Yöntem makalesi

Ölümsüzleştirilmiştir Sıralama B hücrelerinden Rekombinant İnsan IgG Monoklonal Antikorlarının Üretimi

18.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52830

⸱

5 Haziran 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School for Mental Health and Neuroscience, Maastricht University, 2Department of Neurosciences, Institut d'Investigació Germans Trias i Pujol

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

İnsan monoklonal antikorlarının sentezi, oto-antikor aracılı immün yanıtların patofizyolojik mekanizmalarını çözmeyi amaçlayan çalışmaların ilk basamağıdır. B hücresi izolasyonu, antikor klonlaması ve in vitro sentez dahil olmak üzere kanla sınıflandırılmış B hücrelerinden rekombinant insan immünoglobulin G (IgG) monoklonal antikorları üretmek için bir protokol geliştirdik.

Özet

İnsan monoklonal antikorlarının üretilmesi için yeni yöntemler bulmak, immünoterapötiklerin geliştirilmesi de dahil olmak üzere hem temel hem de uygulamalı bilimler için önemli olan aktif bir araştırma alanıdır. Bununla birlikte, bu tür antikorları tanımlama ve üretme teknikleri zorlu olma eğilimindedir ve bazen antikorların ağır ve hafif zincir çifti ayrışır. Burada, Epstein-Barr Virüsü (EBV) ve Toll benzeri reseptör 9 aktivasyonu ile ölümsüzleştirme kullanarak insan periferik kan mononükleer hücrelerinden insan rekombinant monoklonal antikorları üretmek için nispeten basit ve anlaşılır bir protokol açıklıyoruz. Yeterli bir boyama ile, antikor üreten B hücreleri, daha sonra ölümsüzleştirme ve klonal genişleme için izole edilebilir. Ölümsüzleştirilmiş B hücresi klonları tarafından üretilen antikor transkriptleri, PCR ile amplifiye edilebilir, karşılık gelen ağır ve hafif zincir çiftleri olarak dizilenebilir ve immünoglobulin ekspresyon vektörlerine klonlanabilir. Bu teknikle elde edilen antikorlar, otoimmünite de dahil olmak üzere ilgili insan bağışıklık tepkilerini incelemek ve yeni terapötikler için temel oluşturmak için güçlü araçlar olabilir.

Giriş

Bu maddenin amacı, detaylı bir şekilde oluşturabilir ve insan periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC), elde edilen insan IgG monoklonal antikorları karakterize etmek için bir yöntem tanımlamaktır.

insan antikorları incelemek için faiz araştırma birçok farklı alanda büyüdü. Özellikle, birçok araştırma grupları oto-antikorların 1-3 kaynaklanan patoloji ilgilendi. Biz klonlanmış ve patojenik oto-antikorlar 1 nitelendirmiştir. oto-antikorların çalışma rakip antikorlar 4 kullanan, örneğin, kendi hedefleri tespit etmek ve tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olabilir. Ayrıca, insan antikorlarının çalışma aynı zamanda, aşı 5 sonrası bağışıklık tepkisini değerlendirmek için maruz kalan ve belirli bir patojen 6 ya da çalışma için dirençli haline geldi kişilerin antikor profilini karakterize etmek için, örneğin, araştırmanın diğer alanlarda, ilgi hangi Antikorlar olanDoğal repertuar 7,12.

Çeşitli teknikler, rekombinant insan monoklonal antikorlarını üretmek için 8-12 geliştirilmiştir; Bunların çoğu, faj görüntüleme ve B hücre immortalizasyonunu kullanımı. Faj gösteriminin kullanımı, geniş ölçüde, yeni antikorlar 13 keşfedilmesi için uygulanmıştır. Ancak haline insan immünoglobulin ağır ve hafif zincir çiftinin işleminde ayrışmış, yani bu, önemli bir dezavantajı vardır. Insan B hücreleri ya da EBV dönüşümü ile hibridomlar üretimi bu dezavantajı ortadan kaldırır.

Biz Toll-like reseptör 9 (TLR-9) 6,12'dir yoluyla poliklonal B hücre stimülasyonu ile birlikte EBV ile timik B hücrelerinin enfeksiyonu kullanın.

Bu yazıda ayrıntılı olarak in vitro antikor nesil PBMC izolasyondan tüm adımların eksiksiz bir bakış ile, IgG insan antikorlarının gelişmesi için kullanmak teknolojiyi tanımlamak. BuProtokol insan IgG profilin her tür analizi için kullanılabilir. Laboratuvarımızda, IgG antikorları üreten B hücreleri başarıyla sıralama sonra PBMC'lerin geri kalanından ayrılmış oylandı. Elli kriteri B hücreleri 8 daha sonra, çok oyuklu plakalara plakalanır ve bir B hücrelerinin klonal genişleme için, EBV ve TLR 9 aktivasyonu ile immortalize olabilir. Besleyici hücreler olarak, insan embriyonik akciğer dokusundan fibroblastlar, ölümsüzleştirilmiş B hücreleri görüntülenmesini kolaylaştırır hücre çizgisi WI38 kullanılmıştır. Bu B hücreleri, immünoglobulin ağır ve hafif zincirlerinin sekansları, PCR ile elde edilebilir, ve antikor genleri immünoglobülin G sentezleme vektörlerine klonlanmış ve in vitro koşullarda üretilen. Bu tekniği kullanarak, donör bulundu aynı antikor dizisi ile tek antikorlar ele alınabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Aydınlatılmış onam çalışmanın katılımcılardan elde edilmiştir. Çalışma kurumsal etik komitesi tarafından onaylandı.

