Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Hücre geçirgen Cys kullanılarak memeli hücrelerinde doğrudan protein teslim

9.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52814

⸱

25 Mart 2015

 , 
1Departments of Chemistry and Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, 2Shanghai Institute for Advanced Immunochemical Studies, ShanghaiTech University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Çinko-Parmak etki doğal olarak hücre-geçirgen ve memeli hücre türlerinin geniş bir aralığı içine protein verilmesinin aracılık edebilmektedir. Burada, hücre içi protein teslimat için çinko-parmak teknolojisi uygulanması için ayrıntılı bir adım-adım protokolü sunulmuştur.

Özet

Modülerlikleri ve çok çeşitli DNA dizilerini tanımak için yeniden programlanabilme yetenekleri nedeniyle, Cys2-His 2 çinko parmak DNA bağlama alanları, hedeflenen genom mühendisliği için yararlı araçlar olarak ortaya çıkmıştır. Diğer birçok DNA bağlayıcı protein gibi, çinko parmaklar da hücre zarlarını geçmek için doğuştan gelen bir yeteneğe sahiptir. Son zamanlarda, bu içsel hücre geçirgenliğinin, hücre içi protein iletimi için kullanılabileceğini gösterdik. Çinko-parmak motiflerinin genetik füzyonu, protein ve enzim yükünün çok çeşitli memeli hücre tiplerine verimli bir şekilde taşınmasına yol açar. Diğer protein transdüksiyon teknolojilerinden farklı olarak, çinko-parmak alanları yoluyla iletim enzim aktivitesini inhibe etmez ve yüksek seviyelerde sitozolik iletimlere yol açar. Burada, memeli hücrelerine protein verilmesi için çinko-parmak teknolojisinin uygulanması için ayrıntılı bir adım adım protokol sunulmaktadır. Yüksek düzeyde hücre içi çinko-parmak aracılı iletim elde etmek için temel adımlar vurgulanmakta ve bu sistemin performansını en üst düzeye çıkarmak için stratejiler tartışılmaktadır.

Giriş

Yüksek verimli ve çok yönlü bir protein teslim stratejileri birçok temel araştırma ve terapötik uygulamalar için kritik öneme sahiptir. hücrelere saflaştırılmış proteinler direkt verilmesi, bunun başarılması için güvenli ve kolay yöntemlerden biri. 1,2 nükleik asitlerin gen ifadesi üzerindeki kullanan stratejiler farklı temsil eder 3-5 proteini dağıtım girmeyle mutagenez riski teşkil bağımsızdır Hücresel transkripsiyon / çeviri makine ve derhal yürürlüğe sağlar. Ancak, proteinlerin üzerine hücre delici aktivitesini endowing basit ve genellenebilir yöntemlerin eksikliği rutin hücre içine doğrudan giriş boşa. Hücre içi protein sağlanmasını kolaylaştırmak için geçerli yöntem, doğal olarak, 6-8 ya da tasarlanan hücre-delici peptidler, 9-12 kompresörlü transdüksiyon etki, 13,14 nano-tanecikleri 15 ve lipozomlar, 16 virüs benzeri partiküller 17,18 meydana kullanımına dayanmaktadır ve polimerik malzemeler Mikroküre. 19 Ne yazık ki, bu yaklaşımların çoğu düşük hücresel alım oranları, 20,21 yoksul kararlılık, 22 yanlışlıkla hücre tipi özgüllük, 23 düşük endozomal kaçış özellikleri 24 ve ek toksisite. 25 tarafından engellenmektedir, birçok protein iletim teknolojileri teslim proteinlerin biyoaktivitesini azaltır. 14

