Yöntem makalesi

Taze İzole glomerulusların Podositler Tek kanallı Analizi ve Kalsiyum Görüntüleme

10.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52850

⸱

27 Haziran 2015

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin

Bu makalede

Özet

Podositlerdeki hücre içi kalsiyum seviyelerindeki değişiklikler, glomerüllerin filtrasyon fonksiyonunu kontrol etmenin en önemli yollarından biridir. Burada, yeni izole edilmiş glomerüllerin podositlerinde gerçek zamanlı kalsiyum işlemenin ve tek iyon kanalları aktivitesinin tespit edilmesini sağlayan yüksek verimli bir yaklaşımı açıklıyoruz.

Özet

Podositlerin (renal glomerüler epitel hücreleri) glomerüler geçirgenliği düzenlediği ve glomerüler yapıyı koruduğu bilinmektedir; Podosit hasarının proteinüriye ve ayak sürecinin silinmesine yol açması nedeniyle bu hücrelerin çeşitli böbrek hastalıklarının patogenezinde anahtar bir rol olduğu belirlenmiştir. Daha önce, çeşitli endojen ajanların podositlerde hücre içi Ca2 + konsantrasyonunda dramatik bir aşırı yüklenmeye neden olabileceği ve muhtemelen albüminüriye yol açabileceği ve bunun muhtemelen kalsiyum ileten iyon kanalları yoluyla meydana geldiği bildirilmişti. Bu nedenle, hem normal koşullar altında hem de çeşitli patolojik durumlarda podositlerde kalsiyum işlemeyi incelemek önemli görünmektedir. Bununla birlikte, mevcut deneysel yaklaşımlar, kültürlenmiş ve transfekte edilmiş hücrelerle biraz sınırlı kalmıştır. Bu tür çalışmalar için iyi bir temel modeli temsil etseler de, esasen glomerulusun doğal ortamından çıkarılırlar. Burada, yeni izole edilmiş bütün glomerulusun bir parçası olarak podositleri inceleme metodolojisini açıklıyoruz. Bu hazırlık, hala kılcal damarlara bağlı olan podositlerin fonksiyonel potansiyelini korur; Bu nedenle, podositler, glomerül filtrasyon aparatının ana kısımlarını koruyan ortamda kalır. Bu el yazması, 1) oransal konfokal floresan mikroskobu yardımıyla kalsiyum konsantrasyonu değişikliklerinin gerçek zamanlı tespitine ve 2) yeni izole edilmiş glomerüllerin podositlerindeki tek iyon kanalları aktivitesinin kaydedilmesine izin veren iki deneysel yaklaşımı detaylandırmaktadır. Bu metodolojiler, araştırmacıların çeşitli ajanların uygulamalarına yanıt olarak hücre içi kalsiyum işlemedeki akut değişiklikleri çözmelerine, hücreler içindeki bazal kalsiyum konsantrasyonunu ölçmelerine (örneğin, hastalık ilerlemesini değerlendirmek için) ve tek iyon kanalları düzeyinde kalsiyum iletkenliğini değerlendirmelerine ve manipüle etmelerine olanak tanıyan glomerulusun doğal ortamının avantajlarını kullanır.

Giriş

Böbrekler, çeşitli maddeler için homeostatik dengeyi korumak ve toplam kan basıncını belirleyen bir şekilde kan hacmini düzenler. Hiper veya hipotansiyon arasında değişen renal filtrasyon, geri emiliminin veya salgı kurşun bozukluklar veya eşlik patolojik durumlar, sonunda böbrek nakli gerektiren son dönem böbrek hastalığı için. kapiller endotel, bazal membran ve epitel hücreleri tek-hücre tabakası - - yarık diyafram bütünlüğü ve işlevi 1 korunmasında önemli bir rol oynamaktadır Podositler renal filtreleme birimi (glomerulus) üç tabakadan oluşur. Permselektif glomerüler filtre Disfonksiyon gibi proteinüri olarak makromoleküllerin, idrar kaybına neden olur. Çeşitli ajanlar glomerüller filtrasyon bariyerinin bütünlüğünü belirleyen Podositler ve ayak süreçleri, yapısını etkileyebilir.

