Toksik Kimyasalların Maruz sonra Endotel Hücre Göç Değerlendirilmesi

Özet

Erken endotel hücre (EEC) göçünün araştırılması, bazı hastalıkların patofizyolojisini anlamak ve terapötik müdahale için potansiyel olarak yeni stratejiler belirlemek için önemlidir. Aşağıdaki protokol, EEC'nin araştırılması için uyarlanmış hücre göçünü değerlendirmek için teknikleri açıklamaktadır.

Özet

(Kükürt ve azot hardalları gibi alkilleyici kimyasal savaş ajanları dahil) kimyasal maddelere maruz kalma yara iyileşmesi bozukluğu gibi klinik belirtiler bir bolluk neden olur. Yara iyileşmesinin fizyolojik süreç oldukça karmaşıktır. Ya vaskülojenez yoluyla (roman oluşumu) veya anjiyojenezi (mevcut gemilerin filizlenmesi) - granülasyon dokusu oluşumu bir ön yara kapanması ile sonuçlanan ve yeni kılcal kan damarlarının ağını sağlayan bu süreçte önemli bir adımdır. Hem vasculo- ve anjiyojenez endotel hücrelerinin fonksiyonel yönelik geçiş gerektirmektedir. Böylece, erken endotel hücre (AET) göç soruşturma potansiyel terapötik müdahale için yeni stratejiler belirlemek bozuklukları şifa kimyasal kaynaklı yara patofizyolojisi anlamak ve önemlidir.

Biz ajan poz alkilleyici sonra bozulmuş yara iyileşmesi değerlendirildi ve tr için potansiyel aday bileşikler testeatment. Bu protokolde belirtilen tekniklerin bir dizi kullanılabilir. Modifiye Boyden odası kantitatif AET'nin kemokinezinin açıklanmıştır araştırmak. Ayrıca, niteliksel göç değerlendirmek için iz analizi ile birlikte tahlil yara iyileşmesi kullanımı gösterilmiştir. Son olarak, biz rahatsız hücre göçünün altında yatan mekanizmaları belirlemek için mitokondriyal membran potansiyelinin araştırılması için floresan boya TMRM kullanımını göstermek. Aşağıdaki protokol AET soruşturma için adapte edilmiş temel teknikleri anlatılmaktadır.

Giriş

Hücre göçü deri hasarı sonrasında gelişme, çeşitli hastalıklar ve yara iyileşmesi dahil olmak üzere, pek çok fizyolojik ve patofizyolojik işlemlerde önemlidir.

Cilt hasarı takiben iltihap hasarlı veya nekrotik doku ve granülasyon sürücüleri ön yara kapanması kaldırır ve vaskülojenez yoluyla yeni kılcal bir ağ oluşumunu (roman oluşumu) veya anjiyojenezi (mevcut veziküllerin filizlenme) ^1-3 verir. Hem vasculo- ve anjiyojenez endotel hücrelerinin göçünü gerektirir. kan damarlarının artan ağ nihai olarak keratinizasyon tabi keratinositlerin çoğalan oksijen ve besin taşımak için gerekli olan, yeni bir epitel oluşturur ve yara kapanmasını sağlar.

Endotel hücrelerinin Engelliler göç bozukluğu ^4,5 yara iyileşmesi altta yatan nedenidir. Erken endotelyal hücrelerin Dolayısıyla, yöntem değerlendirmek için geçiş pathophysiol keşfetmek için gerekli olanhücre göçü bozukluklarının ogy ve terapötik müdahale için yeni stratejiler belirlemek için.

Alkile edici maddeler (örneğin, kükürt ve azot hardalları) dermal maruz bozukluğu ⁶ yara iyileşme neden olur. Bu tür bileşikler nedeniyle siyasi istikrarsız bölgeler ve nispeten basit sentez mevcut stokları güçlü endişe nedeni, 20. yüzyılda çeşitli çatışmalarda kimyasal savaş maddeleri olarak kullanılan ve devam edildi. Sülfür, hardal, ilk 1822 sentezlendi rağmen, SM maruz moleküler ve klinik patoloji detaylı olarak anlaşılamamıştır SM maruz kalma bir antidot saptanmıştır.

