Burada, amiloid-beta'nın doğrudan stereotaksik beyin infüzyonu için bir protokol sunuyoruz. Bu metodoloji, amiloid-beta'nın beyin nöronları üzerindeki kısa vadeli etkilerini ele almak için alternatif bir in vivo fare modeli sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare Hippocampus içine Oligomerik Amiloid-beta Stereotaksik İnfüzyon
Bu makalede
Özet
Özet
Alzheimer hastalığı, yaşlanma nüfusu etkileyen nörodejeneratif bir hastalıktır. Hastalığın önemli bir nöropatolojik özellik amiloid-beta aşırı üretim ve etkilenen bireylerin beyin bölgelerinde amiloid beta plakların birikmesidir. Yıllar boyunca bilim adamları, amiloid beta patolojiyi çoğaltmak girişiminde sayısız Alzheimer hastalığı fare modelleri yarattı. Ne yazık ki, fare modelleri, sadece seçici bir şekilde hastalık özelliklerini taklit eder. Nöronal ölüm, Alzheimer hastalığı olan hastaların beyinlerinde belirgin bir etki fark bu farelerde yoksundur. Nöronlar en zehirli olduğu kanıtlanmıştır amiloid-beta biçimleri - - Bu nedenle, biz ve diğerleri doğrudan amiloid-beta çözünür oligomerik türler beslerken bir yöntem istihdam var stereotaxically beyin içine. Bu yazıda seçkin bir beyin bölgesi amiloid beta seviyelerinin arttırılması, bu cerrahi teknik belgelemek için erkek C57BL / 6J fareler kullanmaktadır.Kolinerjik devre ile bağlıdır bazal ön ile birlikte bu beyin yapısı, hastalığın dejenerasyon alanlarından biri temsil ettiği infüzyon hedef hipokampusun dentat girus olduğunu. Broca diyagonal bant dikey bacak hücre ölümü ve kolinerjik nöron kaybı eşlik eden bir artış iken, stereotaksik infüzyon yoluyla dentat girus amiloid-beta yükseltilmesi sonucu, 1 hafta içinde, dentat girus nöron kaybına yükselerek Bazal önbeyin. Bu etkiler 2 haftaya kadar gözlenir. Elde ettiğimiz veriler mevcut amiloid beta infüzyon modeli, kısa vadede bölgeye özgü nöron ölümünü ele alternatif fare modeli sağladığını göstermektedir. Bu modelin avantajı amiloid-beta mekansal ve zamansal biçimde yüksek olmasıdır.
Giriş
Amiloid-beta (Aβ 1-42) oluşan amiloid lekesi yatakları, Alzheimer hastalığı (AD) patolojisinde önemli bir özelliğidir. Birçok çalışma nöron ölümünü, sinaptik distrofi, kayıp ve disfonksiyonu ortaya rekombinant oligomerik Aβ 1-42 o yüksek veya toksik seviyelere göstermiştir; yanı sıra, öğrenme ve hafıza açıkları 1-4 olarak. Etkilenen beyin bölgeleri hipokampus, korteks ve bazal ön beyin ve amigdala 5,6 gibi subkortikal yapılar yer alıyor. Bugüne kadar, AD Aβ 1-42 patoloji simüle girişiminde birden transgenik fare modelleri vardır. Zorlanma bağlı bu hayvanlar AD seçkin patolojik özelliklerini inceleyerek yararlı ol....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Not: Tüm hayvan deneyleri için, kurumsal ve bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı için ulusal kurallar takip edildi.
1. Cerrahi Cerrahi Aletler ve Çözümler hazırlayın
- Tüm paslanmaz çelik cerrahi aletleri otoklavlayın.
- Steril moleküler sınıf iyonu giderilmiş damıtma suyu ile 200 derece mutlak etanol seyrelterek% 70 etanol hazırlayın.
- Hamilton şırınga 29 G iğne takın. 1 dakika boyunca tekrar tekrar hazırlanması ve çıkarma nanopure su ile Hamilton şırınga ve iğne içini temizleyin. % 70 etanol ile bu işlemi tekrarlayın.
