Burada, bir peptidilarginin deiminaz (PADI) enzim inhibitörü olan BB-Cl-amidin'in in vitro meme kanseri tümörjenitesi üzerindeki etkilerini test etmek için yumuşak agar koloni oluşumu testinin kullanımını belgeliyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yumuşak Agar koloni oluşturma deneyi kullanılması Meme Kanseri Hücrelerinde tümör oluşum nedenlerinin nin inhibitörlerini teşhis etmek üzere
Bu makalede
Özet
Özet
Tümör ilerlemesinin mekanizmalarını in vivo olarak araştırmadaki doğal zorluklar göz önüne alındığında, hücrelerin yarı katı matrislerde çoğalma yeteneğini ölçen yumuşak agar koloni oluşumu testi (bundan böyle yumuşak agar testi olarak anılacaktır) gibi hücre bazlı tahliller, kanser araştırmalarının ayırt edici özelliği olmaya devam etmektedir. Bu tekniğin konvansiyonel 2D tek tabakalı veya 3D küresel hücre kültürü tahlillerine göre önemli bir avantajı, 3D hücresel ortamın in vivo olarak görülene yakın taklididir. Daha da önemlisi, yumuşak agar testi, yeni bileşiklerin veya tedavi koşullarının hücre çoğalması ve göçü üzerindeki etkilerini titizlikle test etmek için ideal bir araç sağlar. Ek olarak, bu tahlil, genetik bozulmalar bağlamında hücre dönüşüm potansiyelinin kantitatif değerlendirmesini sağlar. Yakın zamanda peptidilarginin deiminaz 2'yi (PADI2) potansiyel bir meme kanseri biyobelirteç ve terapötik hedef olarak tanımladık. Burada, PADI inhibitörü BB-Cl-amidinin (BB-CLA) insan duktal karsinomu in situ (MCF10DCIS) hücrelerinin tümörjenitesi üzerindeki etkilerini test ederek klinik öncesi anti-kanser çalışmaları için yumuşak agar testinin faydasını vurguluyoruz.
Giriş
Hem dönüşmemiş (normal) hem de dönüştürülmüş hücreler, 2B tek katmanlı bir kültürde kolayca çoğalabilir. Bu yapışık hücre büyümesi biçimi, mitojenik stimülasyonun yokluğunda hücrelerin genellikle mikro çevreleri içinde hızlı bir şekilde bölünmediği in vivo olarak meydana gelenden oldukça farklıdır. Öte yandan yumuşak agar testi, 2D kültür sistemlerinden farklıdır, çünkü bir hücrenin yarı katı bir agaroz jel1 içinde süspansiyon halinde çoğalma ve koloniler oluşturma yeteneğini ölçerek tümörjeniteyi ölçer. Bu ortamda, transforme olmamış hücreler, hücre dışı matrikse (ECM) ankraj yokluğunda hızla çoğalamaz ve anoikis olarak bilinen bir süreç olan apoptoza maruz kalırlar. Buna karşılık, malign transformasyon geçiren hücreler, fosfatidilinositol 3-kinaz (PI3K)/Akt ve Rac/Cdc42/PAK gibi sinyal yollarının aktivasyonu nedeniyle ankraj bağımlılıklarını kaybederler. Bu nedenle, bu hücreler yarı katı yumuşak agar matrisi2 içinde büyüyebilir ve koloniler oluşturabilir.
Yumuşak agar testinin yaygın bir kullanımı, PADI inhibitörleri gibi spesifik bileşiklerin in vitro tümör büyümesini baskılayıp baskılayamayacağını test etmektir. Genel olarak, koloni sayısı veya koloni boyutları, hücresel tümörjenisitedeki farklılıkları değerlendirmek için kontrol ve tedavi grupları arasında karşılaştırılabilen testten elde edilen kantitatif okumalardır. Bu nedenle, koloni oluşumunun artan ilaç konsantrasyonu ile ters orantılı olduğu bulunursa, ilacın in vitro olarak etkili bir tümörjenisite inhibitörü olduğu sonucuna varılabilir. Öte yandan, ilaç koloni oluşumunu etkilemiyorsa, ilaç ya uygun dozda değildir ya da etkili bir tümörjenik inhibitör değildir. Bir ilacın anti-tümör etkisini test etmek için yumuşak bir agar testi kullanmanın yanı sıra, bu test aynı zamanda belirli bir gen ile tümör oluşumu arasındaki ilişkiyi araştırmak için de kullanılabilir. Örneğin, PADI2 ekspresyonunun baskılanmasının tümörjenite üzerindeki etkisi, PADI2'ye özgü siRNA tedavisi ile ele alınabilir.