Pek çok çalışma, anlamak ve SM maruz kaldıktan sonra bozuk yara iyileşmesi model ve bu etki ayırma yeteneğine potansiyel aday bileşikler test etmek için gerçekleştirilmiştir. Schmidt ve ark. (2009), klorambusil etkisini MM SM benzer özelliklere sahip bir alkilleme bileşiği testse embriyoid vücut modelleri ve damar oluşumunda ⁷ dramatik, bazen% 99'dan fazla azalma bulundu. Bu olumsuz etki, en, fizyolojik koşullar altında, proliferasyon ve vasküler endotel öncü hücrelerin göç hakim olduğu bir gelişme aşamasında belirgindir. Bu nedenle, bu hücreler, alkile edici maddeler, özellikle duyarlı olduğu tespit edilmiştir. Steinritz ve ark., (2010), fare embriyoit vücut modellerinde ve özellikle SM toksisitesini azaltmak için yetenekleri açısından özellikle, N-asetilsistein (NAC), ve alfa linolenik asit (ALA), reaktif oksijen türlerinin (ROS), temizleyicileridir test damar oluşumunu ⁸ geri yükleme. Geçici koruyucu etkilerinin aşırı ROS oluşumu yara iyileşmesi üzerine SM olumsuz etkilerine katkıda muhtemel olduğunu belirten gözlendi. Bu etkiler kalıcı değildir ve iki aday bileşikler, uzun vadede ⁸ damar oluşumu ve yara iyileşmesini geri yeteneğine sahip olmayabilir. However, bu deneyler, hücre göçü soruşturma izin vermedi karmaşık bir 3D modelinde yürütülmüştür. Böylece, sonradan damar oluşumu ⁹ sürecinde önemli bir role sahip EEC hücre göçü üzerindeki yararlı etkileri NAC ve ALA test edilmiştir.

Ayrıca, hücre kutup hücre göçü için gerekli olduğunu kanıtlar vardır. ROS oluşumuna yol açan Mitokondriyal işlev bozukluğu, hücre polarite bozduğu gösterilmiştir ve bu nedenle olumsuz hücre göçü etkileyebilir. Bu nedenle, mitokondriyal fonksiyon açısından canlı hücre görüntüleme uygulandı ve ROS temizleyicilerin etkileri incelenmiştir. Aşağıdaki protokol EEC, Boyden odasının deneyi, hücre izleme analizleri ayrıntılı olarak mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi için TMRM kullanımı dahil olmak üzere deney yara iyileşmesi kültivasyonu için genel şartları tarif eder. AET ekimi ve göç için deneysel protokollerin önemli yönleri vurgulanır.

Protokol

Aşağıdaki protokol, erken endotelyal hücre göçü araştırılması için teknikleri açıklar. vasküler endotelyal hücrelerin uygun bir kültür endotelyal fenotipin uygun çoğalması ve bakım sağlamak için jelatin ile hücre kültürü şişelerinde ön-kaplama gerektirir.

Hücre kültürü şişeleri 1. Ön kaplama

1. % 0.1 bir son konsantrasyona kadar, 0.1 M PBS içinde jelatin çözülür.
2. (Ayrıntılar belli otoklav talimatlara bakın) sıvı otoklav için parametreleri ile çözüm otoklavlayın.
3. Steril hücre kültürü şişesine (a T25 hücre kültürü şişesine örneğin, en azından 5 mi) otoklava jelatin solüsyonu yeterli hacim.
4. Bir inkübatör içine şişeler aktarın (37 ° C,% 5 _CO2 gerekli değildir ancak müdahale etmez), en az 30 dakika karıştırıldı.
5. Kalan jelatin çözüm çıkarın. Daha sonra önceden kaplanmış şişeler kullanın (bkz hücre ekimi) ya da skullanılıncaya kadar steril şartlar altında yırtıldı.

Erken Endotel hücrelerinin 2. Hücre Yetiştiriciliği

Not: daha önce tarif edildiği gibi ^10,11 Embriyonik kök hücre kaynaklı erken endotel hücreleri (EEC) PECAM-1 pozitif hücre fraksiyonunun, manyetik aktive edilen hücre sınıflandırma ile farklılaşmış fare embriyoid gövdelerinden elde edilmiştir.