Çevresel Kan Tek Çekirdekli Hücrelerin İzolasyonu 1. (PBMC)

  1. Santrifüj Kan çıkarma sonra en kısa sürede 15 dakika 900 x g'de en katılımcıların heparinlenmiş kan 25 ml. Daha az kan varsa, buna göre reaktif küçültün. Bir kaputu tüm sonraki adımları uygulayın.
  2. Temiz bir tüpe serum aktarın. Bu otomatik antikorları test etmek için, PBMC dondurma ya da otoimmün hastalar durumunda sonraki adımda kullanılabilir.
  3. RPMI 1640 ortam 10 ml kan sulandırmak ve yukarı ve aşağı pipetleme hücreleri tekrar süspansiyon.
  4. Yeni 50 ml tüp polisükroz ve sodyum Diatrizoate (1.077 g / ml) ihtiva eden bir çözeltiye, 15 ml ilave edilir.
  5. Yavaşça tüpler yakın sonuçlar almak için, iki açıklıklar getirerek aşama 1.4'te çözeltisinin üzerine kan tabakaonun iki sıvı temas çok yavaş gelir ve daha sonra 50 ml tüp üstünde yavaş PBMC süspansiyonu süzün kadar. Bu adım, PBMC'lerin iyi bir şekilde ayrılmasını olması kritik önem taşır.
  6. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında fren yapmadan, 400 x g'de aşama 1.5 'de elde edilen bir tüp santrifüjleyin.
  7. Santrifüj işleminden sonra, pipetle PBMC'leri içeren tüp, orta kısmında görünen beyaz halka kurtarın.
  8. RPMI 1640 ortam, 25 ml hücreleri yıkayın.
  9. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında, 300 xg santrifüjleyin.
  10. Süpernatantı atın ve adım 1.9 olarak tekrar RPMI 1640 Santrifüj 10 ml hücreleri yıkayın.
  11. Daha önce 14 bildirildiği gibi bir Neubauer odasına sahip PBMC'leri sayın.
  12. Bölüm 2'de olduğu gibi PBMC'leri işleyin veya aşağıdaki gibi daha sonra kullanmak üzere saklayın: 10 milyon PBMC'ler adım 1.2'de elde edilen% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) ve% 90 serum 1 ml seyreltilmiş cryovial tüp başına dondurma için. Kademeli ve uzun sto için Freezesıvı nitrojen içinde öfke.

2. Boyama PBMC'leri Hücre Sitometrisi ile CD22 + ve IgG + Ayırma

  1. (L-glutamin, 10 mM HEPES tampon maddesi, 50 U / ml penisilin, 50 ug / ml streptomisin ve cenin sığır serumu,% 10 ile takviye edilmiş) tam RPMI 1640 ortamı 6 ml ile 25 cm2 hücre kültürü şişesi içinde PBMC'ler Plate ve onları% 5 CO 2 37 ° C'de inkübatör O / N kurtarmanızı sağlar.
  2. Steril% 4 albümini fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi, O / N steril FACS tüpler bloke eder. PBS ile iki kez yıkanır tüpleri ve tam RPMI 1640 ortamı içinde 500 ul ile doldurun. Sıralama sonra hücrelerin kurtarmak için bu tüpler kullanın.
  3. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 400 x g'de, bir tüp ve santrifüj PBMC'ler toplayın.
  4. Etiketleme tampon hücreleri (bkz 2.5 ve 2.6 adımları) tekrar süspansiyon ve bunları 14 saymak. etiketleme tamponu, steril% 2 fetal sığır serumu ve 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), P içindeBS.
  5. 10 5 hücre, her biri 3 floresans ile aktive edilmiş hücre tasnifi (FACS) tüpler hazırlayın ve markalama tampon 100 ul bunları tekrar süspansiyon. Bu tüpler sıralama kapılarını tanımlamak için hizmet edecektir.
    1. Birinci tüp içinde, üçüncü bir tüp içinde, ikinci boru 20 (üretici veri sayfasında önerilir) anti-IgG PE ul ve hiçbir şekilde, (imalatçının veri sayfasında önerilir) anti-CD22 antikoru PerCP 5 ul ekle. 30 dakika boyunca buz üzerinde ve karanlıkta inkübe edin.
  6. Süspanse 5.000.000, bir FACS tüpü içinde etiketleme tamponu, 200 ul hücre ve anti-CD22 PerCP 10 ul anti IgG PE 40 ul ekle. 30 dakika boyunca buz ve karanlık üzerine inkübe hücreleri. Hücrelerin daha yüksek bir sayıda sıralama isteniyorsa, tüm reaktifleri büyütmek.
  7. Oda sıcaklığında, 5 dakika için düşük bir fren ile, 400 x g'de santrifüje hücreleri.
  8. Usulca süpernatant Durusu.
  9. 500 μ hücrelerin yeniden süspanseEtiketleme tamponu. Oda sıcaklığında, 5 dakika için düşük bir fren ile, 400 x g'de santrifüje hücreleri. Tekrarlayın 2.7 ve 2.8 adımları
  10. Yumuşak süpernatant boşaltacaktır ve RPMI tam ortam içinde 300 ul hücreleri tekrar süspansiyon.
  11. 0.45 um'lik bir filtreden hücreleri geçirin. Hücreler sıralamak için hazırız.

