Üç-boyutlu Tam Kalınlığı Deri Üretimi Eşdeğer ve Otomatik Yaralama

Özet

Bu protokolün amacı, doğal cilde benzeyen üç boyutlu tam kalınlıkta bir cilt eşdeğeri oluşturmaktır. Özel olarak yapılmış bir otomatik yaralama cihazı ile, sterilitenin korunması altında hassas ve tekrarlanabilir yaralar oluşturulabilir.

Özet

in vitro modeller, kutanöz yara iyileşme süreçlerini incelemek için uygun maliyetli ve etik bir alternatiftir. Ayrıca, insan hücrelerini kullanarak, bu modeller insan yara durumunu hayvan modellerinden daha iyi yansıtır. İki boyutlu modeller, hücresel göç ve proliferasyon gibi süreçleri araştırmak için yaygın olarak kullanılsa da, yara iyileşmesi hakkında daha derin bir bilgi edinmek için daha karmaşık modellere ihtiyaç vardır. Uygun bir model sistemin yanı sıra, farklı test çalışmaları arasında karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için hassas ve tekrarlanabilir yaraların oluşturulması çok önemlidir. Bu çalışmada, yara iyileşmesi çalışmasına eşdeğer üç boyutlu tam kalınlıkta bir cildin oluşumu gösterilmiştir. Modellerin dermal kısmı, sıçan kuyruğu kollajen tip I hidrojel içine gömülü insan dermal fibroblastından oluşur. İnsan epidermal keratinositleri ile inokülasyonu ve bunun sonucunda hava-sıvı arayüzünde kültürü takiben, modellerin üzerinde çok katmanlı bir epidermis oluşturulur. Yara iyileşme sürecini incelemek için ayrıca steril bir atmosferde standartlaştırılmış yaralar oluşturan otomatik bir yaralama cihazı geliştirdik.

Giriş

Deri vücudun en büyük organıdır. Bu dış çevre ve iç organlar arasında bir bariyer oluşturur. Ayrıca, cilt sıvı kaybı, çevresel etkilere, yaralanma ve enfeksiyonlara karşı vücudu korur ve vücut ısısını ¹ düzenlemeye yardımcı olur. Nedeniyle açıkta bir konumda, cilt genellikle mekanik, termal veya kimyasal travma etkilenir. Cilt kendini tamir genellikle yetenekli olmasına rağmen, böyle bir enfeksiyon, oksijenlenme ve venöz yeterlilik gibi birden fazla yerel faktörler bozulmuş yara iyileşmesi yol açabilir. Yara iyileşmesi de obezite, alkolizm, sigara, ilaç, beslenme ve diyabet gibi hastalıklar gibi sistemik faktörler tarafından müdahale edilebilir. ²

(i) iltihaplı faz, (ii) proliferatif ve (iii) yeniden modelleme aşaması: yara iyileşmesi süreci 3 evreye ayrılabilir. Cilde hasar üzerine, karmaşık bir sinyal kademeli yara kapanmasına neden başlar. ³Yaralanma sonrası yara kanama ve bir kan pıhtısı meydana gelir. Fibroblastlar kan pıhtısı içine taşımak ve daha sonra yılda yenilenmiş yeni doku ile değiştirin.

Biyolojik süreçler altta yatan deri onarım mevcut anlayış sınırlıdır. Küçük hayvan ve domuz modelleri yara iyileşmesini incelemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu sonuçlar, doğrudan türe özgü farklılıklar nedeniyle insanlarda transfer edilemez. Bu in vivo modellerde ek olarak, yara iyileşmesi bazı yönlerini ⁴ Bu çizilmeye modeller oldukça standardize edilir. Ölümsüzleştirdi hücre hatları veya primer hücrelerde dayalı in vitro tek tabaka kültürlerinin çizilmemesi yoluyla bir yara durumu taklit ederek ele alınabilir, ancak yeterince yansıtmıyor kompleks in vivo olarak fizyoloji. ^5, iki-boyutlu bir model yanı sıra, üç-boyutlu bir insan derisi eşdeğer dermatolojik araştırmaları için geliştirilmiştir. Bu modellerin dermal kısmı ge vardırnerated decellularized dermis, ⁶ kollajen hidrojeller, ^7,8 glikosaminoglikanlar ⁹ veya sentetik malzemelerden dahil olmak üzere çeşitli iskele kullanarak. ¹⁰ bu deri eşdeğerleri istihdam, epitelyal-mezenkimal etkileşimleri ¹¹ rolünü yeniden epitelizasyon, fibroblast ve keratinositler arasındaki hücresel karışma Farklı büyüme faktörlerinin etkisi incelenebilir. Ayrıca, bu modeller fibroblastlar yaralı bölgeye göç ve nasıl kemotaktik faktörler doku yenilenmesini nasıl etkilediği hakkında yeni bilgiler elde etmek için yararlıdır. ¹²