Biz daha önce laboratuarımızda çinko-parmak nükleazı göstermiştir (ZFN) protein - kimerik kısıtlama programlanabilir Cys 2 -His 2 çinko parmak, DNA bağlama proteini ve Fokl sınırlama endonükleazı 26-28 bölünme alanından oluşan endonükleazlar - doğal olarak hücreye olan geçirgen. 29 Bu şaşırtıcı hücre delici etkinlik özel tasarlanmış çinko-parmak etki, hedeflenen genom tr için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır bir DNA-bağlanma platformun bir içsel özelliği olduğu gösterilmiştirMühendisliði, 30-32 ve kabul protein yüzey altı pozitif yüklü kalıntıların takımyıldızı sonucu olduğu. Gerçekten de, c-Jun N-DEK dahil olmak üzere birçok DNA-bağlama proteinleri,., Hücre zarlarını geçme yeteneği doğuştan gelen bir kapasiteye sahip olduğu gösterilmiştir 33 Daha yakın zamanda, laboratuar Bu sonuçlar genişletilmiş göstermiştir ki, çinko-hücre-delici aktivitesi parmak (ZiF) etki hücre içi protein teslimat için kaldıraçlı olabilir. Bir çok geleneksel hücre nüfuz peptit uygulama sistemlerinin aşıldı verimliliği artışa neden oldu spesifik protein yük için bir ya da iki parmak ZiF etki ya da genetik füzyonu. 34 En önemlisi, ZiF aracılı teslim kaynaşık enzimatik kargo aktiviteyi tehlikeye ve kolaylaştırdı Sitozolik teslimat yüksek düzeyde. Topluca, bu bulgular proteinlerin verimli ve kolay teslim kolaylaştırmak için ZiF etki potansiyelini göstermek ve makro potansiyel olarak daha farklı tiplerihücrelere molekülleri.

Burada, memeli hücrelerinde protein temini için ZiF teknolojisi nasıl uygulanacağına ilişkin ayrıntılı adım adım bir protokol verilmektedir. Daha önce bir paketi inşa bir, iki, üç, dört, beş ve altı parmak bağlı α-sarmal DNA bağlayıcı artıkların herbirinin, bir ikame, DNA bağlama yeteneğinden yoksun ZiF etki, ancak hücreler 34 (Şekil 1) içine proteinleri üretmektedirler. İki parmak ZiF etki alanı kullanılarak HeLa hücrelerine Emerald GFP (EmGFP) üretimi ve transdüksiyon tarif edilmektedir. Bu protokol, Escherichia coli içinde çözünür ifade ve hemen hemen her memeli hücre tipinde edebilen hemen hemen herhangi bir protein verecek şekilde uzatılabilir. Beklenen sonuçlar sağlanır ve bu sistemin performansını maksimize etmek için stratejiler de tartışılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Klonlama

  1. PET-28 ifade vektörü sistemi içine alt-klonlandığında, istek (pET-2F-ZiF) üzerine mevcuttur edilmiştir alanin ile ikame edilmiş, iki parmak ZiF etki elde edilir. 34
  2. PCR primerleri ile plazmid zümrüt-pBAD gelen EmGFP amplifiye 5 'Xmal-EmGFP (5'-GGAAATTG CCCGGG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3'; kalın olarak Xma I bölgesi) ve 3 'Sacl-EmGFP (5'-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3' ; kalın Sac sitesi).
    1. Şablon DNA 5 ng, 10x polimeraz tamponu 10 ul damıtılmış / iyonu giderilmiş su oluşur 1 Taq DNA polimeraz, 0.2 mM her bir dNTP Birimi (U) ve geri kalan hacim 100 ul çözelti içinde, her bir primerden 0.2 uM kullanın . Siklusları: 5 dakika boyunca 95 ° C; 30 saniye için 95 ° C 30 döngü, 30 saniye için 55 ° C sıcaklıkta ve 1 dk için 72 ° C; 10 dakika boyunca 72 ° C. Jel extracti PCR ürünü saflaştırmakve Abs 260 x 50 ug / ml ölçen bir spektrofotometre kullanılarak DNA konsantrasyonunu belirlemek.
  3. Özet pET-2F-ZiF ve sınırlama EmGFP kodlayan uç DNA 1 ug başına enzimin 10 u kullanarak 37 ° C 'de 3 saat boyunca tavsiye edilen tamponda Xma I ve Sac I enzimleri. Gibi etidyum bromür gibi floresan interkalasyon boya kullanılarak agaroz jel elektroforezi ile DNA görselleştirmek.
  4. Jel ekstraksiyon kiti ile sindirilmiş DNA arındırın ve ABS 260 x 50 ug / ml ölçen bir spektrofotometre ile DNA konsantrasyonu belirlenir.
  5. Oda sıcaklığında en az 1 saat boyunca T4 DNA ligazı 1 ünite kullanılarak pET-2F-ZiF 50-100 ng saflaştırılmış EmGFP kodlayan DNA Arter. 1 insert-vektör molar oranı: En iyi sonuç için, 6 kullanarak ligasyon reaksiyonu gerçekleştirmek.
  6. Buz üzerinde herhangi bir kimyasal uyumlu XL-1 Mavi E. coli hücreleri 50 ul çözülme ve 10-20 ng lige pET-2F-ZiF-EmGFP bölgesinin ile yavaşça karıştırın.
  7. 3 için buz tutun0 dak. Isı şoku 90 sn için 42 ° C sıcaklıkta karışım ve çalkalanarak 37 ° C'de 1 saat boyunca katabolik baskı (SOC) ile süper optimal suyu 2 ml hücreler geri kazınılmıştır.
  8. 50 ug / ml kanamisin içeren bir lizojeni suyu (LB) agar plakası üzerine geri kültür, 100 ul yayıldı ve 37 ° C 'de O / N inkübe edin.
  9. Bir sonraki gün, Süper Broth (SB), ya da 50 ug / ml kanamisin, 37 ° C'de LB agar plakası ve kültür göre O / N itibaren bir koloni içeren LB kültür 6 ml inoküle.
    Not: Koloni PCR primerlerini 5 'Xmal-EmGFP ve 3' Sacl-EmGFP kullanılarak miniprep önce pozitif klonları tanımlamak için kullanılabilir.
  10. Miniprep ile pET-2F-ZiF-EmGFP arındırmak ve T7 promotörü kullanılarak DNA dizilemesi ile teyit plazmid (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ').