PADI'ler, sitrülinasyon veya deimination3-5 olarak bilinen bir işlemde pozitif yüklü arginin kalıntılarını nötr yüklü sitrüline dönüştürerek proteinleri translasyon sonrası olarak değiştiren kalsiyuma bağımlı enzimlerdir. Yakın zamanda peptidilarginin deiminaz 2'nin (PADI2) yeni bir meme kanseri biyobelirteç olarak işlev görebileceğini ve PADI inhibitörlerinin erken evre meme kanserleri için aday tedavileri temsil ettiğini bulduk6. Örneğin, daha önce bir "pan-PADI" inhibitörü olan Cl-amidin'in 2D tek tabakalar kullanarak meme kanseri hücrelerinin çoğalmasını baskıladığını ve inhibitörün 3D tümör sferoidlerinin büyümesini baskıladığınıgöstermiştik 6. Bu raporda, bu çalışmaları genişletiyoruz ve yeni bir PADI inhibitörü olan BB-CLA'nın MCF10DCIS meme kanseri kolonilerinin büyümesini baskılamadaki etkinliğini test ederek yumuşak agar testinin faydasını vurguluyoruz7. Bu deney için MCF10DCIS hücreleri kullandığımızı not ediyoruz, çünkü bunlar transforme edilmemiş insan MCF10A hücrelerinin onkojenik türevleridir ve yüksek kararlı durum PADI2 protein8 seviyeleri içerdikleri için. PADI2 enzimatik aktivitesinin bu hücre hattının tümörjenisitesinde anahtar bir rol oynadığını ve PADI2 aktivitesinin BB-CLA aracılı inhibisyonunun kanser ilerlemesini baskılayacağını varsayıyoruz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
% 3 2-Hidroksietil Agaroz hazırlanması 1.
- Temiz ve kuru bir 100 ml'lik cam şişe içine, damıtılmış su, 30 ml, ardından 2-hidroksietil agaroz (Agaroz VII) 0.9 g.
- 15 saniye hafifçe için karışım girdap mikrodalga. Agaroz tozu tamamen eriyene kadar bu adımı en az üç kez daha tekrarlayın.
- 15 dakika için çözelti içeren bir şişe otoklava.
- Agaroz çözüm daha kullanımdan önce oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Oda sıcaklığında çözelti saklayın.
Alt Katman 2. Hazırlık:% 0.6 Agaroz Jel
- Tutarken pipet katılaşmasını agaroz önlemek için 5 ml 37 ° C kuluçka makinesi içinde 10 mi pipetler önceden sıcak birçok.
- Kısmen şişe kapağı ve mikrodalga 15 saniye önceden yapılmış% 3 2-hidroksietil agaroz çözümü gevşetin. Daha sonra, yumuşak bir 15 sn için çözelti ve mikrodalga girdap. DİKKAT: Agaro dönen dikkatli olunse çözümü çözüm havaya maruz ve yayılabilir zaman yükselir çünkü.
- Şişede kalan katı jel, birkaç saniye mikrodalga varsa.
- Erken katılaşmasını agaroz çözüm önlemek için bir sonraki adımları sırasında 45 ° C su banyosunda agaroz solüsyon içeren şişe tutun.
- 37 ° C su banyosu içinde sıcak MCF10DCIS ortamı. Not: MCF10DCIS ortam DMEM / F12,% 5 at serumu,% 5 penisilin streptomisin oluşur.
- Aktarım steril 50 ml konik bir tüp içine önceden ısıtılmış pipetler kullanılarak% 3 agaroz çözeltisi 3 mi.
- Hemen sıcak MCF10DCIS medya 12 ml ekleyin ve hafifçe medya ile agaroz karıştırmak için konik tüp ters. Bu koloni sonradan sayım engel olacak herhangi bir kabarcıkları oluşturmak için çalışın.
- Yavaşça hava kabarcıklarını oluşturucu olmayan bir 6-yuvalı kültür plakasının her bir oyuğuna, bu karışım 2 ml ekleyin.
