Yumuşak Agar koloni oluşturma deneyi kullanılması Meme Kanseri Hücrelerinde tümör oluşum nedenlerinin nin inhibitörlerini teşhis etmek üzere

Hem dönüşmemiş (normal) hem de dönüştürülmüş hücreler, 2B tek katmanlı bir kültürde kolayca çoğalabilir. Bu yapışık hücre büyümesi biçimi, mitojenik stimülasyonun yokluğunda hücrelerin genellikle mikro çevreleri içinde hızlı bir şekilde bölünmediği in vivo olarak meydana gelenden oldukça farklıdır. Öte yandan yumuşak agar testi, 2D kültür sistemlerinden farklıdır, çünkü bir hücrenin yarı katı bir agaroz jel¹ içinde süspansiyon halinde çoğalma ve koloniler oluşturma yeteneğini ölçerek tümörjeniteyi ölçer. Bu ortamda, transforme olmamış hücreler, hücre dışı matrikse (ECM) ankraj yokluğunda hızla çoğalamaz ve anoikis olarak bilinen bir süreç olan apoptoza maruz kalırlar. Buna karşılık, malign transformasyon geçiren hücreler, fosfatidilinositol 3-kinaz (PI3K)/Akt ve Rac/Cdc42/PAK gibi sinyal yollarının aktivasyonu nedeniyle ankraj bağımlılıklarını kaybederler. Bu nedenle, bu hücreler yarı katı yumuşak agar matrisi² içinde büyüyebilir ve koloniler oluşturabilir.

Yumuşak agar testinin yaygın bir kullanımı, PADI inhibitörleri gibi spesifik bileşiklerin in vitro tümör büyümesini baskılayıp baskılayamayacağını test etmektir. Genel olarak, koloni sayısı veya koloni boyutları, hücresel tümörjenisitedeki farklılıkları değerlendirmek için kontrol ve tedavi grupları arasında karşılaştırılabilen testten elde edilen kantitatif okumalardır. Bu nedenle, koloni oluşumunun artan ilaç konsantrasyonu ile ters orantılı olduğu bulunursa, ilacın in vitro olarak etkili bir tümörjenisite inhibitörü olduğu sonucuna varılabilir. Öte yandan, ilaç koloni oluşumunu etkilemiyorsa, ilaç ya uygun dozda değildir ya da etkili bir tümörjenik inhibitör değildir. Bir ilacın anti-tümör etkisini test etmek için yumuşak bir agar testi kullanmanın yanı sıra, bu test aynı zamanda belirli bir gen ile tümör oluşumu arasındaki ilişkiyi araştırmak için de kullanılabilir. Örneğin, PADI2 ekspresyonunun baskılanmasının tümörjenite üzerindeki etkisi, PADI2'ye özgü siRNA tedavisi ile ele alınabilir.

PADI'ler, sitrülinasyon veya deimination^3-5 olarak bilinen bir işlemde pozitif yüklü arginin kalıntılarını nötr yüklü sitrüline dönüştürerek proteinleri translasyon sonrası olarak değiştiren kalsiyuma bağımlı enzimlerdir. Yakın zamanda peptidilarginin deiminaz 2'nin (PADI2) yeni bir meme kanseri biyobelirteç olarak işlev görebileceğini ve PADI inhibitörlerinin erken evre meme kanserleri için aday tedavileri temsil ettiğini bulduk⁶. Örneğin, daha önce bir "pan-PADI" inhibitörü olan Cl-amidin'in 2D tek tabakalar kullanarak meme kanseri hücrelerinin çoğalmasını baskıladığını ve inhibitörün 3D tümör sferoidlerinin büyümesini baskıladığını^{göstermiştik 6}. Bu raporda, bu çalışmaları genişletiyoruz ve yeni bir PADI inhibitörü olan BB-CLA'nın MCF10DCIS meme kanseri kolonilerinin büyümesini baskılamadaki etkinliğini test ederek yumuşak agar testinin faydasını vurguluyoruz⁷. Bu deney için MCF10DCIS hücreleri kullandığımızı not ediyoruz, çünkü bunlar transforme edilmemiş insan MCF10A hücrelerinin onkojenik türevleridir ve yüksek kararlı durum PADI2 protein⁸ seviyeleri içerdikleri için. PADI2 enzimatik aktivitesinin bu hücre hattının tümörjenisitesinde anahtar bir rol oynadığını ve PADI2 aktivitesinin BB-CLA aracılı inhibisyonunun kanser ilerlemesini baskılayacağını varsayıyoruz.