Podositler glom bakım katılaneruli filtrasyon işlevi. Bu Podosit tarafından uygunsuz kalsiyum taşıma hücre hasarı yol açar ve nefropatilerin 2,3 çeşitli biçimlerde ilerlemesinde önemli bir rol oynadığı tespit edilmiştir. Bu nedenle, podosit fonksiyonunun çalışmalar için etkili olacaktır hücre içi kalsiyum konsantrasyonu değişiklikleri, doğrudan ölçümü için izin veren bir modelinin geliştirilmesi. İzole glomerüller önce albümin yansıma katsayısı ölçümü 4 ve bütün hücre elektrofizyolojik patch-kelepçe ölçümlerde 5,6 integral hücresel akımların değerlendirmesini değiştirir dahil çok sayıda çalışmalarda kullanılmıştır. Mevcut yazıda, farmakolojik ajanların uygulamalarına tepki olarak hücre içi kalsiyum konsantrasyonu değişiklikleri ölçmek hücrelerin içinde kalsiyum bazal düzeylerini tahmin ve bireysel kalsiyum kanalları aktivitesini değerlendirmek için araştırmacı izin veren protokol açıklar. Ratometric kalsiyum konsantrasyonu ölçümleri ve patch-kelepçe electrophysiology sırasıyla podosit ve kanal aktivitesi olan hücre içi kalsiyum konsantrasyonu değişiklikleri belirlemek için kullanıldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvan kullanımı ve refah Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından incelenen ve onaylanan protokoller aşağıdaki Laboratuvar Hayvanları Bakımı ve Kullanımı NIH Kılavuzu'na uygun olmalıdır.

1. Böbrek Gömme

  1. (Ancak farklı yaş ve cinsiyet diğer suşları uygun değişikliklerle kullanılabilir, bir Sprague Dawley suşu olan önerilen) 8 ila 12 haftalık erkek sıçan kullanın.
  2. IACUC protokolü tarafından izin verilen prosedüre göre hayvan anestezisi; anestezi derinliği izlemek ve hayvan kontrol edin. cerrahi ayrıntılı bir açıklama 1.3 gerçekleştirilebilir göre - 1.8 Ilatovskaya ark bulunabilir 7.
  3. Uygun anestezi sonrasında, sıcaklık kontrollü cerrahi masaya hayvan koyun (yukarı uzunluğu 3 inç) karın orta hat kesi yapmak ve vena kava ve aorta ortaya çıkarmak.
  4. Çölyak ve superior mezenterik arterler ve abdominal etrafında bitişik harfleri yerleştirinyukarıda aort; Arter yok.
  5. Renal arterlerin altında abdominal aorta incelemek ve çevresinde iki bitişik harfler koyun, ancak lige yok künt, daha sonra bitişik harfler üzerinde aorta kelepçe ve alt iplik kravat.
  6. Kelepçe altında (PBS ile dolu bir şırınga pompası takılı) bir polietilen PE50 boru ile aort kateter ve ikinci dikilen ile kateter düzeltmek; , kelepçe kaldırmak pompa açın ve aorta bağlanır ve çölyak arterler ile mezenterik. Hızla baskıyı hafifletmek için renal ven kesi yapmak.
  7. / Dakika 6 ml 'lik bir oranda, 2 veya 3 dakika için önceden soğutulmuş PBS ile aort infüze.
  8. Perfüzyon, rüsumat durdurun ve 7 böbrekler açarlar ve PBS çözüm buz üzerine koydu. IACUC tarafından onaylanmış protokole göre hayvan Euthanize.

