İnsan monoklonal antikorlarının sentezi, oto-antikor aracılı immün yanıtların patofizyolojik mekanizmalarını çözmeyi amaçlayan çalışmaların ilk basamağıdır. B hücresi izolasyonu, antikor klonlaması ve in vitro sentez dahil olmak üzere kanla sınıflandırılmış B hücrelerinden rekombinant insan immünoglobulin G (IgG) monoklonal antikorları üretmek için bir protokol geliştirdik.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Ölümsüzleştirilmiştir Sıralama B hücrelerinden Rekombinant İnsan IgG Monoklonal Antikorlarının Üretimi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
İnsan monoklonal antikorlarının üretilmesi için yeni yöntemler bulmak, immünoterapötiklerin geliştirilmesi de dahil olmak üzere hem temel hem de uygulamalı bilimler için önemli olan aktif bir araştırma alanıdır. Bununla birlikte, bu tür antikorları tanımlama ve üretme teknikleri zorlu olma eğilimindedir ve bazen antikorların ağır ve hafif zincir çifti ayrışır. Burada, Epstein-Barr Virüsü (EBV) ve Toll benzeri reseptör 9 aktivasyonu ile ölümsüzleştirme kullanarak insan periferik kan mononükleer hücrelerinden insan rekombinant monoklonal antikorları üretmek için nispeten basit ve anlaşılır bir protokol açıklıyoruz. Yeterli bir boyama ile, antikor üreten B hücreleri, daha sonra ölümsüzleştirme ve klonal genişleme için izole edilebilir. Ölümsüzleştirilmiş B hücresi klonları tarafından üretilen antikor transkriptleri, PCR ile amplifiye edilebilir, karşılık gelen ağır ve hafif zincir çiftleri olarak dizilenebilir ve immünoglobulin ekspresyon vektörlerine klonlanabilir. Bu teknikle elde edilen antikorlar, otoimmünite de dahil olmak üzere ilgili insan bağışıklık tepkilerini incelemek ve yeni terapötikler için temel oluşturmak için güçlü araçlar olabilir.
Giriş
Bu maddenin amacı, detaylı bir şekilde oluşturabilir ve insan periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC), elde edilen insan IgG monoklonal antikorları karakterize etmek için bir yöntem tanımlamaktır.
insan antikorları incelemek için faiz araştırma birçok farklı alanda büyüdü. Özellikle, birçok araştırma grupları oto-antikorların 1-3 kaynaklanan patoloji ilgilendi. Biz klonlanmış ve patojenik oto-antikorlar 1 nitelendirmiştir. oto-antikorların çalışma rakip antikorlar 4 kullanan, örneğin, kendi hedefleri tespit etmek ve tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olabilir. Ayrıca, insan antiko....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Aydınlatılmış onam çalışmanın katılımcılardan elde edilmiştir. Çalışma kurumsal etik komitesi tarafından onaylandı.
Çevresel Kan Tek Çekirdekli Hücrelerin İzolasyonu 1. (PBMC)
- Santrifüj Kan çıkarma sonra en kısa sürede 15 dakika 900 x g'de en katılımcıların heparinlenmiş kan 25 ml. Daha az kan varsa, buna göre reaktif küçültün. Bir kaputu tüm sonraki adımları uygulayın.
- Temiz bir tüpe serum aktarın. Bu otomatik antikorları test etmek için, PBMC dondurma ya da otoimmün hastalar durumunda sonraki adımda kullanılabilir.
- RPMI 1640 ortam 10 ml kan sulandırmak ve yukarı ve aşağı pipetleme hücreleri tekrar süsp....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
CD22 ve IgG pozitif hücrelerin boyanması sonrası ayırma yolluk, Şekil 1 'de gösterilmiştir, bu görüntü, çift pozitif hücrelerin alanı -. IgG antikorları üreten B hücrelerinin - Ayrı bir tüp içinde bu hücreler sıralamak için seçilir. Analizde, toplam PBMC'lerin yaklaşık% 1'i bu çifte pozitif nüfusa karşılık gelmektedir. Elde edilen kriteri hücrelerin sayısı Bölüm 1 'de elde edilen hücrelerin sayısına bağlıdır.
EBV ölümsüzleşme ve CpG (ODN2006) uyaranların 5 ha.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu yazıda, insanlara özgü PBMCs'den elde IgG antikorlarının üretilmesi için tüm adımları ayrıntılı bir şekilde sunulmaktadır. Bu protokol daha önce yayınlanmış tekniklere göre bazı avantajlara sahiptir. Avantajlarından biri üretilen antikor B hücresi klonu orijinal çiftine karşılık gelen ağır ve hafif zincirleri tutmasıdır. IgG antikorlarının tanımlanması insan vericinin her türlü yapılabilir, ve aşı 5 nedeniyle bağışıklık tepkisi alevlenme için bir ihtiyaç vardır. bir besleme hücresi olarak fıbroblast hü.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.
Teşekkürler
Araştırma sözleşmesi Miguel Servet (ISCIII CD14 / 00032) (GN-G.). Bilimsel Araştırmalar "Translational Neuroscience Programı Enstitüsü" Hollanda Teşkilatı (022005019) (CH) den Kardeşliği.
Prinses Beatrix Fonds (Proje WAR08-12) ve Ortaklık Française contre les Miyopatiler için hibeler (PM-M.); yanı sıra Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü bir Veni Bursu (916.10.148) Hollanda Beyin Vakfı burs ile (FS2008 (1) -28) ve ML Prinses Beatrix Fonds (Proje WAR08-12) ( ).