B Hücreleri CD22 + ve IgG 3. Sıralama +

  1. Hücrelerin canlılığını kurmak için 3 kontrol tüpleri kullanın. Hiçbir boyama ile kontrolde, lenfosit yolluk tanımlamak için ileri ve boyut dağılım grafiğini kullanın. CD22 PerCP ve anti-IgG PE kontrol kapıları ve sıralama kapısı kurmak için hizmet vermektedir. Önceden bildirilen verilerin 15 Aşağıdaki gerçekleştirin.
    Not: Bir kapı büyük bir kümesinden, bizim durumumuzda hücrelerinde, cytometric olayların belirli bir grup izole etmek için hizmet değer limitleri (sınırları) bir dizi. Bir sıralama kapısı değer sınırları söz konusu içinde olan sitometrik olaylar, hücrelerin giderilmesini sağlartanımlanmış sınırlar: CD22 + ve IgG +.
  2. Sıralama bir toplama tüpü gibi, adım 2.2 elde edilen tam RPMI 1640 orta 500 ul, bloke tüpler kullanın.
  3. Çift pozitif 15'e sıralamak için devam edin: CD22 + IgG +. Her durumda hücrelerin nihai numarasını not alın. Plaka en kısa sürede besleyici hücreler üstünde hücreler kriteri.

Besleyici 4. Hücrelerin Işınlama

Not: 1 arasındaki besleyici hücreler hazırlanmasını gerçekleştirin - sıralamadan önce 3 gün. En az 5000 WI38 hücre, 96 hafta oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına ihtiyaç vardır. Adımları bir başlık 4.1, 4.2 ve 4.4 gerçekleştirin.

  1. Hücrenin, istenen sayıda ulaşılana kadar 37 ° C'de ve% 5 tam RPMI 1640 ortamı içinde CO2 (PBMC ile aynı) de WI38 hücre geliştirin.
  2. 16 önce tarif edilen bir protokol izlenerek, 50 Grays onları ışın tedavisi. WI38 hücreler tripsinize ve C içinde yeniden süspansiyon haline edildikten sonra ışınlama gerçekleştirmeRPMI ortamı veya kültür şişesine bağlı ve ışınlama sonrası tripsinize WI38 ile omplete. WI38 hücrelerinin tedarikçi tarafından gösterilen tripsinizasyonla yöntemini izleyin. (Toplam PBMC% 1 adımında 1.11 sayılır) IgG + B hücreleri kaplama için gerekli kuyuları karşılamak için gerekli hücrelerin sayısını ışın tedavisi.
  3. Levha 5000 ihtiva eden 90 | il 96 hafta çukurlu bir levhanın her çukuruna WI38 hücre ışınlanmış. (Daha hızlı buharlaşmasına çünkü) boş bir levha dış satırda kuyular bırakın ve sadece hücreleri kaplama için plakanın ortasında 60 kuyu kullanın. 200 ul PBS ile plaka çerçeveleyici dış kuyu doldurun.
  4. Gerekli olana kadar,% 5 CO2 seviyesinde 37 ° C'de bir kuluçka yerleştirin.