Yara iyileşmesi modelinin kendisinde değil, sadece üretim zor olmakla birlikte, aynı zamanda, bir modelde yüksek ölçüde standardize edilmiş yara sorunludur kurmak. Ortak teknikler yaralar çizik testleri, ¹³ yanıklara, ¹⁴ teyp aşınma, ¹⁵ termal yaralanma, ¹⁶ emme kabarcıklar, ¹⁷ sıvı azot, ¹⁸ lazerler, ¹⁹ olan oluşturmak için neşter, ¹⁸ meshers ⁶ ve biyopsi yumruklar. Bu yöntemlerin çoğu ²⁰ aynı tuzaklar var. Elle uygulanan yaralanmalar standartlaştırmak ve çoklu testler arasında yeniden zordur. Boyut, şekil ve yaranın derinliği çalışmalar arasında değişir ve böylece araştırma verilerinin kalitesini bozar. tanımlı cilt yaralanması için lazer kullanımı nispeten kolay standardize ancak yanık yaraları taklit bir duruma yol açar edilebilir. Lazer tarafından uygulanan ısı nekrotik dokunun yol açabilir protein denatürasyonu, trombosit agregasyonu veya damarların daralmasına neden olabilir.

Alternatif bir yaklaşımda, bize steril koşullar altında tanımlanmış ve hassas deri yaraları oluşturmak için izin veren bir otomatik yaralama cihazı (AWD) geliştirdi. Derinlik ve hız penetrasyonu olarak matkap ucu devir gibi yaralanması parametreleri ayarlanabilir. Bu çalışmada, biz evde geliştirilen tam kalınlıkta deri eşdeğerleri ile AWD kombine (ftGangatirkar ve arkadaşları tarafından yayınlanmış bir protokol ile karşılaştırılabilir SE). ⁸ deri eşdeğerinde dermal katman, hidrojel bir kollajen gömülü, insan dermal fibroblastları (HDF), oluşmaktadır. Dermal katmanda, insan epidermal keratinositler (HEK) numaralı seribaşı bulunmaktadır. Hava-sıvı arayüzü iki hafta içinde HEK birçok hayati hücre katmanları ve stratum corneum oluşan bir epidermis kurmak. Bu modelin oluşturmasının yanı sıra, bu çalışma FTSE tanımlanmış ve hassas yaralar oluşturmak üzere AWD kullanımını göstermektedir.

Protokol

NOT: protokol 24 tam kalınlıkta deri eşdeğerleri üretimi için tasarlanmıştır. Dermal fibroblastlar ve epidermal keratinositler İnsan ^21,22 Aydınlatılmış onam önceden elde edildi. Daha önce yayınlanmış protokole göre deri biyopsi izole edilmiş ve çalışma Julius-Maximilians-Üniversitesi Würzburg insan araştırma kurumsal etik komitesi tarafından onaylanmıştır (182 oy / 10).

Dermal Bileşeni 1. Üretimi

1. 6 mg / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar% 0.1 asetik asit ile kollajen çözülür. Jel nötrleştirme çözeltisi için, 232,5 mi 2x DMEM, 7.5 ml cenin buzağı serumu, 7.5 ml 3 M HEPES, 2.5 ml kondroitin sülfat (5 mg / ml) karıştırın. Buz üzerinde jel nötrleştirme çözeltisi ve kolajen çözeltisi tutun. Insert / deri eşdeğeri başına jel 500 ul hesaplayın.
   NOT: jel nötrleştirme çözeltisi kolajen çözeltisi Prepa iki parça ile karıştırılacaktır Adıkolajen çift miktarı yeniden.
2. 24 plaka içine 24 ekler yerleştirin.
3. 10 ml DMEM, 270 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj insan dermal fibroblastları (HDF) yeniden süspanse edin ve hücreleri sayın. X g, 270 ° C'de 5 dakika için gerekli HDF bir miktar (500 ul kollajen jel başına 5 x 10 ⁴ hücrelerinde) ve santrifüj hücreleri ekstrakte edin.
4. 4 ml hava kabarcıkları üretmeden jel nötralizasyon çözümü soğutulmuş HDF tekrar süspansiyon dikkatlice Süpernatantı ve. Bu aşamada itibaren kollajen jeller erken katılaşmasını önlemek için mümkün olduğunca hızlı çalışması için emin olun.
5. Kolajen çözeltisi, 8 ml çözelti yeniden süspanse edin.
6. Çok aşamalı-pipet ile kollajen-hücre-karışımı alın ve her insert hızlı karışımın 500 ul doldurun. Bir kuluçka makinesi içinde 20 dakika süreyle inkübe edin jeller (37 ° C,% 5 _CO2) jelleri jöle için.
7. Oyuk başına 2 ml'lik Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM)% 10 fetal dana serumu (FCS) içinde jeller daldırınve bir kuluçka makinesi içinde 24 saat (37 ° C,% 5 _CO2) için kuluçkalayın.