- Hamilton şırınga pistonu ve iğneyi çıkartın. Hava Laminer akış kaput O / N pa....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
İnsan yeniden birleştirici oligomerik Aβ 1-42 hazırlanması için, bu yöntem, monomerlerin, dimerler, trimerler ve tetramerler (Şekil 1A) 'den oluşan çözünebilir oligomerik türler elde edilir. Bu düşük molekül ağırlıklı Aβ 1-42 türlerin değil, fibriller ve plaklar, nöronlar 1,4,9,17-19 en toksik olduğu çeşitli ortamlarda gösterilmiştir. Oligomerik Aβ 1-42 fare beyninde Aβ 1-42 nöron ölümünü indükleyen olup olmadığını belirlemek için (100 uM stok s.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
1) aseptik teknik kullanır;: deneyci veya cerrah olmalıdır başarılı Aβ 1-42 enjeksiyon elde etmek için 2) doğru doğru koordinatlar ile çıkar beyin bölgesini belirlemek; 3) düzgün AP ve ML ekseninde tesviye beyni stereotaksik çerçeve fare sabitlemek mümkün; 4) hassas mikromanipülatör çalıştırmak için yeteneği var; 5) Uygun post-operatif bakım sağlamak. Bu önemli adımlar takip edilirse, fare gözlemlenebilir enfeksiyonu ile ameliyat hayatta gerekir.
In vitro uyum içinde çalı.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.
Teşekkürler
Bu çalışma Ulusal Nörolojik Bozukluklar Enstitüsü tarafından desteklenen ve İnme Alzheimer Hastalığı Araştırma finanse Yaşlanma üzerine (CMT kadar) NS081333, Alzheimer Derneği hibe NIRG-10-171721 ve (UH kadar) Ruh Sağlığı Hibe MH096702 Ulusal Enstitüsü ve Ulusal Enstitüsü hibe edildi (YYJ ve JB) Columbia Üniversitesi, pilot hibe AG008702 de merkezi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Ketamin HCl (100 mg / ml) | Henry Schein Medical | 1049007 | 1 kg hayvan başına 100 mg ketamin |
| Ksilazin (20 mg / ml) | Henry Schein Medical | mevcut değil | 1 kg hayvan başına 10 mg ksilazin |
| Buprenex (0.3 mg / ml) | Henry Schein Medical | 1217793 | 1 kg hayvan başına 0.1 mg buprenex |
| A ve beta; 1-42 | David Teplow/UCLA | mevcut değil | 100 μ M; Bu amiloid A & beta makalesinde kullanıldı |
| ; 1-42 | Bachem | H-1368 | Teplow lab A & beta'dan amiloid yerine kullanılabilir |
| ; 1-42 | American Peptide | 62-0-80B | & beta'dan amiloid yerine kullanılabilir |
| ; 1-42< / sub> | Amerikan Peptit | 62-0-46B | A ve beta'yı karşılaştırmak için kontrol peptidi olarak kullanılabilir; 1-42 |
| NU4 Antikoru (Oligomerik Amiloid Antikoru) | William Klein/Northwestern U.'dan Hediye | mevcut değil | 1: 2.000 seyreltme |
| Anti-Amiloid Oligomerik Antikor (Poliklonal Tavşan) | EMD Millipore | AB9234 | Nu4 yerine kullanılabilir; son kullanıcı tarafından test edilmesi gerekiyor |
| 6E10 Antikoru (Monoklonal Fare) (Amiloid Antikoru) | Biolegend | sig-39320 | 1:1.000 seyreltme |
| ChAT Antikoru (Poliklonal Keçi) | Millipore | AB144P | 1:100 seyreltme |
| DeadEnd Florometrik TUNEL sistemi | Promega | G3250 | için üreticinin talimatlarına uyun |
| Invitrogen | P36935 | ile Prolong Gold Antifade Reaktifi | Slaytları kaydırırken kullanın |
| Fluorogold Fluorochrome | , LLC | mevcut değil | % 2 çözelti |
| Mutlak Etanol (200 kanıt) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Novex'i sterilize etmek ve dezenfekte etmek için% 70 etanol yapmak için |
| 10-20 Trisin jel | Life Technologies | EC6625BOX | A ve beta'yı ayırmak için; 1-42 |
| Novex Tricine SDS Koşu Tamponu (10X) | Life Technologies | LC1675 | %10-20 Trisin jelleri çalıştırmak için |
| Novex Tris-Glisin Transfer Tamponu (25X) | Life Technologies | LC3675 | %10-20 Trisin jelleri aktarmak için |
| SuperSignal Western Blot Enhancer | Thermo Scientific | 46640 | A ve beta'yı geliştirmek için; 1-42 sinyali; üreticinin protokolünü takip edin |
| Protran BA79 Nitroselüloz Lekeleme Membranı, 0.1 & mu; m | GE Sağlık Yaşam Bilimleri | 10402088 | %10-20 Trisin jelleri aktarmak için |
| Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | 10-20 Trisin jelleri çalıştırmak için elektroforez aparatı |