2. İfade ve saflaştırma

  1. Kimyasal yetkili BL21 E. 50 ul çözülme Buz üzerinde coli hücreleri ve PL pET-2F-ZiF-EmGFP 100 ng ile yavaşça karıştırınasmid. Adımlarda 1.7-1.8 açıklandığı gibi Transform.
  2. Ertesi gün, tek bir koloni ile 50 ug / ml kanamisin içeren LB ortamında 10 ml aşılamak ve çalkalanarak 37 ° C'de O / N büyür.
  3. Bir sonraki gün, 50 ug / ml kanamisin,% 0.2 glikoz ve 100 uM ZnCI2 ile takviye edilmiş LB ortamı 1 L O / N kültür 10 ml seyreltik. 0.8, 600 nm (OD 600) de optik bir yoğunluğa kadar çalkalanarak 37 ° C'de kültür büyütün ve 2 mM izopropil-β-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) ve protein ifadesini teşvik eder. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 5000 x g'de santrifüj ile 37 ° C'de büyüme 6 saat, hasat sonrasında, hücreler.
    Not: İndüksiyon koşulları oldukça değişkendir ve ifade edilen proteinlerin istikrar bağlıdır. 0.8 600 ulaşıldığında bir OD kadar OD 600 her 30 dk izleyin.
  4. Liziz tamponu, 5 ml (50 mM Tris-HCI, 500 mM NaCl içinde hücre pelletini, 100 uM ZnCl2, 1 mM ditiyotreitol (DTT), 1mM MgCl2, 1 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF) ve 10 mM imidazol, pH 8.0). Aşağıdaki ayarı ile sonikasyon ile buz üzerinde lizleyin hücreleri: 50% güç çıkışı, / 10 saniye kapalı aralıklarla üzerinde 5 saniye ile 4 dakika işlem süresi. Çözüm aşırı ısınma kaçının.
  5. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 25,000 x g'de hücre lizat santrifüj ve yeni bir toplama tüpüne süpernatant aktarın. En iyi sonuçlar için, 4 ° C'de aşağıdaki adımları uygulayın.
  6. Bir sütun dengelenmiş Ni-NTA bulamacın 1 ml kullanıma hazır süpernatanın çalıştırın. Yıkama tamponu, 20 ml (50 mM Tris-HCI, 500 mM NaCl, 100 uM ZnCI2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2, 30 mM imidazol, pH 8.0) ile reçinenin yıkayın.
  7. 5 yıkama tampon maddesinin ml'si (50 mM Tris-HCI, 500 mM NaCI, 100 uM ZnCI2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2, 300 mM imidazol, pH 8.0) ile proteininin elüt edilmesi.
  8. Tampon saklama tamponu ile elüt protein (50 mM alışverişiTris-HCI, 500 mM NaCI, 100 uM ZnCl2, 1 mM DTT, 1 mM MgCl2 ve% 10 gliserol, pH 8.0) kullanılarak ve imalatçının talimatlarına uygun olarak santrifüj ile bir spin konsantratör kullanılarak en az 40 uM proteinin konsantre edilir.
  9. BCA veya Bradford deneyi ile protein konsantrasyonu belirleyin. 10 dakika boyunca 95 ° C 'de 2 ul 2 x SDS-PAGE yükleme boyası, kaynatma ile saflaştırılmış proteinlerin 2 ul karıştırın ve daha sonra% 4 protein saflık (Şekil 2) üzere% 20 Tris-Glisin, SDS-PAGE gidermek.