Biz flow sitometri göre sıralama B-hücresi ona yardım için Jozien Jaspers teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Histopak-1077 | Polisükroz ve sodyum diatrizoat içeren | Sigma-Aldrich | 10771 |
| FACSAria II hücre sıralayıcı | BD Biyobilimler & nbsp; | ||
| 96 U-tabanlı mikro kuyu plakası | Costar | 3799 | |
| Gelişmiş Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 orta | Gibco, Life Technologies | 12633-020 | |
| B95-8 hücre hattının %30 v/v EBV içeren süpernatanı | ATCC | CRL-1612 | 3,4 x 108 kopya/ml |
| CpG2006 | Invivogen | ODN 7909 | |
| Wi38 hücreleri | Sigma-Aldrich | 90020107 | |
| İnterlökin-2 | Roche | ||
| ELISA plakaları | Greiner Bio-One, Microlon | 655092 | |
| F (ab ') 2, Parça Keçi, Anti-İnsan IgG, Fc & gama; Fragment Specific (konjugee olmayan) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-008 | |
| %4 yağsız kuru süt (Blotting Grade Blocker) | Biorad | 170-6404 | |
| İnsan IgG | Sigma | I 2511 | İNSAN IgG saflaştırılmış İmmünoglobulin, 5.6 mg / ml |
| Keçi F (ab) 2 < / sub> antihuman IgG Fc & gama; (peroksidaz (PO) ile konjuge edilmiş) | Jackson ImmunoResearch | 109-036-008 | |
| ELISA okuyucu (Perkin Elmer 2030) | Perkin Elmer | 2030-0050 | |
| Peroksidaz konjuge AffiniPure Tavşan Anti-İnsan IgM, Fc5 & mikro; | Jackson ImmunoResearch | 309-035-095 | |
| SuperScript III Hücreleri Doğrudan cDNA Sentez Sistemi | Canlandırıcı | 18080-200 | |
| Uygulamalı Biyosistemler (ABI) GeneAm PCR Sistemi 2700 | Uygulamalı Biyosistemler | ||
| Yüksek Saf RNA İzolasyon Kiti | Roche | 11828665001 | |
| Ters transkripsiyon sistemi kiti | Promega | A3500 | |
| Rekombinant Taq DNA Polimeraz | TAKARA | R001A | |
| Primerleri (2 & mu; l) | Sigma | ||
| Ultra Saf Agaroz | Invitrogen | 16500-500 | |
| 100 bp merdiven | Invitrogen | 15628-019 | |
| Miktar Bir 4.5.2 (Gel Doc 2000) | Biorad | 170-8100 | |
| QIAquick PCR saflaştırma kiti | QIAGEN | 28106 | |
| BigDye Terminator v3.1 döngü sıralama kiti ve nbsp; | Applied Biosystems | 4337455 | |
| 0.1 ml reaksiyon plakası (MicroAMP Optik 96 kuyulu) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Genetik analizör ABI300 | Uygulamalı Biyosistemler | 4346906 | |
| DH5 ve alfa; yetkin hücreler (E. coli) | İnvitrojen | 18263-012 | |
| pFUSEss-CHIg-hG1 (4,493 bp) | Invivogen | pfusess-hchg1 | |
| pFUSEss-CHIg-hG4 (4,484 bp) | Invivogen | pfusess-hchg4 | |
| pFUSE2ss-CLIg-hk (3,875 bp) | Invivogen | pfuse2ss-hclk | |
| pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3,883 bp) | Invivogen | pfuse2ss-hcll2 | |
| SOC ortamı | Invitrogen | 15544-034 | |
| LB bazlı agar besiyeriZeocin (Fast-Media Zeo Agar) ile desteklenmiş | Invivogen | fas-zn-s | |
| Müthiş Et Suyu (TB) bazlı sıvı besiyeri, Zeocin (Fast-Media Zeo TB) ile desteklenmişInvivogen | fas-zn-l | ||
| DNA Miniprep kiti | Omega Bio Technology | D6942-02 | |
| Nanodrop (ND1000 Spektrofotometre) | Blasticidin | ||
| LB bazlı agar besiyeriInvivogen | fas-bl-s | ||
| Müthiş Et Suyu (TB) bazlı sıvı besiyeriBlasticidin (Fast-Media Blast TB) ile desteklenmiş | Invivogen | fas-bl-l | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | 20.000 U/ml, 10x NEBuffer EcoRI |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | 10.000 U/ml, 10x NEBuffer 2.1 |
| 2-Log DNA merdiveninde | New England Biolabs | N3200S | 0.1-10.0 kb, 1.000 μ g/ml |
| XmaI | New England Biolabs | R0180S | 10.000 U/ml, 10x CutSmart Tamponunda |
| BsiWI | New England Biolabs | R0553S | 10.000 U/ml, 10x NEBuffer 3.1 |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | 5.000 U/ml, 10x CutSmart Buffer |
| FastAP Isıya Duyarlı Alkalin Fosfataz | Thermo Scientific | EF0651 | 1 U/&mikro; l, 10x FastAP Tamponu |
| DH5 ve alfa; yetkili hücreler ve nbsp; | Invitrogen | 18263-012 | |
| PE Fare Anti-İnsan IgG | BD Pharmingen | 555787 | |
| anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Klon: HIB22 | Fisher bilimsel | BDB563942 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kiti ve nbsp; | QIAGEN | 27106 | |
| BigDye Terminator v3.1 | Uygulamalı Biyosistemler | 4337455 |
Kaynaklar
- Vrolix, K., et al. Clonal heterogeneity of thymic B cells from early-onset myasthenia gravis patients with antibodies against the acetylcholine receptor. J Autoimmun. 52, 101-112 (2014).
- Yamashita, M., Katakura, Y., Shirahata, S.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
