Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Lusiferaz haberci geni ile RAW264.7 hücreleri transfekte

21.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/52807

⸱

18 Haziran 2015

 ,  ,  , 
1Immunity and Infection Research Centre, Vancouver Costal Health Research Institute, 2Department of Surgery, University of British Columbia, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of British Columbia

Bu makalede

Özet

Makrofaj hücre hattına, RAW264.7'ye transfeksiyon, hücrenin yabancı maddelere karşı doğal tepkisi nedeniyle zordur. Burada, lusiferaz raportör genlerini RAW264.7 hücrelerine transfekte etmek için nazik ama sağlam bir prosedür tanımladık.

Özet

İstenilen genetik materyallerin hücrelere transfeksiyonu, biyomedikal araştırma çalışmalarında kaçınılmaz bir prosedürdür. Çok sayıda yöntem tanımlanmış olsa da, bazı hücre türleri bu yöntemlerin çoğuna dirençlidir ve düşük transfeksiyon verimliliği1 verir, bu da bu hücre tiplerinde araştırmayı potansiyel olarak engeller. Bu protokolde, lusiferaz raportör genlerini RAW264.7 makrofaj hücre hattına bir plazmit DNA olarak tanıtmak için optimize edilmiş bir transfeksiyon prosedürü sunuyoruz. İki farklı transfeksiyon reaktifi türü (lipid bazlı ve poliamin bazlı) tanımlanmıştır ve RAW264.7 hücrelerinin transfeksiyon prosedürü ile minimum düzeyde değiştirildiğinden ve elde edilen herhangi bir deneysel verinin deneysel tedavinin doğrudan sonuçları olduğundan emin olmak için protokol boyunca önemli notlar verilmiştir. Transfeksiyon verimliliği diğer transfeksiyon yöntemlerine kıyasla daha yüksek olmasa da, açıklanan prosedür, hücrelerin uyaranlara fizyolojik tepkisini değiştirmeden RAW264.7'deki lusiferaz sinyalini tespit etmek için yeterince sağlamdır.

Giriş

Hücrelerdeki nükleik asitlerin transfeksiyonu, bilimsel araştırma, çeşitli uygulama vardır. Örnekler (1) raportör genler, gen ekspresyonunda farklı gen elemanları rolünü incelemek için (2) protein ekspresyon plazmidleri ilgili proteini aşın ifade etmek üzere, (3) küçük bir müdahaleci RNA gen ifadesinin aşağı da içermektedir. Belirli genlerin ekspresyon seviyesi manipüle ve bu manipülasyonlar ayırıcı etkisini ölçerek, araştırmacılar, seçilen biyolojik sistemlerde gen işlevlerini ortaya çıkarabilir. Tüm transfeksiyon yöntemleri, aynı transfeksiyon verimliliği sağlar ve hatta aynı transfeksiyon yöntemi, aynı 1 tüm hücre tiplerinin transfeksiyonu etmez. Bu nedenle, farklı transfeksiyon yöntemleri, kalsiyum fosfat yöntemi, DEAE dekstran, katyonik lipit transfeksiyon, katyonik olmayan lipit polimer, transfeksiyon, elektroporasyon ve nucleofection 2,3 gibi geliştirilmiştir.

Makrofajlar içine Transfeksiyon bilhassa olduğunulikle zor dolayı makrofajlar (metıle) DNA 4 türetilen bakteriler de dahil olmak üzere yabancı maddelere karşı çok duyarlıdır profesyonel fagositler olmasından. Yabancı DNA'nın sokulması, sitokinler ve nitrik oksit 5,6 üretimine yol açan Toll-benzeri reseptör 9 (TLR9) yolunun aktive eder. Bu aktive makrofajlar daha sonra araştırmacılar incelemek niyetinde tedaviye daha az duyarlı olabilir.

