Nörodejeneratif Hastalıkların bir Drosophila Modelinde Tırmanma Kusur Kantitatif Analiz

Summary

Drosophila melanogaster'de nörodejeneratif bozukluklar için bir model olarak optimize edilmiş, ucuz ve güvenilir bir negatif jeotaksi testi sunuyoruz. Hafif lokomotor kusurlara karşı daha hassas olan bu test, potansiyel genetik etkileşimlerin ve ilaç hedeflerinin taranmasına yardımcı olacaktır.

Abstract

Nörodejeneratif hastalıkların kaynaklanan kusurlar Lokomotif subklinik dejenerasyon yıl sonra, hastalığın geç başlangıçlı belirtisi olabilir ve böylece güncel tedavi tedavi stratejileri küratif değildir. Bütün exome sekanslama kullanımı sayesinde, genlerin artan sayıda insan hareket bir rol oynadığı tespit edilmiştir. Bu genlerin tanımlanması rağmen, bu genler, normal lokomotif işleyişi için çok önemlidir kadar bilinmemektedir. Bu nedenle, tedavi edici ilgi yeni hedefler belirlemek için bu genlerin rolünü aydınlatmak için model organizmalar kullanan güvenilir bir tahlil, her zamankinden daha fazla ihtiyaç vardır. Biz daha önce hafif kusurların tespiti için izin verir ve zamanla bu hataları değerlendirmek için yeteneğine sahiptir negatif geotaxis testin bir hassaslaşmış versiyonunu tasarladık. Bir bardak gerçekleştirilir tahlil bir mum bariyer film ile kapatılır silindir, mezun oldu. Eşik mesafesi arttırarak 17.5 c tırmandı içinm biz hafif hareketlilik bozuklukları tespit daha büyük bir duyarlılık gözlemledik 2 dk deneme süresinin artırılması ve. Tahlil maliyetli ve yüksek tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek kapsamlı bir eğitim gerektirmez. Bu hareket kusurları ile Drosophila mutantlar aday ilaçların taranması için mükemmel bir tekniktir yapar.

Introduction

Parkinson hastalığı, amiyotrofik lateral skleroz, kalıtımsal spastik parapleji yıkıcı nörodejeneratif bozukluklar giderek daha kabul edilmektedir. Ne yazık ki, bu nörodejeneratif bozuklukların en işlemler olmaksızın halen devam etmektedir. Bu tür genlerin artan sayıda yol açmıştır bütün exome sıralama olarak genom, tarafsız genetik testlerin yaygın klinik kullanımı, insan lokomotif bozukluklar karışması. Bu ilerlemeye rağmen, erken ve geç aşamalarında patolojik ilerleme, bu hastalıklarda zor kalır. Drosophila kontrollü mekansal ve zamansal bir şekilde gen gereksinimi eğitimi için genetik araçları ile tek sağlar. Buna ek olarak, Drosophila gibi Parkinson ^1, Alzheimer ^2, zihinsel engelli ^3,4 ve diğerleri arasında epilepsi ^5,6 gibi nörolojik durumlar için ilaç tarama yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Amacımız etkili bir maliyet geliştirmektive güvenilir tahlil hala motorun performansında küçük değişiklikleri tespit etmek yeterli duyarlı olacağını yüksek verimli analizi izin verecek.

Drosophila tırmanma davranışı üzerinde genetik mutasyon ve / veya çevresel durumun etkisini ölçmek için kullanılan çeşitli tahliller vardır. Tahlillerin çoğu olumsuz geotaxis veya tırmanma deneyi olarak bilinen tırmanmaya sinekler, doğal eğilim yararlanmak. Benzer ⁷ phototaxis çalışma için kullanılan karşı akım cihazı ayrıca gravitaxis incelemek için kullanılabilir ki 1967 önerdi. O günden bu yana, Ganetsky ⁸ ve diğerleri ^{9 -12} ilk tahlil üzerine inşa etmişlerdir. prensip şişe içinde sinekler bilinen bir dizi yerleştirin ve sinekler şişenin dibine düşmeye neden sert bir yüzeye şiddetle karşı flakon dokunun etmektir. Bu doğuştan gelen bir davranış olduğundan, sinekler yerçekimine karşı flakon üst tırmanmaya çalışacaktır. Bu deney, nicel ve measu olankaç sinekler res bir ayrılan süre içinde flakon üzerinde bir işaretleyici geçmiş tırmandı. Hız yerine sinekler tırmanma toplam sayısının ölçülmesi güvenilir bir parametre haline ve sinekler kriterlerin sayısı ¹³ anlamlı değildi durumlarda kusurları göstermiştir.

