. E., Abdallah, D. S., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii prevents chromatin remodeling initiated by TLR-triggered macrophage activation. J Immunol. 182 (1), 489-497 (2009).
  14. Leng, J., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii inhibits covalent modification of histone H3 at the IL-10 promoter in infected macrophages. PLoS One. 4, e7589(2009).
  15. Seabra, S. H., de Souza, W., DaMatta, R. A. Toxoplasma gondii partially inhibits nitric oxide production of activated murine macrophages. Exp Parasitol. 100 (1), 62-70 (2002).
  16. Butcher, B. A., et al. Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control. PLoS Pathog. , e1002236(2011).
  17. Ong, Y. C., Reese, M. L., Boothroyd, J. C. Toxoplasma rhoptry protein 16 (ROP16) subverts host function by direct tyrosine phosphorylation of STAT6. J Biol Chem. 285 (37), 28731-28740 (2010).
  18. Saeij, J. P., et al. Toxoplasma co-opts host gene expression by injection of a polymorphic kinase homologue. Nature. 445 (7125), 324-327 (2007).
  19. Jensen, K. D., et al. Toxoplasma polymorphic effectors determine macrophage polarization and intestinal inflammation. Cell Host Microbe. 9 (6), 472-483 (2011).
  20. Rosowski, E. E., et al. Strain-specific activation of the NF-kappaB pathway by GRA15, a novel Toxoplasma gondii dense granule protein. J Exp Med. 208 (1), 195-212 (2011).
  21. Bougdour, A., et al. Host cell subversion by Toxoplasma GRA16, an exported dense granule protein that targets the host cell nucleus and alters gene expression. Cell Host Microbe. 13 (4), 489-500 (2013).
  22. Braun, L., et al. A Toxoplasma dense granule protein, GRA24, modulates the early immune response to infection by promoting a direct and sustained host p38 MAPK activation. J Exp Med. 210 (10), 2071-2086 (2013).
  23. El Hajj, H., et al. ROP18 is a rhoptry kinase controlling the intracellular proliferation of Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 3, e14(2007).
  24. Etheridge, R. D., et al. The Toxoplasma Pseudokinase ROP5 Forms Complexes with ROP18 and ROP17 Kinases that Synergize to Control Acute Virulence in Mice. Cell Host Microbe. 15 (5), 537-550 (2014).
  25. Niedelman, W., et al. The rhoptry proteins ROP18 and ROP5 mediate Toxoplasma gondii evasion of the murine, but not the human, interferon-gamma response. PLoS Pathog. 8, e1002784(2012).
  26. Zhao, Y., et al. Virulent Toxoplasma gondii evade immunity-related GTPase-mediated parasite vacuole disruption within primed macrophages. J Immunol. 182 (6), 3775-3781 (2009).
  27. Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages. Mol Microbiol. 63 (2), 482-496 (2007).
  28. Skariah, S., Bednarczyk, R. B., McIntyre, M. K., Taylor, G. A., Mordue, D. G. Discovery of a novel Toxoplasma gondii conoid-associated protein important for parasite resistance to reactive nitrogen intermediates. J Immunol. 188 (7), 3404-3415 (2012).
  29. Zhao, Z., et al. Autophagosome-independent essential function for the autophagy protein Atg5 in cellular immunity to intracellular pathogens. Cell Host Microbe. 4, 458-469 (2008).
  30. Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion. Infect Immun. 62 (5), 1761-1767 (1994).
  31. Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Induction of bradyzoite-specific Toxoplasma gondii antigens in gamma interferon-treated mouse macrophages. Infect Immun. 61 (3), 1141-1145 (1993).
  32. Tobin, C., Pollard, A., Knoll, L. Toxoplasma gondii cyst wall formation in activated bone marrow-derived macrophages and bradyzoite conditions. J Vis Exp. (42), 2091(2010).
  33. Gajria, B., et al. ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource. Nucleic Acids Res. 36, D553-D556 (2008).
  34. Farrell, A., et al. Whole genome profiling of spontaneous and chemically induced mutations in Toxoplasma gondii. BMC Genomics. 15, 354(2014).
  35. Farrell, A., et al. A DOC2 protein identified by mutational profiling is essential for apicomplexan parasite exocytosis. Science. 335 (6065), 218-221 (2012).
  36. Brown, K. M., et al. Forward genetic screening identifies a small molecule that blocks Toxoplasma gondii growth by inhibiting both host- and parasite-encoded kinases. PLoS Pathog. 10, e1004180(2014).
  37. Jammallo, L., et al. An insertional trap for conditional gene expression in Toxoplasma gondii: identification of TAF250 as an essential gene. Mol Biochem Parasitol. 175 (2), 133-143 (2011).
  38. Coleman, B. I., Gubbels, M. J. A genetic screen to isolate Toxoplasma gondii host-cell egress mutants. J Vis Exp. (60), 3807(2012).
  39. Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. J Vis Exp. (81), e50966(2013).
  40. Sibley, L. D., Adams, L. B., Fukutomi, Y., Krahenbuhl, J. L. Tumor necrosis factor-alpha triggers antitoxoplasmal activity of IFN-gamma primed macrophages. J Immunol. 147 (7), 2340-2345 (1991).
  41. Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nat Protoc. 8 (9), 1680-1693 (2013).
  42. Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J Vis Exp. Feb. (48), 2348(2011).
  43. Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. J Vis Exp. (84), e51225(2014).
  44. Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress. Mol Biochem Parasitol. 171 (2), 97-103 (2010).
  45. Fentress, S. J., et al. Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence. Cell Host Microbe. 8 (6), 484-495 (2010).
  46. Fleckenstein, M. C., et al. A Toxoplasma gondii Pseudokinase Inhibits Host IRG Resistance Proteins. PLoS Biol. 10, e1001358(2012).
  47. Cirelli, K. M., et al. Inflammasome sensor NLRP1 controls rat macrophage susceptibility to Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 10, e1003927(2014).
  48. Ewald, S. E., Chavarria-Smith, J., Boothroyd, J. C. NLRP1 is an inflammasome sensor for Toxoplasma gondii. Infect Immun. 82 (1), 460-468 (2014).
  49. Gorfu, G., et al. Dual role for inflammasome sensors NLRP1 and NLRP3 in murine resistance to Toxoplasma gondii. MBio. 5 (1), (2014).
  50. Lees, M. P., et al. P2X7 receptor-mediated killing of an intracellular parasite, Toxoplasma gondii, by human and murine macrophages. J Immunol. 184 (12), 7040-7046 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

leri Genetik TaramaMakrofaj AktivasyonuParazit MutantlarIFN gama DirenciParazitofor VakuolParazit StazParazit DegradasyonuKronik Enfeksiyon

İlgili makaleler