Bizim laboratuvar rutin lusiferaz raportör genleri ile RAW264.7 makrofaj hücre hattı transfects ve biz arka planda önemli ölçüde daha yüksek lusiferaz sinyal yeterince sağlam bir protokol geliştirdi, ancak makrofajlar istirahat durumuna kalması için yeterli de nazik var. Transfekte edilmiş hücrelerin davranışları IκBζ (pGL3- IκBζ) promoter bölgesini barındıran bir ateş böceği lusiferaz raportör geni ile değerlendirildi. IκBζ ekspresyonu, bakteriyel hücre duvarı bileşeni, dudak ile üst-düzenlenmektediropolyssacharide (LPS) 7,8, ve anti-iltihabik sitokin ile baskılanmış, İnterlökin-10 (IL-10) 8. Kuyular arasındaki transfeksiyon varyasyon hesaba katmak için, normalleştirme amacıyla Renilla lusiferaz gen (örn phRL-TK) ihtiva eden bir kontrol plasmidi-transfekte co. Açıklanan protokol DNA plazmid çeşitli transfeksiyon zamanlaması, transfeksiyon reaktifleri tipi, transfeksiyon reaktifleri ve plasmid DNA miktar dahil olmak üzere parametreler, hem de transfeksiyon reaktifi oranı test edildikten sonra optimize edilir. Bu protokolde yer alan iki transfeksiyon reaktifleri (1), bir lipid-bazlı transfeksiyon reaktifi ve (2) bir protein / poliamin bazlı transfeksiyon reaktifi bulunmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Plazmid DNA Saflaştırma

  1. Üreticinin protokolüne göre bir maxiprep kiti kullanılarak plazmid DNA ekstrakte edin. TE tamponu, 500 | il yeniden süspanse plazma DNA.
  2. Kloroform: Bir fenol gerçekleştirin izoamil alkol çıkarma ve izopropanol yağış kalan bakteri kirleri çıkarmak. LPS varlığı transfeksiyon 9 engeller.
    1. Plasmid DNA (1, pH 8: 25: 24) ve 15 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır izoamil alkol: kloroform: Fenol 500 ul ekle. Fenol Ciddi yanıklara neden olur ve ağır hasar olduğu kadar yanıklar hep hissettim değildir bu yüzden bir anestezik olduğunu. Davlumbaz izoamil çıkarma ve dikkatli kullanın: kloroform: fenol gerçekleştirin.
  3. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe karışımı. Oda sıcaklığında, 10 dakika süreyle 13,000 x g'de santrifüjleyin. Yeni bir 1.5 ml'lik bir toplama tüpü içinde, üst sulu faz 350 ul aktarın.
  4. Alt organik faz içeren tüp TE tamponu, 350 ul ekle. 15 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 13,000 x g'de santrifüjleyin. Aynı 1.5 ml toplama tüpüne üst sulu faz 350 ul aktarın.
  5. 3 M sodyum asetat (pH 5.2), 70 ul ilave edin ve iyice karıştırın. % 100 izopropanol, 700 ul ekle. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. 10 minat 4 ° C için 13.000 xg'de Santrifüj. Süpernatantı.
  6. Pelet% 75 etanol içinde 500 ul ekle. Vorteks örnekler 4 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca 5,000 x g de karıştırılır ve santrifüjlenir için. Süpernatantı. DNA pelet olduğunu.
  7. Tüpün kapağını açın ve hava 5 RT'de pelet kurulayın - 10 dk. Pelet saydam hale gelmelidir. DNA pelletini TE tamponu, 500 ul ekle. 50 ısı - 10 dakika süreyle 60 ° C'de DNA pelet çözülmesi için.
  8. 260 nm (A260) ve bir spektrometre ile 280 nm (A280) absorbans ölçün. 50 ng / ul A260 değeri çarpılarak DNA konsantrasyonu hesaplayın. Calculatin DNA'nın kalitesini değerlendirmekg A260 / A280 oranı. 2.0 - yüksek kalite ile DNA 1.8 bir A260 / A280 oranı vermelidir.

2. Hücre Kültürleme ve Tohum

  1. DMEM içinde kültür RAW264.7 hücreleri 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde% 9 fetal dana serumu (DMEM /% 9 FCS) ile takviye edilmiştir. Her geçiş sırasında, bir Pasteur pipeti kullanarak sürekli pipetleme hücreleri plakadan ayırın. Passage hücreleri 2 günde, 1,5 tohum - stok olarak 10 cm doku kültürü tedavi yemeğin 2 milyon hücre. 6 hafta - hücrelerin her 5 yeni stok çözülme.
  2. Transfeksiyondan bir gün, DMEM /% 9 FCS 500 ul bir hacim içinde, 24 oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına 200,000 hücre tohum. 37 ° C kuluçka makinesi içinde 4 saat inkübe hücreleri.
  3. Transfect hücreleri ya da lipid bazlı tepkime maddesi (aşama 3.1) ya da protein / poliamin-bazlı tepkime maddesi (aşama 3.2).