Tırmanma deney Parkinson hastalığı ¹⁴ de dahil olmak üzere pek çok nöro-dejeneratif hastalıkların incelenmesinde yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, nörodejenerasyon önceden patolojik çalışmalar ¹⁴ görülür burada lokomotif bozukluklar zamanda ölçemeyebilirler kaydetti. Böylece, geleneksel testin kullanılması hastalığın patogenezinde erken aşamalarında incelemek için yeteneğini sınırlayabilir. patoloji sonraki aşamalarında lokomotif kusurların görünümünü olan ilerleme tam kurtarılması için çok gelişmiş bir hastalık yansıtabilir.

Bu geleneksel tırmanma testinin duyarlılığı ile potansiyel bir sorun ortaya çıkarmaktadır. gelenek potansiyel yetersizlikHafif lokomotif kusurları tespit etmek için tahlil tırmanma arası sinekler tırmanmaya gerekli olan yüksekliği isnat edilebilir. Geleneksel deneyi ^15,16 ölçer sineklerin sayısı başarılı bir şekilde 20 saniye için 10 içinde 2-5 cm'lik bir yüksekliğe tırmanmaya.

Protocol

Drosophila melanogaster Araştırma Alberta araştırma kurallarına Üniversitesi ile uyumlu idi.

1. Fly Koleksiyonu

1. Gıda ihtiva eden bir 25 mm x 95 mm toplama şişe içinde _{CO2 (g)} anesthetization ve yer kullanarak 20 sinekler toplayın.
2. Yatay sinekler içeren Mağaza şişeler şişe dibinde birikebilir herhangi sıvılarda sinekleri yakalama önlemek için.
3. Yaklaşık 15 saat için bir kuluçka makinesi içinde% 45 nemde 22 ° C sıcaklıkta en az 21 saat süre ile sinekler inkübe edin. 12 saat ışık ile kuluçka ayarlayın: koyu döngüsü.

2. Tırmanma Deneyi

1. Sonraki sabah, 250 ml'lik bir cam içine tek bir tüpten silindire 20 sinekler aktarın. O sürekli günlük tutmak için silindirin pozisyonunu işaretleyin. Genotipleri arasındaki çapraz bulaşmayı önlemek için genotip başına bir cam silindir kullanın. Her deney ve RO sonunda yıkayıngenotipleri arasında onları tate.
   1. Sıcaklık ve 22 ° C ve% 40 nem oranında sırasıyla (vizyon potansiyel kusur varsa veya kırmızı ışık) ortam ışığında deneyler. Sirkadiyen ritim şaşırtmak önlemek için, her zaman günün aynı anda deneyleri.
2. Bir bariyer film (balmumu filmi) bir sinekler kaçmasını önlemek için (Şekil 2) ile, silindirin üst mühür.
3. Bir tripod üzerinde video kamera ayarlayın. 250 ml 190 ml hattında odaklı kamera silindir (17.5 cm) mezun oldu.
4. Silindirin dibinde ve gıda şişeleri ölü sinekler sayısını. Mortalite olarak bu numarayı kaydedin.
5. Çok hafif, iç taban yüzeyine sinekler yerinden yeteri kadar kuvvet ile art arda kapalı hücreli köpük ped karşı silindir dokunun. Kamerada kayıt basın diğer elinizi kullanarak 10 kez - 5 dokunun.
6. Kamerada "Kaydet" düğmesine basın.
7. Vid başlateo kamera kayıt ve ayrı olmayan ritmik desen silindire altı kez dokunun.
8. Sinekler en son aday andan itibaren 2 dakika süreyle her deneme Davranış ve seçilen her zaman noktasında 17.5 cm (190 ml) (her 10 sn ölçmek) yüksekliğini geçen sinekler sayısını kaydedin. Not: silindir üzerinde işaretleme ml çapına bağlı olarak bir silindir modeli diğerine değişecektir. Hatayı önlemek için, kullanılan her silindir üzerinde yüksekliğini ölçmek.
9. Deneme sona erdikten sonra,% 95 etanol sinekler atmayın.
10. Tüm çoğaltır taze sinekler her zaman test edilmiştir yineleyerek 2,1-2,9 adımları.
    Not: 5 suret mutasyon hareket yeteneği üzerindeki güçlü bir etkiye sahip olan yeterli olabilir, ancak, 20 sinek (200 sinekler) 10 biyolojik çoğaltır küçük farklılıkları tespit etmek için önerilmektedir.
11. Deneyin tamamlanmasından sonra, laboratuvar bulaşık makinesi ve kuru O'da silindir yıkama / N yeniden kullanılır.