1. DMEM jelatin kaplı hücre kültür çanakları üzerinde Kültür EEC% 15 FCS, 50 U / ml penisilin, 50 u ile takviye / ml streptomisin, 200 uM L-glutamin, 100 uM beta-merkaptoetanol ve% 1 temel olmayan amino asitler yer alır. Steril koşullar altında hücrelerin taşıyınız. 37 ° C'de% 5 _CO2 ile hücreleri yetiştirmek ve% 95 nem alt izdiham (maks.% 80) kadar.
2. 5 oranında: alt izdiham, 1 hücreleri bölmek. Not: endotelyal hücrelerin Müfreze kritik bir adımdır.
   1. RT Accutase ile hücreleri Hasat. Ortamı çıkarın PBS ile yıkayın ve 25 cm başına Accutase 1 ml ekleyin ^2.
   2. Hücreler müstakil kadar 2-10 dakika boyunca oda sıcaklığında balon inkübe edin. Hücreleri Dağılın ve istenen uygulama aktarabilirsiniz. Not: Accutase kimyasal nötralizasyon serpilmiş hücreleri, 37 ° C'de inkübatör içinde depolanan zaman gerçekleşir olarak gerekli değildir. Ancak, Accutase aktivite de DMEM içeren FCS ekleyerek azaltılabilir.

3. Boyden Odası

Not: Boyden haznesi Testler 8 um gözenek büyüklüğüne sahip ışık geçirmeyen, polietilen tereftalat ekleme sistemi kullanılarak gerçekleştirilir.

1. Ön kaplama, en az 30 dakika boyunca 0.1 M PBS içinde çözülmüş,% 0.1 jelatin, 500 ul ilave edilerek filtre ekler (böylece bir Boyden haznesi oluşturmak hücre kültürü kuyu içinde bu uyum).
2. Hücreler toksik kimyasallara maruz kalması ise, hücre hasat öncesi spesifik deneysel tasarım göre maruz kalmaktadır. Not: Hücreler / ml DMEM 12.5 mikrogram chlorambucil maruz bırakıldı24 saat karıştırıldı. Belirli bir deney tasarımı ile ilgili olarak, kullanım talimatları değişebilir.
3. Hasat EEC bir sayma hücre odasını kullanarak hücre sayısını belirlemek ve. Not: Otomatik sayım cihazları kullanılabilir, ancak dikkatli kullanılmalıdır: manuel hücre sayımı daha doğru ve şiddetle tavsiye edilir.
4. Boyden odasının alt bölmesi bölmesine 500 ul hücre kültür ortamı.
5. Üst bölme bölmesindeki filtre elemanının 500 ul hücre kültür ortamı içinde tam olarak 10 ⁴ EEC ekleyin. Kabarcıklar ortadan kaldırın.
6. Tam 8 saat boyunca inkübatör filtre ekler inkübe.
7. Bir kez PBS ile yıkayın ve hücre tespiti için 25 dakika süre ile, her iki bölme içinde 0.5 ml% 4 paraformaldehit ile orta yerine. Yoğun filtre yıkayın, ancak 0.1 M PBS ile en az 3 kez.
8. Bir neşter ile membranlar tüketim.
9. Nükleer lekelenme için DAPI içeren montaj ortamı ile iki cam kapak fişleri arasında membran monteörn. Yönlendirmeye dikkat edin. Zarın alt bölme tarafına doğru göç etmiş tek hücreler sayılır emin olun.
10. 400X büyütmede bir floresan mikroskop ile zarın alt bölme tarafına doğru göç etmiş hücreleri saymak. Göç hücreleri (Şekil 1A, 1B) ile membran gözenekleri karıştırmayın. Biyolojik çoğaltır makul sayıda (koşul başına en az 3 biyolojik çoğaltır) araştırın.