5. Kaplama sıralama PBMC'ler, EBV enfeksiyonu ve Büyüyen

  1. 96 hafta oyuklu plaka (daha önce kaplama wit 1640 komple ortam oyuk başına RPMI 50 ul 50 hücreleri plaka, sıralanmış PBMC'ler seyreltilirH WI38 ışınlanmış hücreleri) içerir. EBV iş için donatılmış bir kaput adımları uygulayın.
    Not: oyuk başına 50 hücre enfeksiyonu optimize edilmiş ve bir monoklonal antikor üretmek için 8 likehood arttırır, ancak 1,6 önce tarif edildiği gibi PCR ile, bu kontrol etmek için önerilmektedir.
  2. 96 çukurlu yuvarlak plaka 17 her göre - (4 x 10 8 viral kopya / ml 3 ihtiva eder), EBV süpernatan 60 ul ekle. DİKKAT EBV çalışması sırasında alınmalıdır.
  3. CpG 1 ug / ml (ODN2006) oyuk başına ekleyin.
  4. % 5 CO2 37 ° C'de bir kuluçka hücreleri bırakın.
  5. Bir hafta sonra mikroskop altında büyüyen Görme monitör klon.
    Not: B hücresi büyümesinin bazı örnekleri sonuç bölümünde aşağıda görülebilir. Klonların bu büyüme oranları değişebilir dikkat ve ekstra zaman iyi ortasında büyüyen bazı hücre kütlesi görmeye başlamak için gerekli olabilir.
  6. 1. İki hafta sonraışık mikroskobu altında büyüyen ve ilk medya değişimi devam s monitör klon. Yavaş yavaş oyuk üst kısmından orta 90 ul pipetleme ve temiz bir 96-çukurlu plaka içinde toplayın. (B hücreleri kuyunun dibinde yalan, bu yüzden onları aspire riski yoktur).
    1. Her çukuruna CpG (ODN2006) 1 ug / ml IL2 50 U / ml ile desteklenmiş tam RPMI 1640 ortamı içinde 100 ul ekle. Klonlar büyümekte, adım 6'daki gibi ELISA ile ilk ortam değişimi analiz eder.
  7. Artan klon izlemek ve 3. ve ortam 90 ul alarak ve CpG (ODN2006) 1 ug / ml ve 50 U / ml ile desteklenmiş tam RPMI 1640 ortamı, 100 ul ekleyerek tekrar büyüyen 4. haftadan sonra ortamı değiştirmek IL2. Aşama 6'daki gibi ELISA ile IgG üretimi izlemek için toplanan süpernatant kullanın.
    Not: büyüyen bir ay klon yuvarlak hücrelerin agrega tha gözlemleyerek belirgin olmalıdır sonrat genellikle iyi yuvarlak alt ortasında yalan.
  8. Bu aşamada, aynı şekilde ortamı değiştirmek önceki hafta ancak tam RPMI 1640 medya ile. İyi bir gösterge o sarımsı hücrelerin bir medya alışverişi ihtiyaç haline geliyor eğer ortamı değiştirmek için doğru anı, medya renk bilmek.
  9. 96 oyuklu plakalar, büyük klonlar (yaklaşık 5 x 10 5 hücre) ihtiva eden zaman, bir 24-yuvalı plakanın düz bir oyuğuna transfer edin. Yeni kuyu tam RPMI 1640 medya 300 ul ekleyin. Yukarı pipetleme ve homojen dağıtan yeni kuyuya birkaç kez, ve transfer hücreleri, aşağı, 96-iyi büyüyen klon yeniden süspanse. Gerektiğinde yeni medya ekleyin.
    1. 24 oyuklu bir plakanın gözleri de hücreleri (yaklaşık olarak 5 x 10 6 hücre) dolu olduğunda, 6 kuyucuklu bir levhanın düz bir oyuğuna transfer. Iyi yeni tam RPMI 1640 medya 2 ml ekleyin. Yukarı pipetleme ve birkaç kez aşağı 24 plaka hücrelerin tekrar ve onlara homojen bir dağıtımınıcihaz- yeni kuyuda.
  10. Gerektiğinde Medya ekle. Hücreler kültür içinde muhafaza edilmesi için ise, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de pelet hücreleri. ELISA testi için süpernatantlar saklayın. 5 dakika boyunca 400 x g hızında tekrar 1 x PBS, santrifüj ile bir kez hücre topağı yıkayın ve RNA ekstraksiyonu kadar -80 ° C'de kuru saklanır.
    1. 6-çukurlu plaka içindeki hücreler konfluent (yaklaşık 20 x 10 6 hücre) olduğunda, bir 60 mm kültür plakasına aktarılır. Yeni bir levha tam RPMI 1640 ortamı içinde 4 ml ekleyin. Bitmiş gibidir, onları 6 plaka hücrelerin yeniden süspanse ve transferi 5.9 ve 5.10 adımları.
  11. Gerektiğinde yeni medya ekleyin. % 90 fetal dana serumu içinde 30 milyon / ml ve% 10 DMSO - Bu adımda, 10 hücreleri dondurma. Hücrelerin büyük miktarlarda istedi ise, daha büyük yüzey plakalarda klonların genişleme devam ediyor.

IgG Antikor Algılama 6. ELISA

  1. Iyi bir ELISA plaka o 50 ul / dağıtımf keçi F (ab ') 2 anti-insan Fc antikoru kaplama tampon maddesi içinde 1 200 seyreltilmiştir. Kaplama tampon maddesi 50 mM Na-2 CO 3 pH 9.6 içerir.
  2. Plastik bir etiket ile plakaları Seal, ve 37 ° C 'de 1 saat inkübe edilir. Seçenek olarak ise, 4 ° de CO / N inkübe edin.
  3. Yıkama tamponu içinde 200 ul her bir göze 6 kez yıkayın. Yıkama tamponu,% 0.05 Tween-20 1 x PBS içinde içerir. Dokunmak veya antikor bağlı olan kuyu yüzeyi çizmeyin.
  4. Bloklama tamponu, 100 | il / oyuk ile bloke edin. Bloke edici tamponun PBS içinde yağsız kuru süt% 4 içerir. Plaka kapatın ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edilir.
  5. Yıkamayın. Engelleme tampon atın ve artık sıvıyı çıkarmak için bir kağıt havlu üzerine ters plaka 3 kez tokat.
  6. Klonları süpernatantlar ve standartları inkübe edin.
    1. İlk testte, adım 5.6 veya RPMI 5.7 1/3 elde edilen klon süpernatantlar sulandırmak. Standartlar RPMI orta insan IgG çözeltisi ile seyreltilmiş için almak için: 1000 ng /mi, 500 ng / ml, 250 ng / ml, 125 ng / ml, 62.5 ng / ml, 31.25 ng / ml, 15.6 ng / ml ve boşluk. De / 50 ul kullanarak ve 60 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Böyle 1/10 ya da 1/100 olarak antikor afinite test etmek için klon 'süpernatanının daha dilüsyonları, analiz edin.
  7. Adım 6.3 yapıldığı gibi yıkayın.
  8. Inkübasyon tamponu içinde 20,000: keçi F 50 ul / oyuk kullanarak (ab) 2 anti-insan IgG Fc peroksidaz 1 seyreltilmiş konjuge. Kuluçka tampon 1x PBS içinde% 1 BSA ve% 0.02 Tween 20 içerir. 60 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
  9. Adım 6.3 yapıldığı gibi yıkayın.
  10. % 0.1 3,3 'ihtiva eden 100 | il / kaynak hülasa çözüm, 5,5'-tetrametilbenzidin (TMB). Kuyularda istikrarlı bir mavi renk oluşana kadar 10 dakika inkübe edin. Dikkat et; Çok uzun beklemek yok!
  11. 2 MH 2 SO 4 50 ul ekleyerek reaksiyonu durdurun. Reaksiyonun kesilmesinden sonra 30 dakika içinde, 450 nm'de emilimi ölçün.
    Not: Tüm klonlar 'ınboş fazla 3 standart sapma ile upernatants IgG insan antikorları için pozitif kabul edilir. Pozitif klonların teyidi için bu ELISA, aynı klonun farklı süpernatanlarında en az üç kez tekrarlanmalıdır. Ayrıca belirsiz çapraz reaktivite olasılığını atmak için süpernatantlar kaplanmamış inkübe ancak kuyuları bloke edildiğinde hiçbir sinyal yok olduğundan emin olmak için tavsiye edilir. Bu aşamada, bir algılama tahlil, ilgi konusu Antikorların Antijenik Spesifisitesi bölüm 7'ye devam etmek için önce gerçekleştirilebilir taranması için.