3. Analiz

1. Analyher ze videoları deneme sinek. Her 10 sn, hedef hattı geçmesi sineklerin toplam sayısını kaydedin.
   1. Bir sinek geri aşağı tırmanıyor ya düşerse, -1 olarak sinek ve kayıt geri aşağı tırmandı ya düştü anında aynı sayı olarak hedef çizgisini sonraki sinek sayısı. ^15. sinek hedef çizgisinin altına düşerse, örneğin, bir sonraki sinek 15 ^inci sinek ve 16 ^inci olarak kabul edilir hattı (16 ^inci sinek) geçmeye.
2. Deneme kalır sinekler sayısını elde etmek için sinekler (20) toplam sayısından mortalite çıkarma. Her zaman noktasında, hedef hattının üzerinde uçar fraksiyonu elde edilir.
3. Her bir zaman noktasında her bir yüzde çizilir (bkz Şekil 3).
4. 120 sn veri noktasında performansını analiz ve 2 grup mevcut olduğunda veya ANOVA ve Bonferroni değişiklik ile çoklu karşılaştırmalar için bir post-testi (planlı ve plansız co Tukey için student t-testi gerçekleştirinmparisons). Kolmogorov-Smirnov ¹⁷ de normallik ve eşit varyans tespit etmek için yapılır ama aynı zamanda kontrol mutant grubun dağılımlarını karşılaştırmak sınar.
5. Yaşlanma üzerinde veri sunmak ilerici bir açığı (Şekil 4) olup olmadığını görmek için farklı yaşlardaki sinekler 120 sn (2 gün, 1 hafta, 2 hafta) tırmanma sinekler yüzdesini arsa için.

Results

Tırmanma güçlü ve tekrarlanabilir bir davranıştır. (- 30 sn 25) Gerçekten de, bir gün eski vahşi tip sinekler hızla hedef mesafesi tırmanma performansı ulaşır. Mutant sinekler hedefe tırmanmaya yetersizlik tamamlamak için hafif (ya da gecikmiş) için performans bir dizi sunuyoruz. Biz iki farklı mutant allel burada bunu göstermektedir. Birincisi Spastin geni (kaplıcalar ^{5.75) 18} tam bir silinmesi ile neden olduğu gen Spastin ciddi bir allel. Bu hat (kaplıca TM6b ile ^5.75) 'de bir gün eski sinek bile...

Discussion

Drosophila önce Parkinson hastalığı ¹⁴ ve diğer nörodejeneratif koşulların ^1,2 mükemmel bir modeli olduğu kanıtlanmıştır. Drosophila uygun genetik araçlar ek olarak, kendi genomu yüksek nörolojik bozuklukların ¹⁹ katılan genler için muhafaza edilir. (Bütün exome sıralama dahil) genom genetik tarama yöntemlerinin gelişi insan hareketi bozuklukları ile ilişkili aday genlerin büyük bir listesini sunmak için devam etmesi muhtemeldir. Bu durumlar için tedavilerin geliştirilm...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila stokları			Stoklar, deneylere bağlı olarak seçilir. Sineklerin çok statik veya çok ıslak olmasını önlemek için odadaki ve kuvözdeki sıcaklık ve nem kontrol edilmeli ve tutarlı olmalıdır.
Video kamera			Herhangi bir dijital video kamera işinizi görecektir. Yakın nesneye odaklanabildiklerinden emin olun.
Dereceli silindir	Kimble	20028W	Farklı dereceli silindir modelleri farklı çaplara sahip olabilir. Bu nedenle yüksekliği ölçmek önemlidir.
Bilgisayar			Herhangi bir model yapacak. Bilgisayarı, sineklerin tırmanışını izlemek ve her zaman noktasındaki sinek sayısını kaydetmek için kullandık.