Sıçan glomerulusların 2. izolasyonu

  1. RPMI 1640 içinde% 5 BSA, taze çözelti 30 ml hazırlayın.
  2. Bir jilet ve makas kullanarak,Her iki böbreğin korteks izole ve ardından homojen hale gelinceye kadar kıyma. Bu prosedür, önceki 7 tarif edilmiştir.
  3. 100 gözlü paslanmaz çelik elek içinden geçen aşaması esnasında kıyılmış doku itin bir spatula kullanılarak (BSA / RPMI çözeltisi% 5 önceden ıslatılmış). Akış ve yer çekimi kuvveti ile akış ile 140 ağ elek boyunca geçmesine izin toplayın.
  4. Bir ön-ıslatılmış 200 gözenekli elek kullanılarak bir elek 140 ağ toplanan akış geçirgen filtre süzüntü atmak ve 10, elek üst yıkama - ilgili tortu glomerül toplamak için hazırlanmış BSA / RPMI çözeltisi 15 ml Elek.
  5. Kadar 20 dakika boyunca tüpün altındaki glomerüller tortu 15 ml tüp buz üzerinde glomerül BSA / RPMI çözeltisi koyun ve bildirin. Tüpün alt glomerüller konsantre açıkça görülecektir. Tüp içinde yaklaşık olarak 2 ml bırakarak, fazla çözelti çıkarın.

3. Tek kanallı Patch-kelepçe Electrophysiology

  1. MW 70.000 ile kaplanarak 5 x 5 mm kapak cam cips hazırlayın - 150.000 poli-ʟ-lizin ve kurumaya bırakın. Kapak cam başına su içinde% 0.01 steril filtre edilmiş çözeltisi, yaklaşık 30 ul kullanın.
  2. RT deneysel çözümler Isınma ve patch-kelepçe odasını ve pipet doldurun. TrpC kanalları izleme, mM banyo solüsyonu kullanın: 126 NaCl, 1 CaCl2, 10 HEPES, 2 MgCl2, 10 glukoz, pH 7.4; Pipet: 126 NaCl, 1.5 CaCl2, 10 HEPES, 10 glukoz; pH 7.4.
    1. Tavsiye çalışmalarda (ilgili olmayan endojen kanal aktivitesini engellemek için pipet solüsyonuna inhibitörleri ekleme vardır: 100 uM niflumik asit ya da DIDS (Ca2 + ile aktive edilen Cı engellemek için - kanalları), 10 mM TEA (inhibe yüksek ölçüde iletkenliğe sahip Ca2 + - bağımlı K + kanalı), 10 nM iberiyotoksin (,) 10 uM nikardipin Ca2 + ile aktive edilen K + kanallarını bloke etmek (N-tipi Ca engellemek2+ doğrudan patch-kelepçe deneyden önce kanalları)).
  3. Yavaşça glomerüller içeren çözüm karıştırmak ve sonra poli-ʟ-lizin kaplı kapak cam cips bunun yaklaşık 50 ul uygulayın. Glomerül yaklaşık 5 dakika süreyle tutunma olsun.
  4. Patch-kelepçe odasına banyo solüsyonu ile önceden doldurulmuş için glomerül cam cips taşı; serbest glomerül kaldırılmasını sağlamak için 1 dakika için / dakika 3 ml bir oranda bölme serpmek.
  5. Bir hücre ekli modunda 7 geleneksel bir yama-kelepçe deney. Bir cam pipet ile, (7-10 M? Pipet direnci), bir pipet ve hafif bir emme (izole glomerulus yüzeyi üzerinde bir podosit bağlanmış bir pipet uygulayarak podosit membran arasında yüksek dirençli bir yalıtım oluşturmak ilgili, Şekil 2'de gösterildiği gibi olduğu sol).
  6. Hücre bağlı ölçümler için, sekiz kutuplu Bessel filtresi ile 300 Hz akımları düşük geçmektedir.
  7. U6 saat - se kadar 4 için patch-kelepçe deneylerinde glomerüller izole. Buz üzerinde stok glomerüller fraksiyonu tutun.

Podositler hücre içi kalsiyum konsantrasyonu 4. oranlı metrik Konfokal floresans ölçümleri

