Vasküler hücre fonksiyonu, hücre içi habercilerin aktivitesine bağlıdır. Burada tarif edilen, izole bir aortun bireysel endotel ve düz kas hücrelerinde fizyolojik ve farmakolojik uyaranlara yanıt olarak hücre içi kalsiyum ve nitrik oksit seviyelerinin ölçülmesine izin veren bir ex vivo iki foton görüntüleme yöntemidir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hücre içi Ca İki foton Görüntüleme
Bu makalede
Özet
Özet
Kalsiyum vasküler dokularda çok sayıda fizyolojik süreçte önemli bir düzenleyicidir. En endotel ve düz kas fonksiyonları yüksek hücre içi kalsiyum ([Ca2 +] i) ve nitrik oksit (NO) değişikliklere bağlıdır. Amacıyla iki foton mikroskobu ile boyaları [Ca 2 +] i, NO ve alt molekülleri vazokonstriktörlere ve vazodilatörler yanıt olarak bir kan damarı tarafından işlenir, biz kalsiyum etiketleme geçerli yeni bir teknik (ya da NO-etiketleme) geliştirdi nasıl anlamak için İzole kan damarlarındaki kalsiyum taşıma (veya NO üretimini) ölçmek için. Burada anlatılan sıçan, etiket kalsiyum veya HAYIR endotel veya düz kas hücrelerinin içinde aort izole ve görüntü kalsiyum geçici (veya HAYIR üretim) fizyolojik aşağıdaki iki foton mikroskop kullanarak nasıl gösterir bir ayrıntılı adım-adım prosedürü ya da farmakolojik uyaranlar. yöntemi kullanmanın yararları çok yönlüdür: 1) aynı anda mümkündürly endotel hücreleri ve farklı uyarıcılara tepki olarak, düz kas hücreleri, hem de geçici kalsiyum ölçülmesi; 2) görüntü, endotelyal hücreler ve nativ ortamda düz kas hücrelerinin bir sağlar; 3) Bu yöntem hücre içi kalsiyum veya HAYIR değişiklikler ve hassas ölçümler için yüksek çözünürlüklü görüntüler üretir karşı çok hassastır; ve 4) tarif edilen yaklaşımı, bu reaktif oksijen türleri gibi diğer moleküller, ölçümü için uygulanabilir. Özetle, iki foton lazer emisyon mikroskobu uygulama geçici kalsiyum ve izole bir kan damarı endotel ve düz kas hücrelerinde NO üretimini yüksek kalitede nicel verilerin sağlanan ve vasküler fonksiyonları düzenleyen mekanizmaların anlayışımızı teşvik etmiştir izlemek için.
Giriş
Kalsiyum, endotel ve düz kas hücreleri gibi vasküler hücreler içinde temel bir ikinci mesajcı olan. Bu vasküler kasılma için birincil uyaran ve endotel içinde YOK nesil yoluyla etkileri de dahil olmak üzere, vasküler dilatasyon önemli bir rol oynamaktadır. Nedeniyle görüntüleme teknolojilerinin sınırlamaları nedeniyle, sağlam geminin içinde kalsiyum işleme gözlemlemek neredeyse imkansız olmuştur. İki foton görüntüleme sistemleri ve yeni kalsiyum yaratılması veya HAYIR etiketleme boyalarının geliştirilmesi, kalsiyum dinamikleri ve damarsal içinde NO üretimini anlamaya başlamak için yeterli derinlik ve çözünürlükte görüntü mümkün kılar.
