Yöntem makalesi

Bir Koaksiyel Memesini kullanma Pluripotent Kök Hücre Aljinat Encapsulation

DOI:

10.3791/52835

⸱

2 Temmuz 2015

 , 
1Center for International Research on Integrative Biomedical System, Institute of Industrial Science, The University of Tokyo

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pluripotent kök hücreleri (PS hücreleri) bir koaksiyel nozul kullanarak aljinat hidrojel kapsüllerine kapsüllemek için bir yöntem oluşturduk. Bu, hücrelerin aşırı toplanmasını önler ve süspansiyon kültüründeki hücrelerin yaşadığı kesme stresini sınırlar. Teknik, PS hücrelerinin seri üretiminin yanı sıra kök hücre nişi üzerine yapılan araştırmalara da uygulanabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pluripotent kök hücreler (PS hücreleri), rejeneratif tıp ve ilaç taramasındaki rolleri nedeniyle yoğun araştırmaların odak noktasıdır. Bununla birlikte, bu uygulamalarda PS hücrelerinin kullanılması için bir kitle kültürü sisteminin geliştirilmesi gerekecektir. Süspansiyon kültürü, PS hücrelerinin seri üretimi için umut verici bir kültür yöntemidir, ancak agregasyonun kontrol edilmesi ve kültür ortamından kaynaklanan kesme geriliminin sınırlandırılması gibi bazı sorunlar hala çözülmemiştir. Bu sorunları çözmek için, bir koaksiyel nozul kullanarak bir kalsiyum aljinat (Alg-Ca) kapsülleme yöntemi geliştirdik. Bu yöntem,N2 gazını birlikte akıtarak kapsüllerin boyutunu kolayca kontrol edebilir. Kontrol edilebilir kapsül çapı 500 μm'den büyük olmalıdır, çünkü çok yüksek bir N2 gazı akış hızı damlacıkların ve dolayısıyla heterojen boyutlu kapsüllerin parçalanmasına neden olur. Ayrıca, düşük bir Alg-Na ve CaCl2 konsantrasyonu, küresel olmayan kapsüllere neden olur. Alg-PLL kaplaması olmayan bir Alg-Ca kapsülü, hücrelerin toplanmasını sağlayarak kolayca çözülse de, Alg-PLL kaplaması olmayan kapsüllerden de potansiyel olarak sızabilirler. Gerçekten de, bir aljinat-PLL kaplaması hücresel sızıntıyı önleyebilir ancak kırılması da zordur. Bu teknoloji, kök hücre nişinin yanı sıra PS hücrelerinin seri üretimini araştırmak için de kullanılabilir, çünkü kapsülleme, hücre dışı matris ve salgılanan faktörlerin konsantrasyonu dahil olmak üzere hücreleri çevreleyen mikro ortamı değiştirebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPS hücreleri), rejeneratif tıptaki rolleri nedeniyle şu anda yoğun araştırmaların kaynağıdır. Bununla birlikte, doku yenilenmesi için çok miktarda hücre gereklidir. Örneğin, tip 1 diyabetik bir hasta için gereken yaklaşık bir milyar pankreas hücresi1. Bununla birlikte, konvansiyonel çanak kültürü sadece 1 × 105 hücre/cm2 elde edebilir, bu nedenle tip 1 diyabetik bir hastayı tedavi etmek için yeterli kök hücre türevi pankreas hücresi elde etmek için 1m2 kültür alanı gerektirir. Bu nedenle, rejeneratif tıp için mikrotaşıyıcı2 ve süspansiyon kültürü gibi pluripotent kök hücrelerin kitle kültürü için bir sistemin geliştirilmesi gereklidir. Süspansiyon kültürü, umut verici bir kitle kültürü yöntemini temsil eder, ancak insan iPS hücrelerinin doğrudan süspansiyon kültürlerinde hücrelerin agregasyonunu kontrol etmek zordur3. Gerçekten de, asılı hücreler, hücre hasarına3 veya farklılaşmaya4 neden olan kesme stresine maruz kalır.

Hidrojel bazlı kapsülleme araştırması, süspansiyon kültürü ile ilgili sorunları çözmek için yapılmıştır. Hidrojel kapsüllerde, hücreler ortamın akışından korunur. Önceki raporlar, hücresel kapsülleme için agaroz5, PEG6 ve aljinat (Alg) dahil olmak üzere çeşitli hidrojel türlerinin kullanımını belgelemiştir. Alg-Ca hidrojel, hücre kapsüllemesi için en kullanışlı hidrojellerden biridir, çünkü Alg-Ca hidrojel, aljinat çözeltisini birCaCl2 çözeltisine düşürdükten hemen sonra oluşur ve ayrıca enzimler veya şelatlama reaktifleri tarafından kolayca sindirilir.

