Yöntem makalesi

Hücre Kuşakları ve Doku Örneklerinde Deubiquitinating Enzim aktivitesinin ölçülmesi için bir yöntem

DOI:

10.3791/52784

⸱

10 Mayıs 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, University of Minnesota, 2Institute for Translational Neuroscience, University of Minnesota, 3Department of Obstetrics, Gynecology, and Women’s Heath, University of Minnesota, 4Masonic Cancer Center, University of Minnesota

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geçerli protokol işlevsel homolog deubiquitinating enzim aktivitesinin ölçülmesi için bir yöntem göstermektedir. Uzman problar kovalent enzim değiştirme ve saptama için izin verir. Bu yöntem, yeni tedavi hedefleri tespit etmek potansiyele sahiptir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ubikitin-proteazom sistemi son nörodejeneratif hastalıklar ve kanser dahil olmak üzere çeşitli patolojilerde rol oynar. Bunun ışığında, bu sistemin düzenleyici mekanizmasını incelemek için teknikler yukarıda belirtilen hastalıkların hücresel ve moleküler süreçleri açıklık için gereklidir. Bu yazıda belirtilen hemagglutinin türetilmiş ubikitin sondasının kullanımı bu sistemin çalışması için değerli bir araç olarak hizmet vermektedir. Bu yazıda enzim aktivitesini deubiquitinating doğrudan görselleştirme vermek tahlilleri yapmasını sağlayan bir yöntem ayrıntıları. Deubiquitinating enzimler proteozomal bozulmasını kontrol ve kullanıcı bir deneyde birden enzimlerin aktivitesini araştırmak için izin verir aktif siteler, fonksiyonel benzerlik paylaşıyoruz. Lizatlar yumuşak mekanik hücre bozulması yoluyla elde edilen ve aktif site yönelimli probları ile inkübe edilir. Inaktif enzimler ilişkisiz kalırken Fonksiyonel enzimler probları ile etiketlenmiş. Run byNing bu deney, kullanım etkinliği ve hızlı ve kolay bir şekilde birden fazla deubiquitinating enzimlerin potansiyel ekspresyon hem de ilgili bilgileri alır. Mevcut yöntem, insan hücresinde tahmin yüz deubiquitinating enzimler için tek tek antikorlar kullanılarak önemli ölçüde daha etkilidir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ubikitin-proteazom sistemi (UPS) memeli hücresinde ana degradasyon yollarının biri olarak hizmet eder. Proteazomdan bozulmaya gitmekte Dayanaklar kovalent ubikuitin (Ub) 1 polimerleri ile etiketlenmiş. Hedef alt-tabaka bozulması için proteazomu girer önce, poli-ubikitin etiketi çıkarılmalıdır. Enzimler (DUBS) deubiquitinating olarak bilinen bir enzimler sınıfı ubikitin moleküllerinin 2 çıkarılması ve geri dönüşüm için sorumludur. Bu hücrede 3 çalışan yaklaşık yüz seslendirmeler olduğu İnsan genomunun tahmin edilmiştir. Ub-aracılı hücresel süreçleri kontrol DUBS bu kadar büyük bir sayı ile, bu enzimleri okuyan, yalnızca ifade seviyeleri hakkında bilgi verir mRNA teknikleri aktivite ve batı blot hakkında bilgi vermeyin çünkü bir meydan okuma sunuyor.

grip hemaglutinin (HA) kullanımı kovalent mod sağlayan aktif bölge yönlendirilmiş sondalar Ub türetilmiş, etiketliFonksiyonel takar ve bu yüzden de US-PS bir Batı lekesi 4, bu enzimlerin aktivitesinin doğrudan görselleştirme verir. Problar, aktif alan sistein kalıntısı 5 için bir intihar alt-tabaka olarak hizmet eden bir C-terminali tiol reaktif grup var. Bu problar ile, hücrenin her iki patolojik ve fizyolojik halleri altında birçok DUBS aktivitesini ve potansiyel ifade incelemek mümkündür.