İki foton mikroskop son zamanlarda doku, organ ve çünkü derinden düşük eşiğe ve yüksek sinyal duyarlılığı ile dokulara nüfuz üstün yeteneği bile tüm hayvan çalışmalarında uygulanmıştır. 1,2 illuminat iki foton uyarma dar spektrumluiyon odak noktası olan ve olmayan descanned dedektörlerin kullanımı iki foton mikroskopi geleneksel konfokal mikroskobu üstündür nedenleri vardır. Mikroskopisi nedeniyle oto-floresan ve konfokal iğne deliği içine out-of-focus ışık saçılması için gerekli doku derinlikte yüksek kaliteli görüntüler üretemez. Sonuç olarak, [Ca2 +] i sinyal ölçmek için iki foton mikroskopu kullanılarak bir yöntem ve yüksek bir çözünürlüğe ve düşük sinyal-gürültü oranına sahip olduğu gibi, tek tek kan taşıyıcı hücrelerin NO üretimi geliştirdik.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Aşağıda açıklanan deney prosedürleri Wisconsin Tıp Koleji Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi National Institutes uyarınca idi.
Sıçan Aort 1. İzolasyonu
- Izofluran (% 5 indüksiyon,% 1.5 2.5 bakımı) veya başka bir IACUC ile sıçan uyutmak yöntemi onayladı.
- Bir yatar pozisyonda sıçan yerleştirin. Karın organları açığa çıkarmak amacıyla, deri ve deri altı karın dokusu sayesinde küçük bir ventral orta hat kesi yapmak. Şekil 1 'de gösterildiği gibi kullanılması gazlı bez yavaşça aort ve vena cava açığa çıkarmak için bağırsak saptırır.
- Kısaca, bağ dokusu ve vena kava gelen aort teşrih künt. Böbrek mümkün olduğunca yakın aort kapalı kravat, dikiş kullanma. Aort 2 cm ve 15 ml konik tu yerleştirin - yaklaşık 1 teşrihNormal fizyolojik tuz çözeltisi içeren olabilir (PSS; mM olarak: 140 NaCl, 1.2 MgCl2, 2 CaCl2, 4.5 KCI, 6 Glikoz, 10 HEPES), buz üzerinde.
- Aort izole edildikten sonra, onaylanmış IACUC protokollere göre hayvan euthanize. Olmayan tüm yaşam bitiminde prosedürleri hayvanın insani ölümünü sağlamak için pnömotoraks uyaran torakotomi ile derinden anestezi hayvanları euthanize. 3
- Bir diseksiyon mikroskop kullanarak, forseps ince uçlu ve microscissors aort kapalı yağ ve bağ dokusu teşrih. Aort temiz kez uzunlamasına aort kesip daha sonra buz üzerinde PSS yerleştirin.
2. Boya Yükleme ve Kuluçka
- Pipet alüminyum folyo ile kaplanmış olan tek tek 500 ul tüplere, DMSO-bazlı çözelti içinde temin edilmektedir 1mM Fluo-04:00 boya, 7 ul. Zamanla boya özelliklerini korumak için -20 ˚C de dondurucuda saklayın. Not: Bu yüzden aliquotedmel çözümler, en az altı ay stabil olmalıdır.
- Kullanımdan önce, boya çözeltileri açmadan önce oda sıcaklığına ısınmaya bırakın. Kullanımdan hemen önce çalışan çözümleri hazırlayın. Daha sonra kullanılmak üzere sulandırılmış reaktifi tutmayın.
- Bir kalsiyum içeren PSS 450 ul DMSO çözeltisi içinde çözülmüştür hazır 1 mM Fluo-04:00 boya 7 ul ekleyin. Asetoksimetil (AM) esterleri dağıtmak yardımcı ve kalsiyum boya yükleme iyileştirmek için yükleme kokteyli olmayan DMSO bazlı% 10 Pluronic Asit çözeltisi 40 ul ekleyin.
- 1 saat boyunca (as 2.3 açıklanmıştır) yükleme kokteyli içeren 500 ul tüpler içine disseke aorta yerleştirin. Oda sıcaklığında bir döner çalkalayıcı üzerinde folyo ve yer ile tüm tüpler örtün.