Üretim IgG Klonların 7. RNA İzolasyon ve ilk şerit cDNA sentezi

  1. IgG üretimi ELISA ile teyit edilir en kısa sürede, klon RNA ayıklayın.
  2. Adımlarda 5.7 veya 5.9 büyüyen hücrelerden RNA çıkarılması için, 10.000 hücrelerinden bir hücre DNA elde edilmesine izin verir üst simge III hücreleri doğrudan cDNA sentez kiti kullanın.
  3. Lar RNA çıkarmak için birHücrelerin ger miktarları ya adım 5.11 saklanan pelet yüksek saf RNA izolasyon kiti kullanın. RNA ekstraksiyonu diğer sistemler de bu aşamada uygun olabilir. Üreticinin talimatları izleyin.
  4. Hücre sayıları için ters transkripsiyon sistemi kullanımı 4 10 x 6 10 x 1 ila 1, üreticinin talimatı takip. İlk iplik cDNA sentezi için diğer sistemler de kullanılabilir.

8. 1. ve Ağır büyütülmesi ve IgG üreten B-hücresi Klonlarının hafif zincirler için 2. PCR

  1. Aşama 6 IgG ELISA'da aşama 5,6 ve 5.7 ve pozitif elde edilen hücre klonları, cDNA ile, Tablo 1 'de listelenen primerleri ile PCR gerçekleştirin.
  2. Her IgG ağır, kappa ve lambda zinciri için bağımsız PCRlar ayarlayın. Ileri bir stok solüsyonu yapın ve eşit konsantrasyonlarda primerler ters. 0.4 uM nihai konsantrasyonda reaksiyona ekleyin.
  3. 1 ST PCR gerçekleştirmek için cDNA sentezi 1 ul kullanın. Burada, Takara Taq üretici talimatları kullanarak 20 ul reaksiyonları gerçekleştirmek. Alternatif olarak, diğer polimerazları kullanın.
  4. Aşağıdaki döngü koşulları altında 1 st PCR yerleştirin: 5 dakika boyunca 94 ° C; (50 döngü: 30 saniye için 94 ° C; 45 sn için 30 saniye için 58 ° C ve 72 ° C; 72 ° C, 7 dakika boyunca, reaksiyon 4 ° C.Include boş soğumasını sağlar, olası kirlilikleri tespit etmek.
  5. 1x TBE (89 mM Tris-borat, 2 mM EDTA) hazırlayın. 1x TBE 100 ml bir hacim içinde agaroz (% 1 agaroz jeli) 1 g ekleyin. Agaroz çözülür alır dek yaklaşık 1 dakika süreyle mikrodalgada çözüm ısıtın. Daha sonra, 10 mg / ml etidyum bromür (ya da eşdeğer DNA boyası) 4 ul eklenir ve karıştırılır.
    1. Bir tepsiye dökün ve içeriği polimerize olur kadar bekleyin. Bantları görselleştirmek için jel PCR karışımı 5 ul çalıştırın. Ağır zincir fragmanı400 bp - hafif zincir yaklaşık 300 olması gerekirken, 550 bp - s 400 civarında olmalıdır. Bantları algılanmazsa, 2. PCR benzer şekilde devam eder.
  6. 2. PCR gerçekleştirmek için mix ilk PCR 1 ul kullanın. Adım 8.2 ama primerlerin uygun karışımı kullanarak (Tablo 1), aynı reaktifler kullanın. 2. PCR kullanımı, aşağıdaki şartlar için: 5 dakika boyunca 94 ° C; ;: (30 saniye için 94 ° C; 30 sn için 56.5 ° C, 55 sn için 72 ° C, 50 döngü) 7 dakika için 72 ° C; 4 ° C'de soğumaya bırakın. Olası PCR kirliliklerinin tespit tepki olarak bir boş, ekleyin.
  7. 8.5 de tarif edildiği gibi, bir agaroz jeli hazırlayın. 9. adımda klonlama için doğru boyut fragmanları ihtiva amplifikasyonlar kullanın ve adım 10 antikorları üreten 8.5.1 gibi PCR ürünü görselleştirmek için jel çalıştırın.
  8. Sekansı içeren 10 ul bir reaksiyon kullanılarak, DNA: 2. PCR, 0 100 ng.Astar veya primer karışımının, sonlandırıcı 1 ul ve tamponu 1 ul 2 iM. (:; 5 sn için 50 ° C; 10 sn için 96 ° C ve 4 dakika için 60 ° C 25 döngü;): bu koşullar altında dizileme reaksiyonu gerçekleştirmek 7 dakika için 60 ° C; 4 ° C'de soğumaya bırakın.
  9. Üreticinin talimatlarını takip microspin G50 sütunları ile sıralama reaksiyonları arındırın. 18 daha önce tarif edildiği gibi otomatik bir dizi analiz ligasyon sekanslarını değerlendirir. Elektroferogramları temiz ve tek bir immünoglobülin dizisine karşılık gelmelidir.
    Not: PCR ürünleri belirsiz ya da karışık immünoglobulin dizileri gösteriyorsa, izole dizileri almak ve sonra 9. adıma geçmek için, TopoTA sistemini kullanarak bunları klonlamak düşünün lütfen.