% 3 2-Hidroksietil Agaroz hazırlanması 1.

1. Temiz ve kuru bir 100 ml'lik cam şişe içine, damıtılmış su, 30 ml, ardından 2-hidroksietil agaroz (Agaroz VII) 0.9 g.
2. 15 saniye hafifçe için karışım girdap mikrodalga. Agaroz tozu tamamen eriyene kadar bu adımı en az üç kez daha tekrarlayın.
3. 15 dakika için çözelti içeren bir şişe otoklava.
4. Agaroz çözüm daha kullanımdan önce oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Oda sıcaklığında çözelti saklayın.

Alt Katman 2. Hazırlık:% 0.6 Agaroz Jel

1. Tutarken pipet katılaşmasını agaroz önlemek için 5 ml 37 ° C kuluçka makinesi içinde 10 mi pipetler önceden sıcak birçok.
2. Kısmen şişe kapağı ve mikrodalga 15 saniye önceden yapılmış% 3 2-hidroksietil agaroz çözümü gevşetin. Daha sonra, yumuşak bir 15 sn için çözelti ve mikrodalga girdap. DİKKAT: Agaro dönen dikkatli olunse çözümü çözüm havaya maruz ve yayılabilir zaman yükselir çünkü.
3. Şişede kalan katı jel, birkaç saniye mikrodalga varsa.
4. Erken katılaşmasını agaroz çözüm önlemek için bir sonraki adımları sırasında 45 ° C su banyosunda agaroz solüsyon içeren şişe tutun.
5. 37 ° C su banyosu içinde sıcak MCF10DCIS ortamı. Not: MCF10DCIS ortam DMEM / F12,% 5 at serumu,% 5 penisilin streptomisin oluşur.
6. Aktarım steril 50 ml konik bir tüp içine önceden ısıtılmış pipetler kullanılarak% 3 agaroz çözeltisi 3 mi.
7. Hemen sıcak MCF10DCIS medya 12 ml ekleyin ve hafifçe medya ile agaroz karıştırmak için konik tüp ters. Bu koloni sonradan sayım engel olacak herhangi bir kabarcıkları oluşturmak için çalışın.
8. Yavaşça hava kabarcıklarını oluşturucu olmayan bir 6-yuvalı kültür plakasının her bir oyuğuna, bu karışım 2 ml ekleyin.
9. 6-çukurlu kültür plakası Horizonta inkübelly, 1 saat boyunca 4 ° C 'de, düz bir yüzeye karışımın sertleşmesine izin vermek.
10. Karışım katılaşmasından sonra, 30 dakika boyunca 37 ° C inkübatör içine plaka yerleştirin. alt tabaka artık kullanıma hazırdır.