  1. Konik tüp, 0.5 ml (2.5 açıklanan) glomerüller fraksiyonu 500 ul yerleştirin ve kalsiyum boyalar Fura Kırmızı, AM ve Fluo-4, AM ekleyin. 2 mm ve (DMSO içinde çözülmüş -20 ° C'de saklayın) Fura Kırmızı, AM ve Flu-4, GM, sırasıyla 1 mM stok konsantrasyonları kullanımı ve glomerüller fraksiyonunun 500 ul her bir boya 2.5 ul kullanın. Hemen boyaların ilave edilmesinden sonra, alüminyum folyo ile tüp kapsamaktadır.
  2. Oda sıcaklığında 1 saat için en az 20 dakika kadar bir döner çalkalayıcı üzerinde yer borular.
    Not: Farmakolojik maddeler, bu aşama sırasında eklenebilir.
  3. Cam lamelleri hazırlanması poli-ʟ-lisin ile kapak ve 70 ° C'ye kadar ısıtıldı levha seti kullanarak kurutma sağlar.
  4. Kalsiyum boyalar yükleme komplet sonraE, poli-ʟ-lizin kaplı kapak çözeltiyi içeren glomerül 100 ul uygulamak ve bununla ilgili olarak, 5 dakika için yüzeye dönelim. Bir görüntüleme odasına glomerüller bağlı lamelleri monte edin ve banyo çözeltisi (() mM olarak ihtiva eden: MgCl2 145 NaCl, 4.5 KCl, 2, 10 HEPES, pH 7.35) ile serpmek 3 ml / dk hızda kaldırmak için bekâr glomerüller ve kalan boyalar.
  5. Bir 488 nm eksitasyon dalga boyu ve radyasyon filtreleri (sırasıyla Fluo-4 ve Fura Red için 525/25 ve 650/25 nm) konfokal lazer tarama mikroskobu ayarlayın. İstediğiniz bir frekans ve çözünürlük görüntüleme yazılımı ayarlayın.
  6. Aydınlık içinde glomerüller bulun ve sonra floresan sinyalinin tespiti açın. Sinyalin doygunluk önlemek için her boya için lazer yoğunluğunu ayarlar. Doğrudan cama bağlı Podositler ile odak düzlemi seçin. Bu ilaca yanıt olarak bir glomerulus büzülmesiyle kaynaklanan etkiyi en aza indirirUygulama. Seçim glomerulus iyi cama takılı olduğundan çift çek;
  7. Seçim odak düzlemi görüntüleme başlayın, (yüksek çözünürlüklü görüntü için 60X / NA 1.4 veya benzer objektif lens kullanın. Hızlı Ca 2+ geçici değişiklikleri görmenizi 4 sn set frekans ile 512 x 512 görüntü almak) ilgi ilaçları uygulamak ve yanıtı kaydedin.
    1. (Glomerül yüzeyinde Podositler görüntülenmesini sağlamak için, mümkün olduğu kadar camın yüzeyine yakın olarak) arzu edilen bir odak düzlemi seçin. Fluo4 ve FuraRed kanallarda floresan yoğunluğunu kontrol edin ve glomerulus açıkça aydınlık görülür olduğundan emin olun.
    2. Görüntüleme başlatın. Herhangi bir ilaç uygulamasından önce, bazal floresans rekor en az 1 dakika sinyali (hiçbir ani sivri veya sinyal solma) kararlı olduğundan emin olmak için.
    3. Bir mikropipet yardımıyla istenilen ilaçları uygulayın; dikkatli olmak ve ilaç iyi diffüz başardı sağlamak ve glomer ulaşmakulus. Gerekirse, seçilen odak düzlemi izlemek ve çünkü ilaç uygulamasının odak dışına taşımak olmadığını kontrol ediniz hafifçe banyo çözüm karıştırın.
    4. Fluo4 ve FuraRed sinyalleri için flüoresan yoğunluğundaki değişimlerle kaydedin. Kayıt sinyal plato seviyesine ulaştığında veya bir zirveye ulaşır ve daha sonra bazal dönene kadar bekleyerek, yeterince uzun olduğundan emin olun. Gerekirse Çözelti değişiklik ya da başka herhangi bir ilaç ilave gerçekleştirin.
    5. Kaydı durdurmak ve yazılım özgün biçiminde dosyayı kaydedin.