4. Yara İyileşme Testi

1. DIC mikroskopi kullanılarak, plastik yüzey tabanlı kültür kaplarına veya kuyu plakaları önlemek yerine cam tabanlı cihazlar kullanın: Mevcut donanımına bağlı olarak, dikkatli bir hücre kültürü yemekleri veya plakaları seçin.
   Not: faz kontrast mikroskopisi kullanılarak durumunda, plastik esaslı yemekler de kullanılabilir.
2. Canlı hücre görüntüleme için uygun hücre kültürü cihazında AET Yetiştirmek (örneğin, 4 cm'lik cam alt petri uygun)% 80 izdiham kadar. Önemli: izdiham tamamlamak için hücreleri yetiştirmek yoktur.
3. Steril 10 ul pipet uçları ile mono tabakaları Scratch. Çanak yüzeye çok fazla baskı olmadan hafifçe ucu itin ve müstakil hücreleri çıkarmak için 0.1 M PBS ile hücreler iki kez other.Wash bir taraftan sorunsuz bir çizgide hareket ettirin.
4. Kültür çanak orta yeterli hacim ekleyin. Varsa, soruşturulması gerektiğini bileşikler ekleyin.
   Not: ihtiva eden 1.5 ml'lik ortam 15 ng / ml a linolenik asit ilave edildi.
5. Canlı hücre görüntüleme yeteneğine sahip bir mikroskop altında kültür çanak monte edin. _CO2% 5, 37 ° C ve nemlendirilmiş bir atmosfer sağlamak.
   Not: Nemlendirme orta buharlaşmayı önlemek için özellikle önemlidir.
6. 10 dakika aralıklarla 24 saat boyunca zaman atlamalı görüntüler elde. Büyük dosya boyutları için planlayın. Not: 512 x 512 piksel çözünürlük genellikle yeterlidir; Ancak, en az 1,024 x 1,0 görüntülerini kullanmanızı öneririz24.
7. Açık kaynak yazılım (örn ImageJ) mikroskop birlikte verilen yazılımın uzunluğu aracını kullanarak = 24 saat t = 0 saatte ve t boşluk genişliğini ölçün veya kullanmayın. Not: Genel spesifik görüntü toplama ve analiz yazılımında üreticisi tarafından sağlanır. Bu nedenle, yazılımın kullanımı ile ilgili teknik detaylar için, kılavuza bakınız.

5. Hücre Takibi

1. DIC mikroskopi kullanılarak, plastik yüzey tabanlı kültür kaplarına veya kuyu plakaları önlemek yerine cam tabanlı cihazlar kullanın: Mevcut donanımına bağlı olarak, dikkatli bir hücre kültürü yemekleri veya plakaları seçin.
   Not: faz kontrast mikroskopisi kullanılarak durumunda, plastik esaslı yemekler de kullanılabilir.
2. Uygun bir hücre kültürü cihazında takviye edilmiş DMEM içinde 5 x 10 ⁴ EEC Tohum (örneğin, 24-çok-yuvalı plaka) 37 ° C ve 1-2 gün süreyle% 95 nemde% 5 _CO2 ile hücrelerin kültive edilmesi.
3. Hücreler 80 büyüdü zaman% Izdiham, ilgili test maddelerinin varlığında medya ve kültür, yeni medya ile hücreleri çıkarmak (örneğin, 12.5 mikrogram klorambusil / ml DMEM). Her zaman (bireysel deney sistemine bağlı olarak 24 saat), belli bir süre için, 37 ° C 'de (çözücü, örneğin, etanol ile muamele edilmiş), kontrol hücreleri içerir.
4. Canlı hücre görüntüleme (37 ° C,% 5 _CO2 ve% 95 nem) edebilen bir mikroskop altında bir kültür çanağı monte edin. Önceden tanımlanmış aralıklarla 24 saat boyunca zaman atlamalı görüntüler elde. 10 dakika aralıklarla görüntüleri edinin.
5. ImageJ eklentisi MTrackJ kullanılarak elle AET izleme yapın. Görüş alanından rastgele 10 hücreleri seçin ve MTrackJ komutasını "Add" seçeneğini kullanarak zaman içinde noktası başına bir veri noktası ekleyerek onların hareketlerini izlemek.

[. Meijering, Mtrackj "http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/"] MTrackJ ücretsiz olarak mevcuttur ve ImageJ availab: Not[Rasband, ImageJ. "http://rsbweb.nih.gov/ij/"] at le. MTrackJ eklenti hakkında detaylı manuel "http://www.imagescience.org" mevcuttur.