İnsan epidermal Keratinositler 2. eklenmesi (HEK)

1. 24 saat sonra, orta çıkarın. 50 ug / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar ultra-saf su ile fibronektin insan proteinini çözülür. Fibronektin çözeltisi 25 ul eşdeğer her dermal örtün. Bir kuluçka makinesi içinde, 30 dakika süre ile inkübe jeller (37 ° C,% 5 _CO2).
2. Bu arada, 10 mi KGM-2'de HEK tekrar süspansiyon ve KGM-2 5 + uyumlu% FCS ile 1 x 10 ⁶ hücre / ml hücre konsantrasyonu ayarlanır. Her jel üzerinde Tohum 1 x 10 ⁵ HEK. Inkübatörde 45 dakika boyunca (37 ° C,% 5 _CO2) hücre yapışmasının sağlanması için jeller inkübe edin.
3. Kuluçka makinesi içinde, KGM-2 + uyumlu,% 5 FCS ve kültür olması (37 ° C,% 5 _CO2) ile jeller batırın.

Tam Kalınlıkta Deri Benzerleri 3. Kültür (FTSE)

1. 6-7 gün boyunca kültür ftseFCS konsantrasyonu (% 5,% 2, ve% 0 FCS) inen. Bir sonraki alt FCS konsantrasyonu ile 2-3 günde orta değiştirin. Bunun için, tam orta kaldırmak ve taze ortam içinde 1.6 ml ilave ediniz.
2. 7. günde, tam ortam maddesinin ayrılması.
   NOT: Bunu yaparken pipet ucu ile FTSE yüzeyine dokunmayın.
3. Her steril forseps ile 6 plaka 1 kuyuya eklemek yerleştirin. FTSE yüzeyini ıslak değil sağlanabil- iyi başına 1.5 ml hava ikmal orta ekleyin. Ilave 14 gün boyunca 2-3 günde bir değiştirilen ortam içinde.
   NOT: orta dolum seviyesi FTSE menisküsüne kadar.