Kalsiyum Ölçümleri 5. Görüntü Analizi

  1. Yerli ND2 formatındaki görüntüleri içe izin veren ND Programı eklentisi ile donatılmış ImageJ açık yazılım ile görüntü analizi yapın.
  2. Görüntü dizisi İthalat; Kanal bölmek ve bir hyperstack gri tonlama modu kullandığınızdan emin olun.
  3. O kadar ImageJ yazılımı analiz → Araçlar → ROI yöneticisi yolunu izleyinkalem ROI yöneticisi penceresi. Oval seçim aracını ve ROI Yöneticisi "Add (t)" fonksiyonunu kullanarak faiz (Podositler) birkaç bölgeleri seçin. Son ROI olarak arka planda alanı seçin; (→ Kaydet fazla) seçilen ROI kaydedin.
  4. Analizler için seçilen kanalı içeren pencereyi vurgulayın. , YG Yöneticisi Çoklu Ölçüm işlevi → Daha kullanın dışarı çıkar diyalog içinde "tek satır dilim başına" kutusunu işaretleyin ve sonra Tamam 'ı tıklatın. seçeneğini ayarlayın Ölçümleri → menü seçeneği Sonuçlar girmek "gri Ortalama değer" ve görüntülenir her ROI için piksel yoğunluğu değerlerini hesaplamak: Sonuçlar Sonuçları penceresinde ayarlanabilir formatında gösterilir Her ROI için ayrı sütunlarda Sonuçları penceresi.
  5. Tercih veri analiz yazılımı içine her bir kanal (Fluo-4 ve Fura Kırmızı) için ölçülen ROI yoğunluk değerlerini kopyalayın; Her bir DAT dan çıkarma arka plan yoğunluğu değerleribir nokta.
  6. Her bir zaman noktası için, Fura kırmızı kanallara Flu-4 yoğunluklarının oranı hesaplanır. Plot dağılım / her ROI için Ca 2+ geçici hat noktası zamanı değişir. Seçilen glomeruli için ortalama / SE değerlerini hesaplamak.
    Not: Zaman sütunu 4,5 seçilen görüntüleme frekansına göre ayarlanması gerekir.