3. Transfeksiyon

  1. Lipid bazlı transfeksiyon:
    1. Transfeksiyon REAGEN Isınmat karanlıkta oda sıcaklığına kadar. Serum-barındırmayan ortam, DMEM /% 9 FCS, 37 ° C'ye kadar ısıtın.
    2. 1.5 ml bir tüp içinde, serum-içermeyen ortam içinde plasmid DNA, 0.5 ug ila 50 ul ekle. Sıvı yüzeyinin altında pipet ile transfeksiyon reaktifi 2 ul ekle. 6 saniye vorteksleyin.
    3. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta reaktif / DNA karışımı bırakın.
    4. 30 dakika inkübasyon sırasında, kuyudan ortamını çıkarın ve her bir oyuğa taze DMEM /% 9 FCS 250 ul ilave edin.
    5. 30 dakika sonra, reaktif / DNA karışımı, DMEM /% 9 FCS 250 ul ilave edin. Yukarı ve aşağı pipetleme iyice karıştırın.
    6. Her kuyu seyreltilmiş karışımın 300 ul ekleyin. 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörü içinde 4 saat - 2 inkübe edin.
    7. Transfeksiyon çözüm çıkarın ve DMEM /% 9 FCS 500 ul ekleyin. Hücre uyarma önce 37 ° C,% 5 CO2 inkübatöründe 48 saat - 24 inkübe edin.
  2. Protein / poliamin bazlı transfeksiyon:
    1. Isınma serum serbestorta ve 37 ° C'ye kadar, DMEM /% 9 FCS.
    2. Serum-barındırmayan ortam 18.75 ul transfeksiyon reaktifi 0.75 ul ekleyin. Vortex kısaca karıştırın. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Seyreltilmiş transfekte reaktifi içine 1 ug / ul DNA 0.5 ul ekleyin. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    3. 10 dakika inkübasyon sırasında, 24 oyuklu plakanın her bir mesafede ortamını çıkarın ve her bir oyuğa 250 ul taze DMEM /% 9 FCS ekleyin.
    4. 10 dakika sonra, reaktif / DNA karışımı halinde, DMEM /% 9 FCS 250 ul ilave edin.
    5. Oyuğuna seyreltildi karışımın 270 ul ekle. 4 saat - 2 37 ° C ve% 5 CO2 inkübatörü içinde inkübe edilir.
    6. Transfeksiyon çözüm çıkarın ve DMEM /% 9 FCS 500 ul ekleyin. 37 ° C,% 5 CO2 inkübatöründe 48 saat - 24 inkübe edin.

4. Hücre Uyarım ve Lusiferaz Deneyi

  1. Taze DMEM /% 9 FCS iyi 250 ul medya değiştirin.
  2. 50 LPS'nin ul veya LPS + IL eklemeKuyusuna istenilen konsantrasyonlarda -10. 37 ° C'de,% 5 CO2 kuluçka plaka dönün. 6 saat - 2 için uyarır.
  3. , Aspirasyon yoluyla uyarma çözümü çıkarın buz PBS ile yıkayın ve 1x Pasif Lizis Tampon 200 ul ekleyin. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında sallayın. Pençe ve 1.5 ml tüpler lizat transferi ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 20,000 x g'de santrifüj uygulanarak hücre kalıntıları uzaklaştırılmıştır.
  4. Aktarım, üreticinin protokolüne uygun olarak lusiferaz sinyallerin saptanması için beyaz, şeffaf dipli, 96 oyuklu plakaya temizlenir lizat (süpernatant) 40 ul.
  5. Tüm görünür ışık spektrumu boyunca bir lüminometre ile lusiferaz sinyalini okuyun.

5. Veri Analizi

  1. Her kuyudan Renilla lusiferaz değerlere göre ateşböceği lusiferaz bireysel değerleri bölerek Renilla oranı: firefly hesaplayın.
  2. Tarafından iyi muamele ve Renilla oranı: firefly bölerek katlık değişime hesaplayınmuamele edilmemiş kuyunun bu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1, RAW264.7 iki transfeksiyon reaktifleri transfeksiyon verimini karşılaştırır. protein / poliamin bazlı transfeksiyon yaklaşık% 5 verim (Şekil 1A) ile sonuçlanırken, lipit bazlı reaktif tipik olarak yaklaşık% 25 transfeksiyon oranı vermiştir. Transfeksiyon etkinliğindeki farklılık pGL3-IκBζ promotör muhabir (Şekil 1B) ile transfekte RAW264.7 hücrelerde lusiferaz sinyaller gözlenmiştir. Bu transfekte edilmiş hücrelere LPS ilave ateşböceği lusiferaz sinyali IκBζ pr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

protokol sadece transfeksiyon verimliliği odaklanmak değil Burada anlatılan, ancak hücrelerin fizyolojik devletlerin verimlilik ve korunması arasında bir denge amaçlamaktadır. Özellikle, bizim prosedür transfeksiyon reaktif toksisitesini en aza indirmek ve lusiferaz sinyali maksimize başarır.

