Makrofaj hücre hattına, RAW264.7'ye transfeksiyon, hücrenin yabancı maddelere karşı doğal tepkisi nedeniyle zordur. Burada, lusiferaz raportör genlerini RAW264.7 hücrelerine transfekte etmek için nazik ama sağlam bir prosedür tanımladık.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Lusiferaz haberci geni ile RAW264.7 hücreleri transfekte
Bu makalede
Özet
Özet
İstenilen genetik materyallerin hücrelere transfeksiyonu, biyomedikal araştırma çalışmalarında kaçınılmaz bir prosedürdür. Çok sayıda yöntem tanımlanmış olsa da, bazı hücre türleri bu yöntemlerin çoğuna dirençlidir ve düşük transfeksiyon verimliliği1 verir, bu da bu hücre tiplerinde araştırmayı potansiyel olarak engeller. Bu protokolde, lusiferaz raportör genlerini RAW264.7 makrofaj hücre hattına bir plazmit DNA olarak tanıtmak için optimize edilmiş bir transfeksiyon prosedürü sunuyoruz. İki farklı transfeksiyon reaktifi türü (lipid bazlı ve poliamin bazlı) tanımlanmıştır ve RAW264.7 hücrelerinin transfeksiyon prosedürü ile minimum düzeyde değiştirildiğinden ve elde edilen herhangi bir deneysel verinin deneysel tedavinin doğrudan sonuçları olduğundan emin olmak için protokol boyunca önemli notlar verilmiştir. Transfeksiyon verimliliği diğer transfeksiyon yöntemlerine kıyasla daha yüksek olmasa da, açıklanan prosedür, hücrelerin uyaranlara fizyolojik tepkisini değiştirmeden RAW264.7'deki lusiferaz sinyalini tespit etmek için yeterince sağlamdır.
Giriş
Hücrelerdeki nükleik asitlerin transfeksiyonu, bilimsel araştırma, çeşitli uygulama vardır. Örnekler (1) raportör genler, gen ekspresyonunda farklı gen elemanları rolünü incelemek için (2) protein ekspresyon plazmidleri ilgili proteini aşın ifade etmek üzere, (3) küçük bir müdahaleci RNA gen ifadesinin aşağı da içermektedir. Belirli genlerin ekspresyon seviyesi manipüle ve bu manipülasyonlar ayırıcı etkisini ölçerek, araştırmacılar, seçilen biyolojik sistemlerde gen işlevlerini ortaya çıkarabilir. Tüm transfeksiyon yöntemleri, aynı transfeksiyon verimliliği sağlar ve hatta aynı transfeksiyon yöntemi, aynı 1 tüm hücre tiplerinin transfeksiyonu etmez. Bu ned....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Plazmid DNA Saflaştırma
- Üreticinin protokolüne göre bir maxiprep kiti kullanılarak plazmid DNA ekstrakte edin. TE tamponu, 500 | il yeniden süspanse plazma DNA.
- Kloroform: Bir fenol gerçekleştirin izoamil alkol çıkarma ve izopropanol yağış kalan bakteri kirleri çıkarmak. LPS varlığı transfeksiyon 9 engeller.
- Plasmid DNA (1, pH 8: 25: 24) ve 15 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır izoamil alkol: kloroform: Fenol 500 ul ekle. Fenol Ciddi yanıklara neden olur ve ağır hasar olduğu kadar yanıklar hep hissettim değildir bu yüzden bir anestezik olduğunu. Davlumbaz izoamil çıkarma ve dikkatli kullanın: kloroform: fenol ge....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1, RAW264.7 iki transfeksiyon reaktifleri transfeksiyon verimini karşılaştırır. protein / poliamin bazlı transfeksiyon yaklaşık% 5 verim (Şekil 1A) ile sonuçlanırken, lipit bazlı reaktif tipik olarak yaklaşık% 25 transfeksiyon oranı vermiştir. Transfeksiyon etkinliğindeki farklılık pGL3-IκBζ promotör muhabir (Şekil 1B) ile transfekte RAW264.7 hücrelerde lusiferaz sinyaller gözlenmiştir. Bu transfekte edilmiş hücrelere LPS ilave ateşböceği lusiferaz sinyali IκBζ pr.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
protokol sadece transfeksiyon verimliliği odaklanmak değil Burada anlatılan, ancak hücrelerin fizyolojik devletlerin verimlilik ve korunması arasında bir denge amaçlamaktadır. Özellikle, bizim prosedür transfeksiyon reaktif toksisitesini en aza indirmek ve lusiferaz sinyali maksimize başarır.
Protokolünde bir kritik adım hücrelerinin sağlıktır. Büyümüş kültürler fizyolojik değişiklikleri ve aynı zamanda hücrelerin, 10 fenotip ve işlevini değiştirmek uzun bir süre için RAW264.7 hüc.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) hibesi ile finanse edilmiştir. STC, CIHR ve Michael Smith Vakfı'ndan doktora araştırma ödülüne sahiptir. EYS, CIHR bursuna sahiptir. CIHR Transplantasyon Eğitim Programı ayrıca STC, EYS ve SS'ye lisansüstü burslar sağlamıştır.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| PureLink HiPure Plazmid Maxiprep Kiti | Yaşam Teknolojileri | K210007 | Herhangi bir maxiprep kiti çalışacaktır |
| Fenol: kloroform: izoamil alkol | Yaşam Teknolojileri | 15593-049 | Moleküler Biyoloji Sınıfı. Fenol toksiktir, bu nedenle mümkünse çeker ocakta çalışın. Kapta iki kat sıvı oluşuyorsa, alttaki şeffaf organik katmanı kullanın. |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu. |
| Fetal sığır serumu | Thermo Scientific | SH30396.03 | 56 ° C'de inaktive edildi; Kullanmadan önce 45 dakika su banyosu yapın. |
| Opti-MEM | Yaşam Teknolojileri | 31985-070 | Kullanmadan önce en az oda sıcaklığına ısıtın. |
| XtremeGene HP DBA transfeksiyon reaktifi | Roche | 6366236001 | Kullanmadan önce oda sıcaklığına ısıtın. |
| GeneJuice | EMD Millipore | 70967 | Kullanmadan önce oda sıcaklığına ısıtın. |
| 5x Pasif Lizis Tamponu | Promega | E1941 | 30 ml, Çift Luciferaz Raportör Test Sistemine dahildir |
| Çift Lusiferaz Raportör Test Sistemi | Promega | E1910 |
Kaynaklar
- Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10 (1), 9-18 (2010).
- Thompson, C. D., Frazier-Jessen, M. R., Rawat, R., Nordan, R. P., Brown, R. T.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