Hücre içeren katmanın 3. hazırlanması:% 0.3 agaroz jel

1. Trypsinize MCF10DCIS hücreler 4 x 10 ⁴ / ml'lik bir hücre konsantrasyonuna seyreltilmesi ve.
2. Bir steril 50 ml konik bir tüp içine önceden ısıtılmış pipetler ve transferi ile% 3 agaroz 2 ml alın.
3. Hemen konik tüp MCF10DCIS medya 8 ml ekleyin ve hafifçe medya ile agaroz karıştırmak için ters. Herhangi kabarcıkları oluşturan kaçının.
4. (0 uM (DMSO) ya da 1 uM) MCF10DCIS hücreleri (4 x 10 ⁴ / ml) 2 ml alın ve BB-CLA ile tedavi edilir.
5. Bir 1: 1 seyreltme,% 0.6 agaroz ile hücrelerin karışımı.
6. Hücre-agaroz karışımının 1 ml alın ve yavaşça 6 oyuklu kültür p alt tabakanın üzerine eklemekGeç (2 x 10 ⁴ hücre / ml).
7. Üst tabaka katılaşmaya izin vermek için en az 15 dakika boyunca 4 ° C 'de, düz bir yüzeye yatay 6 oyuklu kültür plakasına yerleştirin.
8. Karışım katılaşmasından sonra, besleme tabakanın ilave edilmeden önce bir hafta boyunca 37 ° C inkübatör içine plaka yerleştirin.

Besleyici Katman 4. Hazırlanması:% 0.3 Agaroz Jel

1. Mikrodalga 15 saniye önceden yapılmış% 3 2-Hidroksietil agaroz çözüm. yavaşça başka bir 15 saniye için çözüm ve mikrodalga girdap.
2. 45 ° C su banyosu içinde agaroz çözelti şişe dengelenmesi.
3. 37 ° C su banyosunda MCF10DCIS medyayı ısıtın.
4. 50 ml konik bir tüp içine, sıcak MCF10DCIS ortam 9 ml% 3 agaroz çözeltisi 1 ml karıştırın ve yavaşça ortam ile agaroz karıştırmak için ters. Hava kabarcıkları oluşturarak kaçının.
5. BB-CLA ile karışım (0 uM (DMSO) ya da 1 uM) tedavi edin.
6. Yavaşça için olmayan (bu karışıma 1 ml ekleMing alt ve yumuşak tabakalar ihtiva eden 6 oyuklu kültür plakasının her oyuğuna) kabarcıklar.
7. Karışım, katılaşmaya izin vermek için en az 15 dakika boyunca 4 ° C 'de, düz bir yüzeye yatay 6 oyuklu kültür plakasına yerleştirin.
8. Besleyici tabakası katılaşır sonra, 37 ° C inkübatör içine plaka yerleştirin.
9. Koloni oluşumu gözlenir kadar yeni medya ile hücreleri doldurmak için mevcut besleyici tabakası üzerine% 0.3 agaroz / orta / işleme çözeltisinin 1 ml kaplayan bu beslenme prosedürü haftalık tekrarlayın. Not: Agar yumuşak ve besleyici tabakalar bundan dolayı, besleyici tabaka ile ilgili ilave besinler kolaylıkla hücreler ulaşmak için hücre içeren bir tabaka halinde yayılır, çok yumuşak ve.

5. Veri Toplama

1. Yumuşak agar içinde hücre büyümesinin 2.5 hafta sonra, her bir göze, bir ışık mikroskobu kullanarak koloni sayısı. Ölçümü kolaylaştırmak için, bir şeffaflık üzerine ızgara yazdırmak ve ızgara takmak6-plaka hücreleri sayma sırasında nerede bulmanıza yardımcı olmak için. (Her koloninin çapı ile miktarı gibi) koloni büyüklüğü değişebilir olduğundan, atılır olan koloniler belirlemek için bir referans koloni boyutunu önceden tanımlamak. Örneğin, 70 mikron ya da veri analizinde büyük bir koloni boyutları içerir.
2. Daha fazla koloni oluşumunu ve gelecekteki sayım önlemek için 4 ° C'de örnekleri saklayın. Kurumasını önlemek için jeller Parafilm ile 6-kuyu kültür plaka Seal.

yumuşak agar koloni oluşturma deneyi kanser hücrelerinin tümör oluşum nedenlerinin belgeleyen çok geniş bir uygulama aralığı için kullanılabilir. Bu tekniğin önemli bir avantajı, yan-katı bir matris seçici bir ankrajdan bağımsız bir şekilde prolifere olabilir hücrelerin büyümesini yana olmasıdır. Bu özellik esas olarak, kanser hücreleri tarafından değil, normal hücreler tarafından sergilenir. Öncelikle ilaçlar ile tümör büyüme inhibisyonu etkinliğini test etmek için, meme kanseri hücrelerinin bedenindeki, aşırı ekspresyonu veya PADI genleri de dahil olmak üzere ilgi eden genler, tükenmesi etkisini test etmek için bu tekniği kullanır. Burada, PADI2-aşırı ifade MCF10DCIS hücrelerinin tümörijenik inhibisyonu BB-CLA etkisi değerlendirildi (Şekil 1 ve 2).