Burada, bir koaksiyel nozul kullanarak iPS hücreleri için stabil bir aljinat kapsülleme işlemi oluşturduk. Damlacıklar oluşturmak içinN2 gaz akışını kullanarak, hücreleri yağ gibi diğer reaktiflere ihtiyaç duymadan tek tip kapsüller halinde kapsüllemek mümkündür. Bu yöntemde,N2'nin akış hızı ve hemCaCl2 hem de aljinatın konsantrasyonu, kapsüllerin boyutunu, şeklini ve homojenliğini etkileyen ana çalışma koşullarıdır. Bu rapor, bir yüksek hızlı kamera ve bir mikroskop kullanılarak bu çalışma koşullarının optimizasyonunu göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hazırlanması Malzemeler

  1. 10 mM HEPES tamponu hazırlayın. RT'de 7.0 pH ayarlayın ve% 0,9 ile NaCl ekleyin.
  2. 1,1 hazırlanan HEPES-tamponlu tuzlu su karıştırılarak% 5 aljinat çözeltisi ve 10 mM EDTA solüsyonu hazırlayın. Oda sıcaklığında 7.0 pH ayarlayın.
  3. 121 ° C'de 20 dakika için reaktifler (1.1, 1.2) Otoklav.
  4. DMEM,% 10 ES nitelikli FBS ve 90, mitomisin C, 10 ug / ml ihtiva eden içinde kuluçkalama ile besleyici hücreler olarak kabul edilir 2.0 x 10 6 fare embriyonik akciğer fibroblast (MEF) hücreleri, - 1.2 katmanlı jelatin kaplı 60 mm'lik yemekler hazırlamak - 120 dk.
  5. (ES nitelikli FBS% 20, 2-merkaptoetanol, temel olmayan amino asit ve antibiyotik 50 uM içeren 5 ml DMEM yüksek glikoz mevcudiyetinde besleyici hücreler ile tabağına hücreleri (IPS) fare uyarılmış pluripotent kök bakımı Penisilin G Sodyum, streptomisin sülfat, 100 ug / ml, 100 birim / ml ve amphoteri 250 ng / mlcin B).
  6. Tohum 4 × 10 5 iPS bir jelatin kaplı 60 mm çanak hücreleri ve CO 2 37 ° C'de inkübe ve% 5. Inkübasyon sırasında kültür ortamı her gün değiştirin. 3 sonra, - kültür 4 gün, 37 ° C'de% 0.05 tripsin,% 0.02 EDTA ihtiva eden 500 ul 1 dakika% 5 CO2 hücreleri trypsinize. Bundan sonra, kültür çanak on kere dokunarak hücreleri ayırmak.
  7. 3 dakika boyunca 160 x g'de santrifüj hücre süspansiyonu (üç kez 1.000 ul mikropipet ile pipetleme tek hücre içine ayrışma fare iPS hücrelerinin takiben) FBS ve antibiyotik ES-nitelikli% 10 ile DMEM 2.5 ml ekleyin ve süpernatant kaldırmak ve hücre sayımı . Hücre sayımı sonrasında, bir jelatin-kaplı tabak üzerinde toplanan hücreler kalkarlar ve MEF hücrelerinden iPS hücrelerini izole etmek için 30 dakika boyunca inkübe edin. Hücrelerin sayılmasından sonra (genellikle 1-3 x 10 6 hücre / çanak toplanabilir), 4 x 10 5 iPS hücrelerini reseedçanak.