3. Protein Depolama

  1. -80 ° C'de, sıvı azotun ve depoda konsantre protein, flaş dondurma alikosu. EmGFP füzyon proteinleri için, ışıktan proteini korumak için alüminyum folyo ile tüp kapsamaktadır.
  2. Tekrarlanan donma ve protein çözeltisi çözülme kaçının. Not: ZiF-kaynaşık proteinler en az 1 ay boyunca bu koşullar altında stabildir. Uygunsuz veya> 4 ay depolama yol açabilirProtein yağış veya EmGFP ve photobleaching.

4. Protein İletimi

  1. % 10 ihtiva eden Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde HeLa hücrelerini muhafaza (h / h) cenin sığır serumu (FBS) ve% 1 antibiyotik-antimikotik% 5 CO2 ile bir tam nemli bir atmosferde 37 ° C 'de.
    Not: Hücreler fazla 30 kat protein iletimi için tavsiye edilmez pasajlandı.
  2. Ön kaplama, 25 ° C'de 30 dakika ila 60 poli-lisin, 50 mg / ml 500 ul, 24 oyuklu bir plaka. Oyuk başına 2 x 10 5 hücre yoğunluğunda 24 kuyulu bir levha üzerine tohum hücreleri. Hücreler% 80 arasında -90% konfluent sonra tohumlama 24 saat sonra ya da her bir gözden ortamını çıkarın ve önceden ısıtılmış serum içermeyen DMEM içinde 500 ul (SFM) ile yıkayın.
  3. Her bir oyuğa, SFM, 250 ul ZiF-EmGFP proteininin 2 uM ve 100 uM ZnCl2 ihtiva eden ekleyin. 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe hücreleri. Not: ZiF etki hücrelerine girmek primarily bir enerji-bağımlı bir mekanizma makropinositozlar, 34 ile. Bu nedenle, hücreleri verimli bir protein içselleştirme 37 ° C'de inkübe edilmesi gerekir.
  4. Kalsiyum ve magnezyum içermeyen 500 ul ile üç kez hücrelerden Ortamı çıkarın ve yıkama Dulbecco fosfat-tamponlu tuzlu su, heparin, 0.5 mg / ml ile takviye edilmiş (DPBS). Not: Heparin, mansap analizler zorlaştırıyor olabilir yüzey bağlı protein kaldırmak için gereklidir.
  5. Gelişmiş teslimat için üç kata kadar (İsteğe bağlı) Tekrar tedavileri.
  6. Hemen 2 dakika süreyle 37 ° C'de% 0.05 tripsin-EDTA ile sindirme ile yıkama heparin sonra muamele edilmiş hücreler izole edin. % 1 FBS ile takviye edilmiş DPBS 0.5 ml müstakil hücreleri yeniden askıya.
  7. Fluoresein izotiyosiyanat (FITC) kanal (Şekil 3) kullanılarak 35 akış sitometrisi ile her bir numunenin floresan yoğunluğu ölçülür. Nüfusu yerleştirmek için ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) ayarlayınFarklı özelliklere sahip popülasyonlar birbirinden çözümlenir sağlamak ölçekte faiz.
  8. Her numune için 10,000 canlı etkinliklerle toplayın ve sadece SOY ile tedavi edilen hücrelere ZiF-EmGFP ile tedavi HeLa hücrelerinde veri analiz yazılımı. 36 Normale floresan flow sitometri kullanarak verileri analiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

İki parmak ZiF-EmGFP füzyon proteinleri E. ifade edilebilir E. coli,>% 95 homojenlik ve yüksek verimle (> 25 mg / ml) (Şekil 2). Genel bir ve iki parmak ZiF füzyon proteinleri, vahşi tip uğratılmamış proteinin kişilerce hemen hemen aynı miktarlarda üretilebilir. Bununla birlikte, bazı bağlamlarda, beş ve altı parmak ZiF füzyon proteinleri alt baş uygulamalar için yeterince yüksek verimlerle üretilmesi mümkün değildir.