- Damar NO üretimini izlemek için DAF-FM diasetat boya kullanın. 450 ul PSS, 40 ul pluronik asit ve 10 mM DAF-FM diasetat 5 ul ihtiva eden bir çözelti içinde aorta inkübe edin. (2.3 açıklanmıştır) kalsiyum kuluçka protokolüne benzer, aort yerleştirinoda sıcaklığında Sonraki 30 dakika, ardından 4 ° C'de 30 dakika için bir döner sallayıcı üzerinde folyo ve yerine kaplı NO boya çözeltisini ihtiva eden bir 500 ul bir tüp içinde.
- NO üretimi ölçüldüğünde, Şekil 4B'de gösterildiği gibi, bir kontrol olarak NO üretimini engellemek için, endotel NO sentaz engelleyici, L-NAME kullanın. Bu işlem için, (oda sıcaklığında) inkübasyon son 30 dakika süreyle (2.5 de anlatıldığı gibi) kokteyl 100 nM L-NAME ekleyin.
3. Lazer Tarama İki foton Mikroskopi Protokolü
- Dışı boya kaldırmak için temiz PSS 3 kez - 1 saat inkübasyondan sonra, aorta 2 yıkayın.
- Normal PSS veya Ca 2 + -ücretsiz tampon (deney protokolünde bağlıdır) ya içeren bir silikon kaplı çanak aort aktarın. Silikon ile temas adventisya aşağı silikon kaplama üzerine aorta Pin (yani çanak açılış maruz kalan endotel lümen) μ şeklinde işaretçilerine kullanarak. Alternatif olarak, bir dilim Anchor kullanınızgara veya tutkal dokusunu düzeltmek için.
Not: stres ve olası mekanik eserler, transferi azaltmak ve Ca 2+ -ücretsiz çözüm aort düzeltmek ve 5 beklemek için - deney başlamadan önce 10 dakika. - Peristaltik bir pompa ya da ilaçların, otomatik veya manuel uygulama ya da hücre-dışı çözelti değişen silikon kaplı plakaya bir şırınga bağlayın.
- Dik iki foton mikroskop burun parçasının altında çanak yerleştirin ve yüklemek ve numune üzerinde 25 × (NA 1.05 ve çalışma mesafesi 2 mm) su daldırma objektif lens yerleştirin. Not: Bu özel bir mercek mevcut değilse normal bir amaç ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde sinyal çözünürlüğünü artırabilir, çünkü özellikle iki foton görüntüleme için üretilmiş bir objektif kullanın.
- Yazılımını kullanarak iki foton lazer etkinleştirin (lazer pompa ve açmak için başlar). Dinle 820 nm lazer uyarım.
- Epifloresans kullanarak, aort bulmak ve üzerine objektif odakKaba ayarı kullanarak endotel yüzey.
- Uyarma lazer modu kilitli olmayan descanned dedektörler ilgileniyoruz ve beklenen emisyon spektrumları uygun emisyon filtreleri yüklü olmasını sağlamak, iki foton lazer tarama moduna mikroskop Anahtarı. Not: Burada FV10-MRL / R (495 nM 540) kullanılmıştır.
- Yaklaşık% 5, lazer gücünü kullanarak canlı taramayı başlatmak ve ince endotel hücrelerini görselleştirmek için objektif odak.
Not: Normal PSS inkübe zaman endotel hücreleri güçlü bir floresan sinyal sergileyecek. Gemi, kalsiyum içermeyen tampon maddesi içinde inkübe edilir, bu fark daha zayıf olacaktır. endotelial hücreler açılır aort üst ve düz kas hücreleri, sadece endotel hücreleri (bakınız Şekil 2) aşağıda görülebilir mevcut olacaktır. Kan damarları düz ne de düz kas hücreleri ve endotel hücrelerinin her ikisi de mevcut yerler olacak ne olduğundan. - Hücreler odak olduğunda, mikroskop yazılım programı hızlı tarama modunda sıralı görüntüleri (raster tarama, 1.1 sn kare toplama frekansı ile 512 x 512 piksel pencere) toplamak için. Flu-4:00 floresan paralel olarak, damar daralması değişiklikleri algılamak ve daha iyi deneysel koşullar görselleştirmek için ışıklı görüntüleri bulaşan toplamak.