9. klonlanması ve Üretim IgG klonlarının ağır ve hafif zincirlerinin dizilenmesi

  1. Vektörlerinin DNA 'nın 1 ug pFUSE2ss-CLIg-hk, pFUSE2ss- hazırlanmasıCLIg-HL2 ve pFUSEss-CHIg-HG1.
  2. Uygun kısıtlama enzimleri ile bu gibi vektörler Digest. PFUSEss-CHIg-HG1 için kullanın Eco RI ve pFUSE2ss-CLIg-HL2 için pFUSE2ss-CLIg-hk, Eco RI ve Avr II BSI WI ve Eko UR ve NheI. Vektörün DNA 1 ug her bir sınırlama enzimi 3 adet kullanın.
    1. Tek enzim sindirimi ve bir PCR Arıtma Kit ile sindirilmiş ürünü arındırmak. İkinci enzim ile sindirimi ve (imalatçının protokolüne göre) göre bir Gel Extraction Kit ile saflaştırılması. Agaroz jelden ilgi fragmanını kesin. Adım 8.5 olarak agaroz jel hazırlayın.
  3. Eko RI ve BSI WI kappa zincir amplifikasyonu için, Eko RI ve Avr II lambda zincir amplifikasyonu için, ve Eko RI ve Nhe ben ağır zincir yükseltilmesi için: üreten IgG klonu 2. PCR ürünleri Digest. Bir enzim ile sindirimi ve P ile sindirilmiş ürünü saflaştırmakCR Arıtma Kiti. İkinci enzim sindirimi ve bir PCR Arıtma Kit ile sindirilmiş ürünü arındırmak. Adım 9.2 gibi enzimler ve DNA miktarı aynı birimleri kullanın.
  4. T4 DNA ligaz 16 ° CO / N aşağıdaki üreticinin önerilerine vektörlerin iç PCR parçaları Arter. 1 olmalıdır Kullanılan oran: 2 (vektör: insert).
  5. DH5α bakterilerini transforme etmek için ligasyon 1 ul kullanın. Dönüşüm DH5α üreticinin 'koşullarını uyun. Olarak kullanılan vektör tipine bağlı olarak, blasticidin ve zeosin levhalarda bakterileri. 37 ° C'de plakalar O / N inkübe edin.
  6. Üreticinin talimatlarını izleyerek, tek koloniler büyür ve miniprep kiti ile DNA ayıklayın. Tek koloni için kullanın büyümek ve DNA DNA miniprep kiti üreticinin, öneriler ekstraksiyon. Adım 9.2 ve 9.3 olarak vektörler ve ekler hazırlanması için kullanılan enzimleri ile sindirme ile analiz eder.
  7. Sekans DNA usin görevektör g 100 ng adımlar 8.8 ve 8.9 de yapıldığı gibi.

HEK hücreleri Antikorların 10. Üretim

  1. 150 mm'lik bir hücre kültür plakasına% 75 konfluansa kadar 10% fetal buzağı serumu,% 1 L-glükoz,% 1 penisilin / streptavidin (DMEM +) ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 'de HEK hücreleri büyütün. Bir kaputu gerçekleştirin 10,1-10,7 adımları.
  2. Transfeksiyondan önce, fetal buzağı serumu olmadan önceki gibi ancak orta orta değişimi.
  3. Her bir ağır hafif zincir Transfeksiyon için, (PEI (serumsuz) DMEM, 2.5 ml, ağır zincirli vektör 9 ug, hafif zincir ile vektörün 6 ug ve polietilenimin, 100 ul bir transfeksiyon karışımı hazırlamak 1 ug / ml stok) çözeltisi (). 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  4. Yavaşça plakadaki HEK hücrelerine aşama 10.3 hazırlanan transfeksiyon karışımı 2.5 ml ekleyin. Homojen dağıtmak için plakayı sallayın.
  5. Içinde24 saat boyunca% 5 CO2 37 ° C'de inkübatör hücrelerin cubate.
  6. Fetal buzağı serumsuz ortama kültür ortamı değiştirin.
  7. 4 gün sonra plakaları orta toplayın.
    Not: ortam antikorlar, in vitro ve in vivo olarak reaktifliklerini karakterize etmek için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