Protokolünde bir kritik adım hücrelerinin sağlıktır. Büyümüş kültürler fizyolojik değişiklikleri ve aynı zamanda hücrelerin, 10 fenotip ve işlevini değiştirmek uzun bir süre için RAW264.7 hüc...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) hibesi ile finanse edilmiştir. STC, CIHR ve Michael Smith Vakfı'ndan doktora araştırma ödülüne sahiptir. EYS, CIHR bursuna sahiptir. CIHR Transplantasyon Eğitim Programı ayrıca STC, EYS ve SS'ye lisansüstü burslar sağlamıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
PureLink HiPure Plazmid Maxiprep KitiYaşam TeknolojileriK210007Herhangi bir maxiprep kiti çalışacaktır
Fenol: kloroform: izoamil alkolYaşam Teknolojileri15593-049Moleküler Biyoloji Sınıfı. Fenol toksiktir, bu nedenle mümkünse çeker ocakta çalışın. Kapta iki kat sıvı oluşuyorsa, alttaki şeffaf organik katmanı kullanın.
DMEMThermo ScientificSH30243.0137 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu.
Fetal sığır serumuThermo ScientificSH30396.0356 ° C'de inaktive edildi; Kullanmadan önce 45 dakika su banyosu yapın.
Opti-MEMYaşam Teknolojileri31985-070Kullanmadan önce en az oda sıcaklığına ısıtın.
XtremeGene HP DBA transfeksiyon reaktifiRoche6366236001Kullanmadan önce oda sıcaklığına ısıtın.
GeneJuiceEMD Millipore70967Kullanmadan önce oda sıcaklığına ısıtın.
5x Pasif Lizis TamponuPromegaE194130 ml, Çift Luciferaz Raportör Test Sistemine dahildir
Çift Lusiferaz Raportör Test SistemiPromegaE1910

Kaynaklar

  1. Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10 (1), 9-18 (2010).
  2. Thompson, C. D., Frazier-Jessen, M. R., Rawat, R., Nordan, R. P., Brown, R. T. Evaluation of methods for transient transfection of a murine macrophage cell line RAW 264.7. Biotechniques. 27 (4), 824-835 (1999).
  3. Kim, T., Eberwine, J. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  4. Stacey, K. J., Sweet, M. J., Hume, D. A. Macrophages ingest and are activated by bacterial DNA. Journal of immunology. 157 (5), 2116-2122 (1996).
  5. Jiang, W., Reich, I. C., Pisetsky, D. S. Mechanisms of activation of the RAW264.7 macrophage cell line by transfected mammalian DNA. Cell Immunol. 229 (1), 31-42 (2004).
  6. Jiang, W., Pisetsky, D. S. The induction of HMGB1 release from RAW 264.7 cells by transfected DNA. Mol Immunol. 45 (7), 2038-2046 (2008).
  7. Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-147 (2009).
  8. Cheung, S. T., So, E. Y., Chang, D., Ming-Lum, A., Mui, A. L. Interleukin-10 inhibits lipopolysaccharide induced miR-155 precursor stability and maturation. PLoS One. 8 (8), e71336(2013).
  9. Weber, M., Moller, K., Welzeck, M., Schorr, J. Short technical reports. Effects of lipopolysaccharide on transfection efficiency in eukaryotic cells. Biotechniques. 19 (6), 930-940 (1995).
  10. Berghaus, L. J., et al. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 33 (5), 443-456 (2000).
  11. Fiszer-Kierzkowska, A., et al. Liposome-based DNA carriers may induce cellular stress response and change gene expression pattern in transfected cells. BMC Mol Biol. 12 (1), 27-36 (2011).
  12. Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (7), 617-626 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Transfeksiyon ProsedürüLipid Bazlı ReaktifPoliamin Bazlı ReaktifFirefly LusiferazRenilla LusiferazHücre LizisiLuminometre AnaliziAkış Sitometrisi
Lusiferaz haberci geni ile RAW264.7 hücreleri transfekte
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.