37 ° C'de 90 dakika boyunca, ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, hücre-geçirgen çinko-parmağı (ZiF) sahaları kullanılarak protein temini için adım adım bir protokol verilmektedir. ZiF etki kaynaşık enzimatik yük 34 etkinliğini azaltmaz; üretim ve değişikliğe uğratılmamış proteinle birlikte gözlenenler ile hemen hemen aynı mayalarda proteinlerin saflaştırılması için izin verir; ve geleneksel hücre nüfuz peptid ya da protein transdüksiyon alan sistemleri aşan randımanı olan hücre tiplerinin geniş bir aralığı içine proteinler ve enzimler taşıyabilir. Bununla birlikte,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu çalışma ve ShanghaiTech Üniversitesi, Shanghai, Çin (DP1CA174426 Carlos F. Barbas için) (JL) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. Moleküler grafik Pymol kullanılarak elde edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
XmaINew England BiolabsR0180L
SacINew England BiolabsR0156L
Yüksek Kaliteli PCR sistemini genişletinRoche11759078001
dNTP'lerNew England BiolabsN0446S
%4-%20 Tris-Glisin Mini protein jelleri, 1,5 mm, 10 kuyuYaşam TeknolojileriEC6028BOX
2x Laemmli Numune TamponuBioRad161-0737
T4 DNA LigazYaşam Teknolojileri15224-017
BL21 (DE3) Yetkili E. coliNew England BiolabsC2527I
IPTGThermo ScientificR0391
Çinko KlorürSigma-Aldrich208086-5G
Kanamisin SülfatFisher ScientificBP906-5
GlikozSigma-AldrichG8270-100G
Tris BaseFisher ScientificBP152-25
Sodyum KlorürSigma-AldrichS9888-25G
DTT Fisher ScientificPR-V3151 ve nbsp;
PMSFThermo Scientific36978
Ni-NTA Agaroz ReçineQIAGEN30210
GliserolSigma-AldrichG5516-500ML
İmidazolSigma-AldrichI5513-25G
Amicon Ultra-15 Santrifüj Filtre ÜniteleriEMO MilliporeUFC900324
DMEMYaşam Teknolojileri11966-025
Fetal Sığır SerumuYaşam Teknolojileri10437-028
Antibiyotik-Antimikotik Yaşam Teknolojileri15240-062
24 Kuyulu Düz Tabanlı PlakaSigma-AldrichCLS3527-100EA
Poli-LizinSigma-AldrichP7280
DPBS, Kalsiyum Yok, Magnezyum YokLife Technologies21600010
Heparan SülfatSigma-AldrichH4777
TripsinYaşam Teknolojileri
25300054 HeLa hücreleriATCCCCL-2
Nano Damla ND-1000 spektrofotometre Thermo Fisher Scientific
QIAquick PCR Arıtma KitiQIAGEN28104
QIAquick Jel Ekstraksiyon KitiQIAGEN28704