Aljinat Hidrojel Kapsüller içine 2. Hücre Encapsulation

  1. 1.5 ve 1.6 de tarif edilen ayni yöntem vasıtasıyla hücreleri toplamak. 3 dakika boyunca 160 x g'de santrifüj sonra, üç kez HEPES tamponlu salin ile iPS hücresi pelet yıkayın. HEPES-tamponlu tuzlu su içinde hücrelerin yeniden süspansiyona sonra, başka şekilde memeyi tıkayabilecek büyük topaklar ortadan kaldırmak üzere bir 40 um'lik bir hücre süzgecinden hücre süspansiyonu filtre edin.
  2. HEPES-tamponlu tuzlu su içinde hücre süspansiyonu 2 ml ve% 5 Alg-Na çözeltisi 3 ml karıştırın. Son olarak% 3 Alg-Na çözeltisi içinde hücre 5 ml süspansiyon elde edilir. Hücre yoğunluğu tercihen en fazla 10 6 hücre / ml 'dir.
  3. 5 ml enjektöre hücre süspansiyonu topladıktan sonra, şırınga üzerindeki bir eş eksenli meme (Şekil 1A, B) yüklemek ve şırınga pompası bunları ayarlayın. Emit N2 gazı akışı (düşük 1L / dakika daha) eş-eksenli, memenin dış iğne yoluyla veİç memeden hücre süspansiyonu sınırdışı.
  4. % 0.5 CaCI2 çözeltisi 250 ml damlacıklar toplamak ve 10 bekle - 60-90 rpm'de karıştırılırken katılaşma işlemi için 20 dakika.

Aljinat Capsule'lerden 3. Tedavi (isteğe bağlı)

  1. % 0.05 Alg-Ca-kapsüller inkübe poli-L-lisin (PLL), 37 ° C'de, 5 dakika için çözelti ve% 5 (w / v) CO2.
  2. HEPES-tamponlu tuzlu su ile yıkama işleminden sonra kapsül, DMEM yüzeyleri üzerindeki elektrik yükü nötralize etmek için% 10 FBS ihtiva eden inkübe. Kaplanmış kapsüller (Şekil 1C) olarak kullanmaktadır.
  3. 5 dakika boyunca 10 mM EDTA ihtiva eden HEPES-tamponlu tuzlu su içinde kapsül inkübe edin. EDTA ile muamele edilmiş kapsüller boş kapsüller (Şekil 1C) olarak kullanılır.

Aljinat Kapsüllerinde 4. Kültür ve toplayın Hücreler

  1. 37 ° C ve% 5 CO2 ile çalkalanarak 75 rpm'de kapsüllenmiş hücreleri inkübe10 gün boyunca uygulanır.
  2. Toplamak ve 10 dakika boyunca CO2, 37 ° C'de, 10 mM EDTA içinde kapsül inkübe ve% 5. 3 dakika boyunca 1000 x g'da santrifüjleme ile PLL muamelesi olmadan aljinat kapsüllerinden hücreleri toplamak.
  3. 5 dakika boyunca 5,000 × g - aljinat kapsüller PLL ile tedavi ise, yukarı ve aşağı pipetleme on kat yaklaşık 1.000 bir şırınga ve santrifüj bunu bağlı bir iğne ile tarafından Alg-PLL membran bölünürler. İğne çapı kapsül boyutu ve 25 g (260 um) iğnelerin, bu deneyde kullanılan daha düşük olmalıdır (600 um)
  4. Eğer hücrelerden mRNA örnekleri toplamak istiyorsanız santrifüj sonra, kırık Alg-PLL zarlardan kesinlikle hücre pelet toplamak. Kalan Alg-PLL membranlar muhtemelen mRNA Saflaştırma önler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokole 2.5 anda, sınırdışı aljinat çözüm sınırdışı hemen sonra küresel bir şekil (- H Şekil 2A) oluşturur. Süspansiyon 1 L / dak daha düşük bir N2 akış oranı ile dışarı atılır ise, damlacıkların boyutunun düzgün (Şekil 2I) 'dir. N2 akışı 1 L / dak daha yüksek olan, ancak, damlacık (Şekil 2G, beyaz ok) ayırır ve damlacıkların boyutu, heterojen (Şekil 2J) olur. Bu göz önüne alındığında, bu yöntem kullanılarak, 500 um'den daha küçü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kapsülleme kültürü doğrudan süspansiyon kültürleri ile karşılaştırılabilir. Süspansiyon kültürü kapsülleme yöntemleri daha pluripotent kök hücrelerin büyük miktarlarda elde etmek için basit bir yöntemdir. Bununla birlikte, süspansiyon kültüründe hücrelerin toplanmasını kontrol etmek de zordur. Kapsülleme yönteminde, hücre-çekiş kapsüller sınırlıdır ve bu nedenle de iyi bir şekilde kontrol edilebilir. Önceki bir yayın büyük hücre kümeleri serbest süspansiyon kültüründe 7'de ortaya ise kapsüllenmiş hü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Japonya Bilim ve Teknoloji Ajansı'nın (JST) S-Innovation projesi, Tokyo Üniversitesi Yaşam İnovasyonunda Liderler Yüksek Lisans Programı (GPLLI) ve Japonya Bilimi Teşvik Derneği'nin Genç Bilim İnsanları Araştırma Bursu tarafından desteklenmiştir. Yüksek hızlı kamera kullanarak film çektiği için nac Image Technology Inc.'e teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Fare embriyosu fibroblastCell BiolabsSNL 76/7
Fare kaynaklı pluripotent kök hücreRIKEN Bio resorce centeriPS-MEF-Ng-20D-17
DMEM yüksek glikozluGIBCO11995
ES nitelikli  FBSGIBCO 16141079
Antibakteriyel AntibiyotiklerGIBCO15240
Esansiyel Olmayan Amino AsitGIBCO11140
2-merkaptoetanolGIBCO21985-023
ESGRO Lösemi İnhibitör FaktörMerck MilliporeESG1107
Tripsin / EDTAGIBCO25300
26 G/16 G iğneHoshiseido
10 ml ŞırıngaTERUMOSS-10ESZ
Sodyum  KlorürWako191-01665
HEPESSIGMAH4034
Sodyum AljinatWako194-09955
Kalsiyum KlorürWako039-00475
Poli-L-lizin (MW = 15.000 - 30.000)SIGMAP7890
EDTADOJINDO345-01865
Sylinge pompasıAS ONE
MikroskopOlympusIX71
MikroskopLeicaDM IRB
Hispeed kameranac görüntü teknolojisiMemrecam HX-3