6. Canlı Hücre Görüntüleme / Mitokondriyal Membran Değerlendirilmesi Potansiyeli

1. Uygun bir hücre kültürü cihazında AET Yetiştirmek (örneğin, canlı hücre görüntüleme için uygun 4 cm'lik cam alt petri)% 80 izdiham kadar.
   Önemli: izdiham tamamlamak için hücreleri yetiştirmek etmeyin.
2. Varsa, kimyasallara maruz hücreleri. Not: Hücreler, 24 saat boyunca 12.5 ug / ml klorambusil maruz bırakılmıştır. Belirli bir deney tasarımı ile ilgili olarak, kullanım talimatları değişebilir.
3. Tetrametilrodamin DMSO (TMRM) içindeki bir 10 mM stok çözelti hazırlayın. Işıktan koruyunuz. Not: Stok solüsyonu -20 ° C 'de muhafaza edilebilir.
4. (: 1000 sulandırma 1), 10 uM'lik bir konsantrasyon ile bir çalışma çözeltisine hücre kültür ortamı içinde stok çözeltisi ile seyreltilir. Işıktan koruyunuzve mümkün olduğu kadar kısa zamanda kullanılır. Not: çalışma çözeltisi bir süre (> 1 saat) oda sıcaklığında muhafaza edilebilir, bununla birlikte, yeni bir çalışma çözeltisinin hazırlanması önerilir.
5. 1 ml taze hücre kültürü ortamı (yükleme çözeltisi) çalışma çözeltisinin 2 ul ekleyin.
6. Yükleme çözümü ile hücre kültür ortamı değiştirerek hücreleri yükleyin. 37 ° C'de,% 5 _CO2 ve nemlendirilmiş bir atmosfer (kuluçka makinesinde) 15 dakika için kuluçkalayın. Dikkat: Hemen hemen tüm floresan göstergeleri zamanla canlı hücreler tarafından ihraç edilmektedir; Bu nedenle, uzun süreli yükleme veya gecikmeli analizi kaçının.
7. Yıkama olmadan canlı hücre görüntüleme için uygun olan bir mikroskop altında çanak yerleştirin. Önemli: floresan göstergeleri, bu nedenle, gereksiz ışık maruziyeti önlemek, ışığa karşı oldukça duyarlıdır.
8. Farklı görüntüler arasında karşılaştırılabilirliği sağlamak iktisap parametrelerini değiştirmeden görüntüleri edinin.

Sonuçlar

Alkilleyici ajanlara dermal maruziyet eritem, blister oluşumu ve yara iyileştirici bozukluğu ile ilişkili dermal ülserasyon kışkırtır. Yara iyileşmesi endotel hücrelerinin göçü dayalı anjio ve vaskülogenezis gerektirir. Kantitatif geçiş Boyden odasının deneyinin kullanımı ile değerlendirilebilir. Alkilleyici ajan klorambüsil için AET Şekil 1C maruz gösterildiği gibi hücre migrasyonu ⁹ önemli bir azalmaya neden olmuştur. Doğrudan 24 saat chlorambucil maruz kaldıktan sonra ROS-çöpçü alfa linole...

Tartışma

Zehirli kimyasallara dermal maruziyet sık sık şiddetli yara iyileşmesi bozukluğu ile sonuçlanır. altında yatan mekanizmalar tam olarak bilinmemektedir. Yara iyileşmesi farklı aşamalardan (hemostaz, inflamasyon, proliferasyon ve yeniden şekillenme) oluşan karmaşık bir süreçtir. Hücre göçü, ancak, bu granülasyon dokusunun oluşması için büyük önem taşımaktadır, her aşamada yer almaktadır. Burada, yeni kan damarlarının anjiyo- veya vaskülojenez yoluyla oluşturulur.

Hem süreçler habercisi ve erke...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Boyden Odası
Corning FluoroBlok Doku Kültürü (TC) ile muamele edilmiş Uçlar, 24 kuyucuklu - 3 & m	Corning Incorporated	#351151
Corning FluoroBlok Doku Kültürü (TC) ile tedavi edilmiş Uçlar, 24 kuyu - 8 &mikro; m	Yaşam Bilimleri	# 351152
(Falcon Insert ile kullanım için 24 kuyulu Tamamlayıcı Plaka (353504)
Yara ve nbsp; iyileşme tahlili
Cam alt tabaklar	Word Precision Instruments, Inc.	#FD35-100
Mitokondriyal potansiyelin
TMRM (tetrametilrodamin metil ester)	Yaşam Teknolojileri	#T669
Hücre kültürü
Accutase	PAA, Pasching, Avusturya	# L11-007
&alfa;-Linolenik asit	Fluka (Sigma), Steinheim, Almanya	# L2376
Chlorambucil	Fluka (Sigma), Steinheim, Almanya	# 23125
Jelatin	Sigma-Aldrich, Steinheim, Almanya	# G2500-100G

değerlendirilmesi