Kaynaklar

  1. Berg, A., Dowdy, S. F. Protein transduction domain delivery of therapeutic macromolecules. Curr. Opin. Biotechnol. 22, 888-893 (2011).
  2. Lindsay, M. A. Peptide-mediated cell delivery: application in protein target validation. Curr. Opin. Pharmacol. 2, 587-594 (2002).
  3. Luo, D., Saltzman, W. M. Synthetic DNA delivery systems. Nat. Biotechnol. 18, 33-37 (2000).
  4. Guo, X., Huang, L. Recent advances in nonviral vectors for gene delivery. Acc. Chem. Res. 45, 971-979 (2012).
  5. Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).
  6. Frankel, A. D., Pabo, C. O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell. 55, 1189-1193 (1988).
  7. Elliott, G., O'Hare, P. Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein. Cell. 88, 223-233 (1997).
  8. Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J. Biol. Chem. 269, 10444-10450 (1994).
  9. Smith, B. A., et al. Minimally cationic cell-permeable miniature proteins via alpha-helical arginine display. J. Am. Chem. Soc. 130, 2948-2949 (2008).
  10. Daniels, D. S., Schepartz, A. Intrinsically cell-permeable miniature proteins based on a minimal cationic PPII motif. J. Am. Chem. Soc. 129, 14578-14579 (2007).
  11. Karagiannis, E. D., et al. Rational design of a biomimetic cell penetrating peptide library. ACS Nan. 7, 8616-8626 (2013).
  12. Gao, S., Simon, M. J., Hue, C. D., Morrison, B., 3r,, Banta, S. An unusual cell penetrating peptide identified using a plasmid display-based functional selection platform. ACS Chem. Biol. 6, 484-491 (2011).
  13. Fuchs, S. M., Raines, R. T. Arginine grafting to endow cell permeability. ACS Chem. Biol. 2, 167-170 (2007).
  14. Cronican, J. J., et al. Potent delivery of functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo using a supercharged protein. ACS Chem. Biol. 5, 747-752 (2010).
  15. Panyam, J., Labhasetwar, V. Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue. Adv. Drug Deliv. Rev. 55, 329-347 (2003).
  16. Zelphati, O., et al. Intracellular delivery of proteins with a new lipid-mediated delivery system. J. Biol. Chem. 276, 35103-35110 (2001).
  17. Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. Protein delivery using engineered virus-like particles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 16998-17003 (2011).
  18. Voelkel, C., et al. Protein transduction from retroviral Gag precursors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7805-7810 (2010).
  19. Sinha, V. R., Trehan, A. Biodegradable microspheres for protein delivery. J. Control Release. 90, 261-280 (2003).
  20. Liu, J., Gaj, T., Patterson, J. T., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd Cell-penetrating peptide-mediated delivery of TALEN proteins via bioconjugation for genome engineering. PLoS One. 9, e85755(2014).
  21. Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Res. 24, 1020-1027 (2014).
  22. Fuchs, S. M., Raines, R. T. Polyarginine as a multifunctional fusion tag. Protein Sci. 14, 1538-1544 (2005).
  23. Mai, J. C., Shen, H., Watkins, S. C., Cheng, T., Robbins, P. D. Efficiency of protein transduction is cell type-dependent and is enhanced by dextran sulfate. J. Biol. Chem. 277, 30208-30218 (2002).
  24. Al-Taei, S., et al. Intracellular traffic and fate of protein transduction domains HIV-1 TAT peptide and octaarginine. Implications for their utilization as drug delivery vectors. Bioconjug. Chem. 17, 90-100 (2006).
  25. Jones, S. W., et al. Characterisation of cell-penetrating peptide-mediated peptide delivery. Br. J. Pharmacol. 145, 1093-1102 (2005).
  26. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010).
  27. Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188, 773-782 (2011).
  28. Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases. J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).
  29. Gaj, T., Guo, J., Kato, Y., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd Targeted gene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins. Nat. Methods. 9, 805-807 (2012).
  30. Gersbach, C. A., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, Synthetic zinc finger proteins: the advent of targeted gene regulation and genome modification technologies. Acc. Chem. Res. 47, 2309-2318 (2014).
  31. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).
  32. Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Gersbach, C. A. Advances in targeted genome editing. Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 268-277 (2012).
  33. Cronican, J. J., et al. A class of human proteins that deliver functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo. Chem. Biol. 18, 833-838 (2011).
  34. Gaj, T., Liu, J., Anderson, K. E., Sirk, S. J., Barbas, C. F., 3rd, Protein delivery using Cys2-His2 zinc-finger domains. ACS Chem. Biol. 9, 1662-1667 (2014).
  35. Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. Basics of flow cytometry. Methods Mol. Biol. 91, 1-24 (1998).
  36. Mercer, A. C., Gaj, T., Sirk, S. J., Lamb, B. M., Barbas, C. F. 3rd Regulation of endogenous human gene expression by ligand-inducible TALE transcription factors. ACS Synth. Biol. 3, 723-730 (2014).
  37. Segal, D. J., Crotty, J. W., Bhakta, M. S., Barbas, C. F. 3rd, Horton, N. C. Structure of Aart, a designed six-finger zinc finger peptide, bound to DNA. J. Mol. Biol. 363, 405-421 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Ak SitometrisiProtein Safla t rmaGen F zyonuBakteriyel EkspresyonH cre Transd ksiyonuFloresan ProteinSitozolik letim
Hücre geçirgen Cys kullanılarak memeli hücrelerinde doğrudan protein teslim
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.