DUB aktivitesindeki değişiklikler, Parkinson, Alzheimer, anemi ve çeşitli kanserler gibi patolojik koşullar 6-10 aralığında implike edilmiştir. Bu teknik, hastalığın çalışma için güçlü bir araç sunar. Bu yazıda, biz cam boncuklar kullanılarak lize edilmiş HeLa ve M17 hücrelerinde bu tekniğin uygulanmasını gösterir. Ayrıca, fare omurilik doku örneklerinde bu yöntemi kullanmak nasıl özetlemektedir. Bu tekniği ile elde edilen bilgiler, tanımlanması için bir başlangıç ​​noktası olarak kullanılabilirterapötik hedefler ve farklı hastalık durumlarının çalışma için oluşturulması modelleri. Bu tekniğin gerçek yardımcı tek bir deneyde çok dubs bilgi sağlama yeteneğinde yatmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Lizis Tampon hazırlanması

  1. Bir 2 M stok çözelti yapmak için deiyonize (Di) su içinde sükroz eritin. 0.22 um poliviniliden florit (PVDF), filtre çalıştırılan bir vakum kullanılarak sükroz 2M çözelti süzülür.
  2. Anaerobik koşullar altında, bir 500 mM stok çözeltisi ve depolayın DI su içinde ditiyotreitol (DTT) içinde çözülür. 100 mM'lik bir stok çözelti yapmak için DI su içinde magnezyum klorür (MgCI2) içinde çözülür. 50 mM stok çözelti yapmak için DI su içinde adenosin trifosfat (ATP), disodyum hidrat içinde çözülür.
  3. DI su içinde Trizma hidroklorür eritilmesi ve sodyum hidroksit (NaOH) ile pH ayarlanarak pH 7.4'te bir Tris çözelti hazırlayın.
  4. 250 mM, 1 mM, 5 mM MgCl2 konsantrasyonu, 1 mM ATP konsantrasyonu ve 50 mM Tris konsantrasyonunun bir DTT konsantrasyonu bir sükroz konsantrasyonuna sahip bir parçalama tamponu yapmak DI su içinde stok çözeltileri bölümlerini birleştirmek . Örneğin, Tris, 50 535.3 ul karıştırınMgCl2 0 ul, 1.25 ml sükroz, DTT 20 ul ATP 200 ul ve Dİ su içinde 7,4947 mi liziz tamponu içinde 10 ml yapmak için. Bu, yaklaşık 20 deneyleri için de kullanılabilir.

Deney 2. Kültürleme Hücreler

  1. DMEM +% 10, 50 ml cenin sığır serumu (FBS), konik bir tüp içinde 30 ml aliko haline getirilmesi Ortamın.
  2. Ilık su ile küçük bir behere sıvı azot depolama dondurulmuş M17 veya HeLa hücreleri aktarın.
  3. 50 ml konik tüp hücreleri aktarın. İlk olarak, hücre flakon bazı medya ekleyebilirsiniz. Daha sonra eritme 5 saniye içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler aktarın.
  4. Hücre topağı elde etmek için 5 dakika boyunca 450 x g'de hücre süspansiyonu santrifüjleyin. T75 balona medya 20 ml ekleyin.
  5. Emme kullanarak hücrelerden ortamı çıkarın. Hücre topağı ve tekrar süspansiyon taze ortam 5 ml.
  6. T75 şişesi içinde ortam, 20 ml 5 ml hücre süspansiyonu aktarın ve 37 ° C'de inkübe edin. ChHer 3 günde bir ortam ange.

3. Hücre Hasat

  1. Hücreleri dokunmamaya dikkat ederek, emme yoluyla ortamı çıkarın.
  2. Fosfat tamponlu tuzlu su, 5 ml (PBS) hücreleri yıkayın. Emme kullanarak PBS çıkarın.
  3. T75 şişeye tripsin etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 3 ml ilave edilir ve 3 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  4. Balona taze medya 6 ml ekleyin ve hücreleri tekrar süspansiyon.
  5. 5 dakika 290 × g 15 ml konik tüp ve santrifüj süspansiyon aktarın.
  6. Süpernatantı ve PBS 5 ml ekleyin. Yavaşça pelet kırmaya tüpün alt dokunun. 5 dakika boyunca 290 x g'de santrifüjleyin.
  7. Adımı yineleyin 3.6 üç kez.
  8. PBS çıkarın ve taze PBS 1 ml hücreleri tekrar süspansiyon. Eppendorf tüp (1.5 mi) aktarın. 5 dakika boyunca 290 xg'de Spin.