Sonuçlar BB-CLA anlamlı MCF10DCIS hücresinden türetilmiş koloni oluşumunu önlediğini de gösterir. Şekil 3 gösterir, bu PADI inhibitörünün varlığında, t DMSO kontrolü ile karşılaştırıldığında burada her iki koloni oluşumu ve koloni boyutunda bir azalma oldu. [Not:. BB-CLA DMSO içinde çözündürüldü ve bu nedenle, DMSO, bir kontrol olarak kullanılmıştır] bb-CLA için koloni büyüklüğü MCF10DCIS hücreler 100 um, 20 ila ağırlıklı olan tedavi sırasında DMSO için koloni büyüklüğü Kontrol büyüme 2,5 hafta sonra 70 mikron 150 daha geniş bir yelpazede sergiledi.

70 um'den daha büyük koloniler sayıldı ve (Şekil 4) kullanılarak analiz edilmiştir. Sadece 1967 koloniler yumuşak agar kültürü 2,5 hafta sonra BB-CLA tedavi edilen grupta görüldü ise DMSO kontrol 3536 kolonilerin ortalama vardı. Bu PADI inhibitörü ile göğüs kanseri hücrelerinin önemli bir tümör oluşturucu inhibisyon (MCF10DCIS hücreleri) gösteren, 1 uM BB-CLA varlığında ortalama koloni oluşumu bir% 44 azalmayı temsil etmektedir.

pload / 52727 / 52727fig1.jpg "/>
BB-CLA Şekil 1. Kimyasal Yapısı.

Yumuşak Agar koloni oluşturma deneyi için Protokol Şekil 2. şematik genel bir bakış. 6 oyuklu kültür plakalarının her bir kuyu önce% 0.6 agaroz jeli (alt katman) ile kaplandı. MCF10DCIS hücreleri ve BB-CLA inhibitörü (1 uM) veya DMSO (kontrol) ya da ihtiva eden bir% 0.3 agaroz jel karışımı daha sonra% 0.6 jel üzerine tabaka halinde serilir. Haftada bir kere,% 0.3 agaroz jel karışımı, (BB-CLA ihtiva eder), yumuşak tabakanın üzerine eklendi. 2 ila 4 hafta sonra, koloni oluşumu gözlendi ve veri analizi için sayıldı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

BB-CLA-muamele MCF10DCIS Hücreler içinde koloni oluşumu Şekil 3. Çıkan. MCF10DCIS hücreler BB-CLA (0 uM DMSO) varlığında (1 uM BB-CLA) veya yokluğunda, yumuşak agar içinde büyütülmüştür. 2.5 hafta, koloniler düşük büyütme görüntüleri için ters bir mikroskop ve yüksek büyütme görüntüler için ışık mikroskobu kullanılarak görüntülenmiştir edildikten sonra. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

MCF10DCIS koloni sayısının Şekil 4. Niceleme BB-CLA tedavisi. MCF10DCIS hücreler BB-CLA (0 uM (DMSO) ya da 1 uM BB-CLA) farklı konsantrasyonlarda yumuşak agar içinde yetiştirilmiştir sonra. 2.5 hafta sonra ayrı ayrı koloniler, daha büyük bir inciBir 70 um sayılmıştır. Deneyler 4 kez tekrarlandı (n = 4). Kontrol ve tedavi örnekler arasında, toplam hücre sayısı farkın istatistiksel olarak anlamlı iki örneklem Student t-testi (* p <0.005) ile belirlenmiştir.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.