CD22 ve IgG pozitif hücrelerin boyanması sonrası ayırma yolluk, Şekil 1 'de gösterilmiştir, bu görüntü, çift pozitif hücrelerin alanı -. IgG antikorları üreten B hücrelerinin - Ayrı bir tüp içinde bu hücreler sıralamak için seçilir. Analizde, toplam PBMC'lerin yaklaşık% 1'i bu çifte pozitif nüfusa karşılık gelmektedir. Elde edilen kriteri hücrelerin sayısı Bölüm 1 'de elde edilen hücrelerin sayısına bağlıdır.

EBV ölümsüzleşme ve CpG (ODN2006) uyaranların 5 ha...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu yazıda, insanlara özgü PBMCs'den elde IgG antikorlarının üretilmesi için tüm adımları ayrıntılı bir şekilde sunulmaktadır. Bu protokol daha önce yayınlanmış tekniklere göre bazı avantajlara sahiptir. Avantajlarından biri üretilen antikor B hücresi klonu orijinal çiftine karşılık gelen ağır ve hafif zincirleri tutmasıdır. IgG antikorlarının tanımlanması insan vericinin her türlü yapılabilir, ve aşı 5 nedeniyle bağışıklık tepkisi alevlenme için bir ihtiyaç vardır. bir besleme hücresi olarak fıbroblast hü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

Teşekkürler

Araştırma sözleşmesi Miguel Servet (ISCIII CD14 / 00032) (GN-G.). Bilimsel Araştırmalar "Translational Neuroscience Programı Enstitüsü" Hollanda Teşkilatı (022005019) (CH) den Kardeşliği.

Prinses Beatrix Fonds (Proje WAR08-12) ve Ortaklık Française contre les Miyopatiler için hibeler (PM-M.); yanı sıra Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü bir Veni Bursu (916.10.148) Hollanda Beyin Vakfı burs ile (FS2008 (1) -28) ve ML Prinses Beatrix Fonds (Proje WAR08-12) ( ).

Biz flow sitometri göre sıralama B-hücresi ona yardım için Jozien Jaspers teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Histopak-1077 Polisükroz ve sodyum diatrizoat içerenSigma-Aldrich10771
FACSAria II hücre sıralayıcı BD Biyobilimler & nbsp;
96 U-tabanlı mikro kuyu plakası Costar3799
Gelişmiş Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 orta Gibco, Life Technologies12633-020
B95-8 hücre hattının %30 v/v EBV içeren süpernatanı   ATCCCRL-16123,4 x 108 kopya/ml
CpG2006 InvivogenODN 7909
Wi38 hücreleri Sigma-Aldrich90020107
İnterlökin-2Roche 
ELISA plakalarıGreiner Bio-One, Microlon655092
F (ab ') 2, Parça Keçi, Anti-İnsan IgG, Fc & gama; Fragment Specific (konjugee olmayan)Jackson ImmunoResearch109-006-008
%4 yağsız kuru süt (Blotting Grade Blocker) Biorad170-6404
İnsan IgG SigmaI 2511İNSAN IgG saflaştırılmış İmmünoglobulin, 5.6 mg / ml
Keçi F (ab) 2 < / sub> antihuman IgG Fc & gama; (peroksidaz (PO) ile konjuge edilmiş)Jackson ImmunoResearch109-036-008
ELISA okuyucu (Perkin Elmer 2030) Perkin Elmer 2030-0050
Peroksidaz konjuge AffiniPure Tavşan Anti-İnsan IgM, Fc5 & mikro;   Jackson ImmunoResearch309-035-095
SuperScript III Hücreleri Doğrudan cDNA Sentez Sistemi Canlandırıcı 18080-200
Uygulamalı Biyosistemler (ABI) GeneAm PCR Sistemi 2700Uygulamalı Biyosistemler
Yüksek Saf RNA İzolasyon Kiti Roche11828665001
Ters transkripsiyon sistemi kiti PromegaA3500
Rekombinant Taq DNA PolimerazTAKARAR001A
Primerleri (2 & mu; l)Sigma
Ultra Saf Agaroz Invitrogen16500-500
100 bp merdivenInvitrogen15628-019
Miktar Bir 4.5.2 (Gel Doc 2000)Biorad170-8100
QIAquick PCR saflaştırma kitiQIAGEN28106
BigDye Terminator v3.1 döngü sıralama kiti ve nbsp;Applied Biosystems4337455
0.1 ml reaksiyon plakası (MicroAMP Optik 96 kuyulu)Applied Biosystems4346906
Genetik analizör ABI300 Uygulamalı Biyosistemler4346906
DH5 ve alfa; yetkin hücreler (E. coli)İnvitrojen18263-012
pFUSEss-CHIg-hG1 (4,493 bp)Invivogenpfusess-hchg1
pFUSEss-CHIg-hG4 (4,484 bp) Invivogenpfusess-hchg4
pFUSE2ss-CLIg-hk (3,875 bp)Invivogenpfuse2ss-hclk
pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3,883 bp) Invivogenpfuse2ss-hcll2
SOC ortamıInvitrogen15544-034
LB bazlı agar besiyeriZeocin (Fast-Media Zeo Agar) ile desteklenmişInvivogenfas-zn-s
Müthiş Et Suyu (TB) bazlı sıvı besiyeri, Zeocin (Fast-Media Zeo TB) ile desteklenmişInvivogenfas-zn-l
DNA Miniprep kiti Omega Bio TechnologyD6942-02
Nanodrop (ND1000 Spektrofotometre)Blasticidin
LB bazlı agar besiyeriInvivogenfas-bl-s
Müthiş Et Suyu (TB) bazlı sıvı besiyeriBlasticidin (Fast-Media Blast TB) ile desteklenmişInvivogenfas-bl-l
EcoRINew England BiolabsR0101S20.000 U/ml, 10x NEBuffer EcoRI
NheINew England BiolabsR0131S10.000 U/ml, 10x NEBuffer 2.1
2-Log DNA merdivenindeNew England BiolabsN3200S0.1-10.0 kb, 1.000 μ g/ml
XmaINew England BiolabsR0180S10.000 U/ml, 10x CutSmart Tamponunda 
BsiWINew England BiolabsR0553S10.000 U/ml, 10x NEBuffer 3.1
AvrIINew England BiolabsR0174S5.000 U/ml, 10x CutSmart Buffer 
FastAP Isıya Duyarlı Alkalin FosfatazThermo ScientificEF06511 U/&mikro; l, 10x FastAP Tamponu
DH5 ve alfa; yetkili hücreler ve nbsp;Invitrogen18263-012
PE Fare Anti-İnsan IgGBD Pharmingen555787
anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Klon: HIB22Fisher bilimselBDB563942
QIAprep Spin Miniprep Kiti ve nbsp;QIAGEN27106
BigDye Terminator v3.1Uygulamalı Biyosistemler4337455
çözeltisi10799068001 AffiniPure, (Fast-Media Blast Agar) ile desteklenmiş Nanodrop