4. Hücre Liziz

  1. Bir pipet An kullanarak pelet yaklaşık hacmini ölçmek1 hacim oranı: Bir kütle cam boncuk tarttın d 1. Liziz tamponu içerisinde pelet iki hacim.
    Not: cam boncuk eklemeden önce tampon ekleyin.
  2. Lyse soğuk bir odada vorteks ile 4 ° C'de 30 dakika boyunca en fazla çalkalama ile Eppendorf tüpü içinde hücreleri.
  3. 200 xg 30 saniye Santrifüj kısaca boncuk yerleşmek için. Süpernatant toplayın.
  4. Süpernatana daha önce olduğu gibi cam boncuklar aynı hacimde ekleyin.
  5. Bir kez daha fazla çalkalama ile 4 ° C'de 30 dakika vorteksleyin.
  6. 200 xg 30 saniye Santrifüj kısaca cam boncuk yerleşmek için. Süpernatant toplayın.
  7. 5 dakika boyunca 5030 x g'de santrifüj çekirdekleri, membranlar ve kesintisiz hücreleri çıkarmak için. Hücre lizatı olan süpernatant, toplayın.

5. Doku Homojenizasyon

  1. Lizis tamponu fare omurilik dokusu 9 çözeltisi: 1 hacmini: Bir kütle olun.
    Not: Bu yöntem, farklı bir dizi uygulanabilirent doku örnekleri.
  2. Kalan hiçbir topakları olmadığından emin olmak için 30 saniye boyunca homojenleştirici üzerindeki seviye 2 bir ayarı kullanarak doku homojenize.
  3. Çekirdekleri, membranlar ve kırılmamış hücreleri çıkarmak için 3 dakika 5,030 xg'de aşağı doğru döndürün.
  4. Lizat olan süpernatant, toplayın.

6. Numune Türevlendirme

  1. Pierce BCA Protein Assay Kit protokolü tarafından belirtildiği gibi kolorimetrik 96 oyuklu bir plaka okuyucusu kullanılarak doku lizat proteini konsantrasyonunu belirlemek için bir 96 oyuklu plaka analizinde bisinkoninik asit (BCA) uygulayın.
  2. Deiyonize (Di) su kullanılarak 50 ul toplam proteinin 20 ug tekabül eden bir kısım getirin.
  3. Çözeltiye HA-UB-vinil sülfon (VS) 1.35 uM 2 ul ilave edin ve 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edilir. Bu, son reaksiyon karışımı içinde prob 50 nM lizat 20 ug ile sonuçlanır. Bu fonksiyonel DUBS etiketleme sağlamak için büyük molar fazladır.
  4. Ben95 ° C'de 5 dakika için Laemmli numune tamponu içinde örnek ncubate. 52 ul reaksiyon hacmi kullanımı 2x numune tamponu 26 ul, 4x numune tamponu 13 ul veya 6x numune tamponu 8.87 ul için.
  5. Jel yüklemeden önce buz üzerinde soğutun.