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zweigerdt, R. Large scale production of stem cells and their derivatives. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 114, 201-235 (2009).
  2. Chen, A., Chen, X., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Critical microcarrier properties affecting the expansion of undifferentiated human embryonic stem cells. Stem cell Res. 7 (2), 97-111 (2011).
  3. Schroeder, M., et al. Differentiation and lineage selection of mouse embryonic stem cells in a stirred bench scale bioreactor with automated process control. Biotechnol. Bioeng. 92 (7), 920-933 (2005).
  4. Leung, H. W., Chen, A., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Agitation can induce differentiation of human pluripotent stem cells in microcarrier cultures. Tissue Eng. Part C. 17 (2), 165-172 (2011).
  5. Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22 (3), 275-282 (2004).
  6. Weber, L. M., He, J., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled for testing controlled ß-cell microenvironments. Acta Biomater. 2 (1), 1-8 (2006).
  7. Horiguchi, I., Chowdhury, M. M., Sakai, Y., Tabata, Y. Proliferation, morphology, and pluripotency of mouse induced pluripotent stem cells in three different types of alginate beads for mass production. Biotechnol. Prog. 30 (4), 896-904 (2014).
  8. Rahman, N., Purpura, K. A., Wylie, R. G., Zandstra, P. W., Shoichet, M. S. The use of vascular endothelial growth factor functionalized agarose to guide pluripotent stem cell aggregates toward blood progenitor cells. Biomaterials. 31 (32), 8262-8270 (2010).
  9. Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
  10. Magyer, J. P., Nemir, M., Ehler, E., Suter, N., Perriard, J., Eppenberger, H. M. Mass Production of Embryoid Bodies in Microbeads. Ann. N. Y. Acad. Sci. 944, 135-143 (2001).
  11. Xu, J., Li, S., Tan, J., Luo, G. Controllable Preparation of Monodispersed Calcium Alginate Microbeads in a Novel Microfluidic System. Chem. Eng. Technol. 31 (8), 1223-1226 (2008).
  12. Sakai, M. P., Y, Development of Bioactive Hydrogel Capsules for The 3D Expansion of Pluripotent Stem Cells in Bioreactors. Biomater. Sci. 2 (176), 176-183 (2014).
  13. Chowdhury, M. M., Katsuda, T., Montagne, K., Kimura, H., Kojima, N., Akutsu, H., Ochiya, T., Fujii, T., Sakai, Y. Enhanced effects of secreted soluble factor preserve better pluripotent state of embry- onic stem cell culture in a membrane-based compartmentalized micro-bioreactor. Biomed. Microdevices. 12 (6), 1097-1105 (2010).
  14. Chowdhury, M. M., Kimura, H., Fujii, T., Sakai, Y. Induction of alternative fate other than default neuronal fate of embryonic stem cells in a membrane-based two-chambered micro- bioreactor by cell-secreted BMP4. Biomicrofluidics. 6 (1), 14117-14117-13 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kalsiyum Aljinat Kaps llerAzot Gaz AkPoli L Lizin KaplamaEDTA UygulamasH cre Agregasyon KontrolKayma Gerilmesi AzaltmaK k H cre Ni i

İlgili makaleler