- 6-çukurlu kültür plakası Horizonta inkübelly, 1 saat boyunca 4 ° C 'de, düz bir yüzeye karışımın sertleşmesine izin vermek.
- Karışım katılaşmasından sonra, 30 dakika boyunca 37 ° C inkübatör içine plaka yerleştirin. alt tabaka artık kullanıma hazırdır.
Hücre içeren katmanın 3. hazırlanması:% 0.3 agaroz jel
- Trypsinize MCF10DCIS hücreler 4 x 10 4 / ml'lik bir hücre konsantrasyonuna seyreltilmesi ve.
- Bir steril 50 ml konik bir tüp içine önceden ısıtılmış pipetler ve transferi ile% 3 agaroz 2 ml alın.
- Hemen konik tüp MCF10DCIS medya 8 ml ekleyin ve hafifçe medya ile agaroz karıştırmak için ters. Herhangi kabarcıkları oluşturan kaçının.
- (0 uM (DMSO) ya da 1 uM) MCF10DCIS hücreleri (4 x 10 4 / ml) 2 ml alın ve BB-CLA ile tedavi edilir.
- Bir 1: 1 seyreltme,% 0.6 agaroz ile hücrelerin karışımı.
- Hücre-agaroz karışımının 1 ml alın ve yavaşça 6 oyuklu kültür p alt tabakanın üzerine eklemekGeç (2 x 10 4 hücre / ml).
- Üst tabaka katılaşmaya izin vermek için en az 15 dakika boyunca 4 ° C 'de, düz bir yüzeye yatay 6 oyuklu kültür plakasına yerleştirin.
- Karışım katılaşmasından sonra, besleme tabakanın ilave edilmeden önce bir hafta boyunca 37 ° C inkübatör içine plaka yerleştirin.
Besleyici Katman 4. Hazırlanması:% 0.3 Agaroz Jel
- Mikrodalga 15 saniye önceden yapılmış% 3 2-Hidroksietil agaroz çözüm. yavaşça başka bir 15 saniye için çözüm ve mikrodalga girdap.
- 45 ° C su banyosu içinde agaroz çözelti şişe dengelenmesi.
- 37 ° C su banyosunda MCF10DCIS medyayı ısıtın.
- 50 ml konik bir tüp içine, sıcak MCF10DCIS ortam 9 ml% 3 agaroz çözeltisi 1 ml karıştırın ve yavaşça ortam ile agaroz karıştırmak için ters. Hava kabarcıkları oluşturarak kaçının.
- BB-CLA ile karışım (0 uM (DMSO) ya da 1 uM) tedavi edin.
- Yavaşça için olmayan (bu karışıma 1 ml ekleMing alt ve yumuşak tabakalar ihtiva eden 6 oyuklu kültür plakasının her oyuğuna) kabarcıklar.
- Karışım, katılaşmaya izin vermek için en az 15 dakika boyunca 4 ° C 'de, düz bir yüzeye yatay 6 oyuklu kültür plakasına yerleştirin.
- Besleyici tabakası katılaşır sonra, 37 ° C inkübatör içine plaka yerleştirin.
- Koloni oluşumu gözlenir kadar yeni medya ile hücreleri doldurmak için mevcut besleyici tabakası üzerine% 0.3 agaroz / orta / işleme çözeltisinin 1 ml kaplayan bu beslenme prosedürü haftalık tekrarlayın. Not: Agar yumuşak ve besleyici tabakalar bundan dolayı, besleyici tabaka ile ilgili ilave besinler kolaylıkla hücreler ulaşmak için hücre içeren bir tabaka halinde yayılır, çok yumuşak ve.
5. Veri Toplama
- Yumuşak agar içinde hücre büyümesinin 2.5 hafta sonra, her bir göze, bir ışık mikroskobu kullanarak koloni sayısı. Ölçümü kolaylaştırmak için, bir şeffaflık üzerine ızgara yazdırmak ve ızgara takmak6-plaka hücreleri sayma sırasında nerede bulmanıza yardımcı olmak için. (Her koloninin çapı ile miktarı gibi) koloni büyüklüğü değişebilir olduğundan, atılır olan koloniler belirlemek için bir referans koloni boyutunu önceden tanımlamak. Örneğin, 70 mikron ya da veri analizinde büyük bir koloni boyutları içerir.