7. Western Blot

  1. Hazırlanan numune 40 ul ile 12 oyuklu% 4-20 tris-glisin jel yük
  2. Iyon ön dibe ulaşana kadar 95 V jel çalıştırın.
  3. Bir polivinilidendiflorid (PVDF) membran üzerine jel bir gecede transferi gerçekleştirin.
  4. Amido siyah leke membran inkübe ve her kulvarda protein miktarını gösteren bir görüntü elde etmek için membane tarayın.
  5. Membran destain ve bloke etmek için 1 saat boyunca PBS içerisinde% 5 süt ile inkübe edilir.
  6. 1 bir konsantrasyonda birincil bir anti-HA antikoru membran inkübe: ya da gece boyunca 4 ° C'de ya da oda sıcaklığında 4 saat süre ile, PBS içinde 10.000,% 5 süt.
  7. F 3 yıkar gerçekleştirinya da% 0.1 Tween-20 deterjanı ile PBS içinde her biri 5 dakika.
  8. 1 bir konsantrasyonda, bir fare yaban turbu peroksidazı membran inkübe: PBS içinde 10.000,% 5 süt en az 2 saat karıştırıldı.
  9. % 0.1 Tween-20 deterjan ile, PBS içinde 5 dakika için her 3 yıkama yapın.
  10. PBS içinde 5 dakika için 1 yıkama yapın.
  11. 10 dakika boyunca, bir kemilüminesan tespit reajanı membran inkübe ve kemilüminesan bir detektörü kullanarak bulunması. Dedektör ayarı otomatik pozlama kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kültürlenmiş M17 ve HeLa hücreleri protokolü (3. Hücre Hasat) 'de ayrıntılı bir yöntem ve fare omurilik dokusu elde edildi kullanılarak hasat edilmiştir. Hücre peleti / omurilik dokusu reaktifi Hazırlama bölümünde açıklanan lizis tamponu ile bir tüp içine yerleştirilmiştir. Hücre topakları, bir homojenleştirici (Şekil 1B) kullanılarak homojenize edildi cam boncuk (Şekil 1A) ve fare omurilik dokusu numuneleri kullanılarak parçalanmıştır. Liziz veya homojenleştirmeden sonra, numune daha s...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ubikuitinasyon temel hücresel aktivite olduğundan, düzenleyici mekanizmaların anlaşılması hastalık ve patoloji süreçlerini ortaya çıkarılması için anahtar olabilir. HA kullanımı Burada rapor Ub türetilmiş aktif bölgeye yönelik sondalar Ub-aracılı protein parçalanmasını eğitimi için kolay, ama çok geçerli bir yöntem sağlar etiketledi. Bu yöntem daha hızlı ve daha az pahalı ayrı DUBS her biri eğitim fazladır.

Cam boncuklar kullanılarak - Bu yöntemde, hücre lizizi mekanik araçlar ile elde edili...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz kullanılan fare omurilik doku örnekleri sağlamak için Minnesota Üniversitesi Lee laboratuvarını teşekkür etmek istiyorum. Bu eser MB Randy Tıraş Makinesi Kanser Araştırma ve Toplum Fonu tarafından ve Minnesota Yumurtalık Kanseri Birliği (MOCA) MB'ye göre, Savunma Yumurtalık Kanseri Araştırma Programı (OCRP) MB OC093424 Bölümü tarafından desteklenmiştir. fon çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya yazının hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
PowerGen 125 (homojenizatör)Fischer Scientific14-261-02P
Vakumla çalışan filtreler 0.22 & mikro; mBPV2210
Cam boncuklar, asitle yıkanmış &; 106 ve mikro; m (~ 140 ABD elek)Sigma-aldrichG4649-10G
SükrozFischer ScientificS6-212
DL-ditiyotreitolSigma-AldrichD0632
Magnezyum klorürSigma-AldrichM8266
Adenozin 5'-trifosfat disodyum tuzu hidratSigma-AldrichA26209
Trizma hidroklorürSigma-AldrichT3253
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Orta Ömür Teknolojileri11965-092
Fosfat tamponlu tuzlusu Yaşam Teknolojileri10010-023
Doku kültürü şişesi 75 cm2 filtre kabı ile 250 ml 120/csCellstarT-3001-2
%0,05 Tripsin-EDTA (1x)Yaşam Teknolojileri25300-054
HI FBSYaşam Teknolojileri16140-071
FareSigma-AldrichH9658
Ubiquitin vinil sülfon (HA-etiketi)Enzo Life SciencesBML-UW0155-0025
Laemmli'nin SDS-Numune Tamponu (4x, indirgeme)Boston BioProductsBP-110R
Pierce BCA Proteini Tahlil KitiThermo Scientific23225

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
  2. Wilkinson, K. D. Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).
  3. Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).
  4. Rolén, U., et al. Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines. Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).
  5. Borodovsky, A., et al. Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family. Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).
  6. Andersson, F. L., et al. The effect of Parkinson’s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1. J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).
  7. Poon, W. W., et al. β-Amyloid (Aβ) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1. J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).
  8. Nijman, S. M., et al. The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway. Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).
  9. Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2. EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).
  10. Coughlin, K., et al. Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses. Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).
  11. Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of α-Synucleinopathy In. Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Deubiquitinating Enzyme ActivityHA Derived ProbesWestern Blot AnalysisCell Lysate PreparationMechanical Cell LysisProtein Concentration AssayChemiluminescent DetectionActive Site LabelingEnzyme Activity ProfilingPVDF Membrane Transfer

İlgili makaleler