- Bazal sinyal görüntüleri toplandıktan sonra, harici bir çözelti içinde Ca2 + iyonu konsantrasyonu değiştirmek ya da yavaş yavaş peristaltik pompa görüntüleme sırasında kullanarak farmakolojik uyaran maddeler uygulanır. Yüklenen hücrelerin içindeki floresan sinyal artışı dikkate alınmalıdır.
Not: Endotel hücreler, akış değişikliklere bu nedenle Ca 2+ veya hiçbir sinyal farmakolojik aktivatörleri uygulanmasından önce, düşük laminer uygulamaları ve araç test kullanılması önerilir yanıt. Fluo-4 (Fluo-4 i için ayrışma sabiti yüklü gemiler nM konsantrasyon değerlerine hücre içi kalsiyum yeniden hesaplamak içins 345 nM), flüoresan yoğunluğu, taban çizgisinde ve Genişleme ve MnCI2 eklenmesinden sonra kaydedilebilir. 4
4. Görüntü İşleme ve Hesaplamalar
- Download ve Fiji görüntü işleme paketini yükleyin.
- Fiji görüntü dosyasını açın. İstendiğinde dosyasını içe üzerine, kanallar (iletilen ışık ve florasan sinyali) bölün. Veri analizi için sadece floresan sinyal kullanın.
- Fiji programı kapsamında, analiz sekmesini tıklayın ve araçları seçeneğine gidin. Araçlar seçeneği altında, ROI yöneticisi diyor sekmeyi bulmak ve üzerine tıklayın; Yeni bir pencere açılacaktır.
- Bundan sonra, analiz sekmesi altında ayarlanan ölçümlerine tıklayın. Özel ilgi ölçümleri seçin. Kalsiyum geçici ölçümler için ortalama gri değer seçeneğini kullanın.
- Dairesel iz aracı ile, ilgi alanları (ROI) bölgelerini izlemek ve her R ROI yöneticisi ekranda "eklemek" butonuna tıklayınız başlarOI. Bir kez ilgi tüm hücreleri ROI yöneticisi penceresinde, "daha" sekmesi altında Çoklu Tedbir seçin takip edilmiştir. Bir elektronik tabloya bu ölçümlerin hepsi doğrudan ölçümleri kaydetmek veya kopyalayıp yapıştırın ya unutmayın.
- Açık * .txt dosyası veya Excel Fiji ve yeni bir çalışma sayfasına Kökeni numaraları aktarın. Not: Alternatif olarak, daha fazla analiz için Sigma Plot veya Prism gibi herhangi bir program kullanın.
- Origin programı kapsamında, tüm geçici tepkilerin bir bakış gözlemlemek için Line + Sembol menüsü → Plot kullanın. Tepkisiz hücreleri kaldırın.
- Zaman ölçeği (X ekseni) iz numarasını yeniden hesaplayın, Sütun → Set Sütun Değerlerini kullanın ve (bizim durumumuzda 1,1sn olarak) resim koleksiyonu frekansına iz numarası sütunu çarpın.
- Mean (Y ekseni) ve Standart Hata izleme hesaplamak için seçilen tüm kayıtlar için Satır Analysis → İstatistikleri kullanın. Hücrelerin mevcut grup Line + Sembol → Konu için son Grafik çizilir.
- meaolarak takip n kalsiyum geçici hesaplama açıklanmıştır.
- Kökeni program dahilinde toplam kalsiyum salınımı için, daha sonra, Grafik tıklayın menüsü Analizi → Matematik kullanın → entegre edin. Eğri altında kalan alan toplam ayrılmaz Sonucu giriş görünür.
- (X ekseni geçici yanıt sonuna kadar maksimum aralığı seçin) Analiz → Doğrusal olmayan Curve Fit → Seçiniz Veri Seti: Geçici kinetik için Graph üzerine tıklayın, ardından menüyü kullanabilirsiniz. Bitti → Üstel Çürüme 1 → Seç Fonksiyonu → Montaj başlatın.