4. Histolojik analiz

1. Tespit ve FTSE parafin-gömme
   1. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca dokular taze 24 yuvalı plakalar içinde uçlar aktarmak ve de 1.6 mi, her ila% paraformaldehid 4 eklenerek dokular tamir ve inkübe, kültür ortamı çıkarın. Dikkat! Paraformaldehyd toksik, davlumbaz altında manipüle. TransferBir doku gömme kaset FTSE. Su ile yıkama ile geri kalan fiksatif çıkarın ve artan etanol konsantrasyonu kullanılarak doku dihidrat.
   2. Orta dikey bir kesik yoluyla deri eşdeğer bölün. Aşağı kesilmiş yüzeyleri ile bir parafin dolu metal taban kalıp iki adet yerleştirin. Bir destek olarak, kalıbın üst doku kaseti ekleyin.
   3. Uygun mikroskop lamı üzerine slaytlar monte, 3-5 mikron dilim kesin ve straitening için 40 ° C su banyosunda onları yüzer. Iyice kuru dilim.
2. Hematoksilen & Eosin (H & E) ve immunohistokimyasal (İHK) boyama
   1. Talep rafa kayar ve 60 ° C de 1 saat süreyle inkübe edin. Parafin erimiş olduğundan emin olun. Leke standart bakış boyama gibi H & E ile dilimleri rehidre.
   2. H & E boyama için etanol% 50, 4x deiyonize su, 1x Hematoksilin, 1x HCI-e 1x, etanol ile 2x, etanol ile 3x, ksilolde ile% 70% 96 4x cam boyama cuvettes hazırlamak-metanol (13.7 mi, 1 M HCI reklam 200 ml% 50 etanol), 1x kullanma suyu, 1x eozin ve 2 x 2-propanol (100 ml deiyonize su içinde 1 g eosin).
   3. Yer ksilol I 10 dakika ve deparaffinize ve slaytlar rehydrate xylol II 10 dakika slaytlar. Daldırma etanol,% 50 etanol% 70, 3 x 3x, etanol ile% 96 I, 3 x 96% II 3x kayar. Deiyonize su slaytlar döndürün. Hematoksilen boyası, HCI-etanol daldırma 2x ayırt etmek. Iyonu giderilmiş su içinde durulayın. Blueing için, yer sekme suda 5 dakika slaytlar. Eozin boyama, yer eozin 1 dakika kayar ve deiyonize su içinde daha sonra yıkanır. Dehidrasyon için, daldırma slaytlar etanol,% 96 etanol içinde% 70, 2 x 2 x ve 2-propanol II, 5 dakika için, 2-propanol I, 5 dakika için koyun, ksilol içinde 5 dakika I ve ksilol II 5 dak. H & E boyama sonra, hücre çekirdekleri kırmızı lekeli mavi, sitoplazma ve hücre dışı matriks içinde lekeli.
   4. Antijen alımı için, ksilen ile parafin kaldırmak ve boyama için dilimleri rehydrate. Yer dilimleriDüdüklü tencereyi önceden ısıtılmış 10 mM, 20 dakika sitrat tamponu (pH 6) için deparafinize ve rehidre dilimleri yemek ve.
   5. Bir sıvı itici slayt işaretleyici kalem veya elmas kalemle yıkama tamponu yerleştirin slaytlar (PBS tampon +% 0.5 Polisorbat 20) ve daire dilimleri.
   6. Bir nem odasında slaytlar yerleştirin. Her bir dilim üzerine 100 ul% 3 hidrojen peroksit çözeltisi ilave edilerek, endojenez peroksidazı bloke eder. Dikkat! Cilt ve göz temasında Çok tehlikeli. Kişisel koruyucu ekipman ile taşıyınız. Yıkama yıkama tamponu slaytlar.
   7. Birincil antikor uygulayın ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir. Yıkama Yıkama tamponu ile üç kez kayar. Burada, numuneler karanlıkta tutulmalıdır.
   8. Bağlayıcı spesifik bir antijen-antikor tespiti için biyotin-streptavidin algılama sistemi kullanın.
   9. 1 dakika boyunca Hematoksilen çekirdekler Counterstain. Kurutmak ve slaytlar monte edin.
   10. Bir ters mikroskop kullanılarak görüntü örnekleri.

5. Otomatik Yaralama Cihazı Kullanımı yaralanma (AWD)

1. % 70 etanol ve ultraviyole ışık ile çalışma alanını dezenfekte ile AWD hazırlayın. Istenilen büyüklükte sondaj kafası emin olun (örneğin, 1 mm) eklenmiştir.
2. Steril forseps kullanarak otoklava numune taşıyıcı plakanın belirlenen alanlara cilt eşdeğerleri yerleştirin. Sondaj başının altındaki sokete örnek taşıyıcı plaka yerleştirin.
3. Spin hızı: aşağıdaki gibi yaralama parametrelerini ayarlamak için kontrol yazılımını kullanın 15,000 rpm; penetrasyon: 1,5 mm; tahrik: 100 Hz. Bu parametreler, her bir numune tipi için tanımlanması gerekir. Transferi AWD parametreleri yaralandı.
4. Prosedürü yaralama başlayın. Soket örnek taşıyıcı plakasını çıkarın. Aktarım steril forseps kullanarak kültürü için kullanılan ekler geri FTSE yaralandı.
5. Rejenerasyon araştırılması için kuluçka makinesi içinde yaralı ftse kültürü (37 ° C,% 5 _CO2) devam edin. Alternatively, herhangi bir zamanda, histolojik analiz için modeller kullanmaktadır.

Sonuçlar

izole edilmiş bir HDF ve HEK morfolojisinde ve tipik markerlerin ekspresyonu bakımından farklılık gösterir. Hek morfolojisi bir Arnavut kaldırımı morfolojisi ile tarif edilebilir ise Hdf, tipik mil-şekil morfolojisi gösterdi. Hücreler FTSE için bunları kullanmadan önce immünohistokimyasal boyama (Şekil 1) ile karakterize edilmiştir. Hdf vimentin (Şekil 1A), fibroblastlar için bir marker için olumludur. İlköğretim Hek derece erken farklılaşma proteini sitokeratinin-14 (Şekil 1B)<...