Kaynaklar

  1. Vrolix, K., et al. Clonal heterogeneity of thymic B cells from early-onset myasthenia gravis patients with antibodies against the acetylcholine receptor. J Autoimmun. 52, 101-112 (2014).
  2. Yamashita, M., Katakura, Y., Shirahata, S. Recent advances in the generation of human monoclonal antibody. Cytotechnology. 55 (2-3), 55-60 (2007).
  3. Pereira, K. M., Dellavance, A., Andrade, L. E. The challenge of identification of autoantibodies specific to systemic autoimmune rheumatic diseases in high throughput operation: Proposal of reliable and feasible strategies. Clin Chim Acta. 437, 403-410 (2014).
  4. Losen, M., et al. Treatment of myasthenia gravis by preventing acetylcholine receptor modulation. Ann N Y Acad Sci. 1132, 174-179 (2008).
  5. Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
  6. Fraussen, J., et al. A novel method for making human monoclonal antibodies. J Autoimmun. 35 (2), 130-134 (2010).
  7. Traggiai, E., et al. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).
  8. Fraussen, J., et al. Autoantigen induced clonal expansion in immortalized B cells from the peripheral blood of multiple sclerosis patients. J Neuroimmunol. 261 (1-2), 98-107 (2013).
  9. Yamashita, M., et al. Different individual immune responses elicited by in vitro immunization. Cytotechnology. 40 (1-3), 161-165 (2002).
  10. Hui-Yuen, J., Koganti, S., Bhaduri-McIntosh, S. Human B cell immortalization for monoclonal antibody production. Methods Mol Biol. 1131, 183-189 (2014).
  11. Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
  12. Lanzavecchia, A., Corti, D., Sallusto, F. Human monoclonal antibodies by immortalization of memory B cells. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 523-528 (2007).
  13. Traggiai, E. Immortalization of human B cells: analysis of B cell repertoire and production of human monoclonal antibodies. Methods Mol Biol. 901, 161-170 (2012).
  14. Strober, W., et al. Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol / edited by. John E. Coligan ... [et al.]. Appendix 3, Appendix 3A(2001).
  15. Ibrahim, S. F., van den Engh, G. Flow cytometry and cell sorting. Adv Biochem Eng Biotechnol. 106, 19-39 (2007).
  16. Leith, J. T., Padfield, G., Faulkner, L. E., Quinn, P., Michelson, S. Effects of feeder cells on the X-ray sensitivity of human colon cancer cells. Radiother Oncol. 21 (1), 53-59 (1991).
  17. Hui-Yuen, J., McAllister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-McIntosh, S. Establishment of Epstein-Barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines. J Vis Exp. (57), 3321(2011).
  18. Smith, L. M., et al. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

EBV l ms zle tirmeToll benzeri Resept r 9 AktivasyonuB H cresi zolasyonuAk SitometrisiELISA TespitiPCR Amplifikasyonumm noglobulin KlonlamaOtoimm nite Ara t rmas

İlgili makaleler