Üstel uydurma Grafik penceresinde görüntülenir ve Giriş Sonuç: Not. Elde edilen veriler (değerler) yayımlanan kalsiyum toplam miktarını temsil ve kanalların kinetik geçici yanıt aracılık.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Doğru vasküler fizyoloji (damar genişlemesi ve vazokonstriksiyon) kalsiyum katkısını değerlendirmek için, bir protokol endotel hücreleri ve izole sağlam aortlarından düz kas hücrelerinin hem kalsiyum boyalar yüklemek için tasarlanmıştır. Şekil 1 'de gösterilen kurulmuş, genel deney, izolasyon ve görüntüleme önce kabın hazırlanması için temel strateji gösterir. Kısaca, sıçan aort izolasyonundan sonra, yağ ve bağ dokusu temizlenmeli ve uzunlamasına yarık. açılan aort Daha sonra hafif ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Deneysel Bakış. Daha iyi damar fizyolojisi HAYIR kalsiyum katkısını anlamak ve için, yeni bir yöntem ölçmek için geliştirilen [Ca 2 +] i ve NO düz kas ve izole bozulmamış aorta endotel hücreleri içinde. 1) Mekanik izolasyon ve hazırlık (enzimatik olmayan sindirim) Geminin: Birlikte, bu protokol bu kritik adımlardan oluşur. Optimum fizyolojik kayıtları elde etmek mümkün olduğunca sağlıklı ve sağlam dokuyu tutmak önemlidir. Pluronik asit ile 2) kalsiyum etiketleme boyada inkübasyon veya NO e...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Biz görüntüleme çalışmaları ile yardım için Dr. William Cashdollar ve Wisconsin Kan Araştırma Enstitüsü'nde Kuzeybatı Karşılıklı Vakfı Görüntüleme Merkezi'ni teşekkür ederiz. Biz de bu yazının ve yararlı bir tartışma eleştirel okuma Dr Daria Ilatovskaya teşekkür ederim. Bu çalışma (AS) Sağlık Hibeler HL108880 National Institutes ve (AMG için) DP2-OD008396 tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| DAF-FM | Yaşam Teknolojileri | D-23842 | |
| Fluo-4 | Yaşam Teknolojileri | F14217 | 500 & mikro; l DMSO |
| Pluronic F-68 çözeltisinde | Sigma-Aldrich | P5556 | |
| L-NAME | Tocris | 0665 | |
| Olympus dik mikroskop | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| MaiTai HP DeepSee-OL | Spectra Fizik | Ti: safir lazer 690nm & mdash; 1040nm | |
| Filtreler | Olympus | FV10-MRL / R & nbsp; | 495 ila 540 nm |
| 25 kez; suya daldırma objektif lensi | Olympus | XLPL25XWMP | NA 1.05 ve çalışma mesafesi 2 mm |
| Dilim Ankraj ızgarası | Warner Enstrümanı | SHD-27LH | |
| Diğer temel reaktifler | Sigma-Aldrich |
Kaynaklar
- Molitoris, B. A. Using 2-photon microscopy to understand albuminuria. Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).
- Burford, J. L., et al. Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease. J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).
- Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., et al. Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated. J Vis. Exp. In Press, (2015).
- Zhu, J., et al. Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).
- Endres, B. T., et al. Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).
- Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318, 558-561 (1985).
- Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J. Anat. 215, 682-691 (2009).
- Sathanoori, R., et al. Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4. Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).
- Hall, A. M., Molitoris, B. A. Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury. Physiology. 29, 334-342 (2014).
- Campese, V. M. Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications. Hypertension. 23, 531-550 (1994).
- Cowley, A. W. Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure. Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).
- Flister, M. J., et al. Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12. Hypertension. 60, 942-948 (2012).
- Flister, M. J., et al. Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus. Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).
- Mattson, D. L., et al. Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).
- Rudemiller, N., et al. CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney. Hypertension. 63, 559-564 (2014).
- Flister, M. J., et al. CXM - a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment. Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