Tartışma

Nitro hücrelerde genellikle hücreler plastik yüzeylere yapışan iki boyutlu hücre kültürlerinde, yayılır. Bununla birlikte, bu kültür koşulları hücrelerinin in vivo büyümek olan fizyolojik üç boyutlu koşulları yansıtmamaktadır. Üç boyutlu koşulları altında, hücreler, doğal hücre-hücre ve hücre-matris bağlanmalarının ve üç boyutlu olarak yer değiştirmektedir. Hücre göçü ve matriks üretimi yara iyileşmesinin temel unsurları olarak özellikle in vivo durumun benzerlik iyileşme deri yara, anlamlı ve...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Tripsin EDTA (1:250) DPBS	PAA	L11-003'te	0,5 %0,05
Dulbecco' s Fosfat Tamponlu	Salin Sigma	D8537
Kollajen (% 0.1 asetik asit içinde 6 mg / ml)	Evde
Fibronektin İnsan Proteini, Plazma (50 & &mikro; g / ml)	Yaşam Teknolojileri	33016-015
Uçlar	Nunc	140627
6 kuyulu plaka	Nunc	140685
24 kuyulu plaka	Nunc	142485
Mikroskop slaytları	R. Langenbrinck	03-0070
Fibroblast kültürü (500 ml):
DMEM, yüksek glikoz	Yaşam Teknolojileri	11965-092	%89 (445 ml)
Fetal sığır serumu	Bio & FCS satmak	. ADD.0500	%10 (50 ml)
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/ml)	Yaşam Teknolojileri	15140-122	%1 (5 ml)
Keratinozit kültür ortamı (500 ml):
Keratinosit Büyüme Ortamı 2	Promocell	C-20111	%89 (445 ml)
Keratinosit Büyüme Ortamı 2 Takviye Paketi	Promocell	C-39011
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/ml)	Yaşam Teknolojileri	15140-122	%1 (5 ml)
Jel nötralizasyon çözeltisi (250 ml):
Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium, L-Glutamin	PAA	G0001,3010	%93 (232.5 ml)
Köpekbalığı kıkırdağından kondroitin sülfat sodyum tuzu	Sigma	C4384-1g	%1 (2.5 ml)
Fetal sığır serumu	Bio & FCS satmak	. ADD.0500	%3 (7.5 ml)
HEPES	Sigma	H3375-1kg	%3 (7,5 ml)
Skin model submers medium (500  ml):
Keratinosit Büyüme Ortamı 2	Promocell	C-20111
Keratinosit Büyüme Ortamı 2 Takviye Paketi	Promocell	C-39011
Fetal buzağı serumu	Bio & FCS satmak	. ADD.0500	%5-%2 (25 ml-10 ml)
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/ml)	Yaşam Teknolojileri	15140-122	%1 (5 ml)
Cilt modeli hava-sıvı arayüz ortamı (500 ml):
Keratinosit Büyüme Ortamı 2
Keratinosit Büyüme Ortamı 2 Ek Paket	Promocell	C-39011	sadece takviyeler ekleyerek: insülin, hidrokortizon, epinefrin, transferrin, CaCl2< / sub>
Penisilin-Streptomisin (10.000 U / ml)	Yaşam Teknolojileri	15140-122	1 (5 ml)
CaCl2< / sub> (300 mM)	Sigma	C7902-500g	%0.62 (3.1 ml)
Histoloji:
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP	DCS	PD000KIT
Vimentin antikoru	Abcam	ab92547
CK14 antikoru	Sigma	HPA023040-100 ve mikro; l
CK10 antikoru	Dako	M7002
Filaggrin antikoru	Abcam	ab81468
H & E boyama: < / güçlü >
Mayer ve akut; s Haemalaun	AppliChem	A0884,2500
Xylol	Sigma Aldrich	296325-4X2L
Etanol	Sigma Aldrich	32205-4X2.5L
HCl	Sigma Aldrich	H1758-500ML
Eozin	Sigma Aldrich	E4009-5G
2-Propanolol	Sigma Aldrich	I9516-500ML
Montaj Ortamı	Sigma Aldrich	M1289-10ML