| GenTeal Kayganlaştırıcı Göz Jeli | Novartis | mevcut değil | Ameliyat sırasında fare gözlerini nemli tutmak için; yerel eczanelerde bulunabilir |
| [header] | |||
| Refresh Optive Lubricant Eye Drops | Alergan | mevcut değil Ameliyat | sırasında fare gözlerini nemli tutmak için; yerel eczanelerde bulunabilir; GenTeal |
| Betadine | Stoelting | 50998 | Spatula'yı sterilize etmek ve dezenfekte etmek için |
| ; | VWR | 82027-490 | Hayvan ağzını açmak için |
| Bulldog Serrefines Kelepçeleri (Çene Dims. 9X1.6 mm; Uzunluk 28 mm) | Güzel Bilim Araçları | 18050-28 | İsteğe bağlı; Enjeksiyon sırasında kafa derisini ayrı tutmak için |
| Düz İnce Makas (Kesme kenarı 25 mm; Uzunluk 11,5 cm) | İnce Bilim Aletleri | 14060-11 | Kafa derisini kesmek için |
| #3 Neşter Sapı | İnce Bilim Aletleri | 10003-12 | |
| #11 Cerrahi Bıçak | İnce Bilim Aletleri | 10011-00 | Kafa derisi kesisi yapmak için |
| Öğrenci Standart Desen Forcep (Uç Dims. 2,5x1,5 mm; Uzunluk 11,5 cm) | İnce Bilim Araçları | 91100-12 | Dikiş sırasında kafa derisini kapalı tutmak için |
| Düzeltici Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | Saç tıraşı için |
| T / Pompa Ilık Su Sirkülatörü ve nbsp; | Kent Bilimsel | TP-700 | Ameliyat sırasında hayvanı ısıtmak için |
| Yeniden Taşınabilir Savaş Madenciliği Pedi (5" x 10") | Kent Scientific | TPZ-0510FEA | Ameliyat sırasında hayvanı ısıtmak için T/Pump ılık su sirkülatörüne takmak için |
| Akülü Mikro Matkap | Çalma | 58610 | Kafatasında delik açmak için 0,8 mm çelik çapak kullanın |
| Fare ve Laboratuvar Standart Stereotaksik Alet Yenidoğan Sıçan Adaptörü | Çalma | 51615 | |
| Sadece Fare için Stereotaksik Alet | Çalma | 51730 | Bunu Stoelting Cat yerine kullanabilirsiniz. # 51615 |
| Özetin Özeti Stereotaksik Enjektör | Çalma | 53311 | |
| Kuru Cam Boncuk Sterilizatörü | Çalma | 50287 | Paslanmaz çelik aletleri sterilize etmek için |
| Steril Cerrahi Örtü (18" x 26") | Çalma | 50981 | |
| Hamilton Şırınga 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL | Hamilton Company | 7637-01 | Beyin enjeksiyonu için; Farklı çözeltiler için farklı şırıngalar kullanın |
| 29 G İğne, Küçük Hub RN NDL | Hamilton Şirketi | 7803-06 | Beyin enjeksiyonu için Hamilton şırıngasına takmak için |
| 1 ml BD Tüberkülin Şırıngaları | VWR | BD309659 | Anestezi ve salin uygulamak için |
| 30 G İğne (0.5") | VWR | BD305106 | Anestezi ve salin uygulamak için |
| Taşınabilir Elektronik CS Serisi Tartı (Ohaus) | VWR | 65500-202 | Anestezi dozunu belirlemek üzere hayvanları tartmak için |
| Sıcak plaka (Üst Plaka Dims. 7,25x7,25 inç) | VWR | 47751-148 | Ameliyat sonrası hayvanları ısıtmak için |
| Sofsilk İpek İpek Sütür C-1 Kesme 3/8, 12 mm | Covidien | S1173 | Yarayı kapatmak için |
| Vetbond Doku Yapıştırıcısı (3M) | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | İsteğe bağlı: yaranın kapanmasına yardımcı olmak için; Sütür ile kullanın. |
| Pamuk Uçlu Ahşap Şaft Steril Aplikatörler | Fisher scientific | 22-029-488 | Cerrahi yaranın temizlenmesi ve kurutulması için |
| Fisherbrand Superfrost Plus Mikroskop Slaytları | Fisher Scientific | 12-550-15 | Beyin bölümlerini toplamak için |
| VWR Mikro Kapak Camı 24 X 50 mm | VWR | 48393241 | Mikroskop slaytlarını monte etmek için |
| Thermo Scientific Nalgene Şırınga Filtresi 0.2 & mu; m | Fisher Scientific | 194-2520 | Tuzlu su solüsyonunu sterilize etmek için |
| Viscot Medical Medline'dan steril çift uçlu cilt markörleri | VIS1422SRL91 | Kafatası üzerindeki koordinatları işaretlemek için |
Kaynaklar
- Baleriola, J., et al. Axonally Synthesized ATF4 Transmits a Neurodegenerative Signal across Brain Regions. Cell. 158 (5), 1159-1172 (2014).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegener....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