- Daha fazla koloni oluşumunu ve gelecekteki sayım önlemek için 4 ° C'de örnekleri saklayın. Kurumasını önlemek için jeller Parafilm ile 6-kuyu kültür plaka Seal.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
yumuşak agar koloni oluşturma deneyi kanser hücrelerinin tümör oluşum nedenlerinin belgeleyen çok geniş bir uygulama aralığı için kullanılabilir. Bu tekniğin önemli bir avantajı, yan-katı bir matris seçici bir ankrajdan bağımsız bir şekilde prolifere olabilir hücrelerin büyümesini yana olmasıdır. Bu özellik esas olarak, kanser hücreleri tarafından değil, normal hücreler tarafından sergilenir. Öncelikle ilaçlar ile tümör büyüme inhibisyonu etkinliğini test etmek için, meme kanseri hücrelerinin bedenindeki, aşırı ekspresy...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
yumuşak agar içinde koloni oluşumu oranı hücre tipi 9 bağlı olarak değişir. Bu nedenle, hücre sayısı optimize edilmiş ve buna uygun olarak ayarlanmalıdır ile başlayın. Önerilen bir başlangıç aralığı oyuk, 6 oyuklu plaka kullanılarak göz başına 4 ila 10 x 02-1 Ekim x 5 arasındaki hücreleridir. Buna ek olarak, koloni büyüklüğü her bir hücrenin büyüme hızına bağlı olarak değişir. Bu nedenle, koloni boyutu için önceden tanımlanmış bir cut-off aşağı kantitatif analizler için bireysel koloni...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Teknik tavsiyeler verdikleri için Cornell Üniversitesi'nden Dr. Richard Cerione, Dr. Marc Antonyak ve Kelly Sullivan'a ve Olympus CKX41 ters mikroskoplarını paylaştıkları için Cornell Üniversitesi'nden Dr. Gerlinde Van de Walle'ye minnettarız.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Zeiss Axiopot Carl | Zeiss Mikroskopi | 1021859251 | |
| Ters Mikroskop | Olympus | CKX41 | |
| DMEM/F-12 | Lonza BioWhittaker | 12-719F | |
| HyClone Donör At Serumu | Fisher Scientific | SH30074.03 | |
| Penisilin Streptomisin | Yaşam Teknolojileri | 15140-122 | |
| 2-Hidroksietilagaroz: Tip VII, düşük jelleşme sıcaklığı | Sigma-Aldrich | 39346-81-1 |
Kaynaklar
- Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197, 461-463 (1977).
- Wang, L. H. Molecular signaling regulating anchorage-independent growth of cancer cells. Mt Sinai J Med. 71 (6), 361-367 (2004).
- Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25 (11), 1106-1118 (2003).
- Horibata, S., Coonrod, S. A., Cherrington, B. D. Role for peptidylarginine deiminase enzymes in disease and female reproduction. J Reprod Dev. 58 (3), 274-282 (2012).
- Mohanan, S., Cherrington, B. D., Horibata, S., McElwee, J. L., Thompson, P. R., Coonrod, S. A. Potential role of peptidylarginine deiminase enzymes and protein citrullination in cancer pathogenesis. Biochem Res Int. , 895343(2012).
- McElwee, J. L., et al. Identification of PADI2 as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. BMC Cancer. 12, 500(2012).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition disrupts NET formation and protects against kidney, skin and vascular disease in lupus-prone MRL/lpr mice. Ann Rheum Dis. , 1-8 (2014).
- Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ. J Natl cancer Inst. 92, 1185-1186 (2000).
- Fan, D., Morgan, L. R., Schneider, C., Blank, H., Fan, S. Cooperative evaluation of human tumor chemosensitivity in the soft-agar assay and its clinical correlations. J Cancer Res Clin Oncol. 109, 23-28 (2000).
- Hamburger, A. W., White, C. P., Dunn, F. E., Citron, M. L., Hummel, S. Modulation of human tumor colony growth in soft agar by serum. Int J Cell Cloning. 1 (4), 216-229 (1983).
- Anderson, S. N., Towne, D. L., Burns, D. J., Warrior, U. A high-throughput soft agar assay for identification of anticancer compound. J Biomol Screen. 12, 938-945 (2007).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