Flu-4 Floresan Sinyal kullanma 6. Hücre içi kalsiyum Konsantrasyon Hesaplamaları

  1. Glomerulusların bir örneğini alın ve 4.7 adıma deneysel protokol yukarı gerçekleştirin. Eşiğe kaydından sonra banyo çözeltisine ve kayıt floresan yoğunluğu artışı (10 uM olmalıdır banyo odasında nihai konsantrasyon) İyonomisin ekleyin. Yoğunluk maksimuma ulaşır ve çürüme başladığında, MnCI2 eklemek floresan 8 gidermek için (nihai konsantrasyon 5 mM olmalıdır).
  2. 6.1 elde edilen verileri analiz edin. Elde edilen Flu-4 sinyal ROI yoğunluğu değerleri doğrultusunda kopyalamaTercih analiz yazılımı ile 5,1-5,5 açıklanan protokole.
  3. Bir formül kullanılarak ROI karşılık gelen Podosit olarak (nM) hücre içi kalsiyum konsantrasyonunu hesaplayın:
    figure-protocol-1
    Kd Fluo-4 (345 nM) sabit, önceden belirlenmiş bir ayrılma olduğu, F (taban) için kalsiyum konsantrasyonunun hesaplanması olan zaman noktasında yoğunluğudur ve F dakika ve Fmax de yoğunluk değerleri (iyonomisin uygulama sonrası) ve (MnCI2) ile flöresan soğutmadan sonra, maksimum kalsiyum yük noktası, sırasıyla, (Şekil 3'e bakınız).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burada Podositler kalsiyum seviyeleri akut değişiklikler ölçülerek değerlendirilmesi amaçlanmıştır. 1, taze bir Podositler yüksek çözünürlüklü canlı floresan konfokal görüntüleme ve tek iyon kanalı aktivitesi kayıtları gerçekleştirmek için tasarlanan deney protokolünün şematik bir temsilini göstermektedir, Şekil İzole kemirgen glomerüller. Sıçan anestezi sonra Kısaca, böbrekler kan bunları temizlemek için PBS ile yıkanmalıdır. Ardından, böbrekler kesilmiş ve decapsulated ve glomerül dif...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada tarif edilen bir yaklaşım, kemirgen glomerül Podositler kalsiyum işleme analizi sağlar. Bu teknik, patch-kelepçe tek kanallı elektrofizyoloji ve floresan rasyometrik konfokal görüntüleme uygulama sağlar. Bununla birlikte, her iki yaklaşım da kendi ayrı ayrı kullanılabilir. Önerilen protokol 1) böbrek temizleme dahil olmak üzere birçok nispeten basit adımları vardır; 2) diferansiyel eleme ile glomerül izolasyonu; 3) patch-kelepçe elektrofizyolojik deneyler veya hücre içi kalsiyum değişiklikler rasyometrik konfokal...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Yazarlar mikroskobu deneyleri ile mükemmel teknik yardım için Glen Slocum (Wisconsin Tıp Koleji) ve Colleen A. Lavin (Nikon Instruments, Inc.) teşekkür etmek istiyorum. Gregory Blass yazının kritik redaksiyon için kabul edilmektedir. Bu araştırma (AS) 1-15-BS-172, ve (DVI) Nefroloji American Society Ben J. Lipps Araştırma Bursu hibe Sağlık hibe HL108880 ve American Diabetes Association Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Fluo4 AMLife TechnologiesF14217DMSO içinde 500 µl
FuraRed AMLife TechnologiesF-3020
Poly-ʟ-lisinSigma-AldrichP4707
Pluronik asitSigma-AldrichF-68solüsyon
IonomycinSigma-AldrichI3909-1ML
Tüp rotatörüMiltenyi Biotec GmbH130-090-753Almanya
Nikon konfokal mikroskop (ters çevrilmiş)NikonNikon A1RLazer uyarımı 488 nm. Emisyon filtreleri 500-550 nm ve 570-620 nm
ObjektifNikonPlan Apo 60x/NA 1.4 Oil
LameliThermo Scientific6661B52
Yüksek vakum gresiDow CorningSilikon Bileşik
YazılımNikonNikon NIS-Elements
Kayıt/perfüzyon odasıWarner InstrumentsRC-26
Patch clamp amplifikatörüMolecular DevicesMultiClamp 700B
Veri toplama sistemiMolecular DevicesDigidata 1440AAxon Digidata® Sistemi
Alçak geçiren filtreWarner InstrumentsLPF-88 kutuplu Bessel
Borosilikat cam kılcal tüplerWorld Precision Instruments1B150F-4
Mikropipet çekiciSutter Instrument CoP-97Alevli/Brown tipi mikropipet çekici
MikroforjNarishigeMF-830Japonya
Motorlu mikromanipülatörSutter Instrument CoMP-225
Ters mikroskopNikonEclipse Ti
Mikrotitreşim izolasyon masasıTMCFaraday kafesi ile donatılmış
Çok kanallı valf perfüzyon sistemiAutoMake ScientificValve Bank II
Kayıt/perfüzyon odasıWarner InstrumentsRC-26
YazılımMolecular DevicespClamp 10.2
NikardipinSigma-AldrichN7510
IberiyotoksinSigmaI5904-5UG
Niflumik asitSigma-AldrichN0630
DIDSSigma-AldrichD3514-25MG
TEA klorürTocrisT2265
RPMI 1640Life Technologies11835030antibiyotiksiz
BSASigma-AldrichA8327%30 albümin solüsyonu
Sıcaklık kontrollü cerrahi masaMCW corekemirgenler için
Çelik elekler:#100 (150 μm), 140 (106 μm)
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200Fisher Sci50-871-316
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270Fisher Sci50-871-318
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400Fisher Sci50-871-320
mesh 200Sigma-Aldrichs4145CD-1 için elek
Binoküler mikroskopNikonEclipse TS100
Binoküler mikroskopNikonSMZ745
Şırınga pompası tabanlı perfüzyon sistemiHarvard Apparatus
Polietilen tüpSigma-AldrichPE50
İzofluran anestezisifigure-materials-1 VetEquip, Inc.911103
Diğer temel reaktiflerSigma-Aldrich

Kaynaklar

  1. Machuca, E., Benoit, G., Antignac, C. Genetics of nephrotic syndrome: connecting molecular genetics to podocyte physiology. Hum. Mol. Genet. 18, R185-R194 (2009).
  2. Haraldsson, B., Nystrom, J., Deen, W. M. Properties of the glomerular barrier and mechanisms of proteinuria. Physiol. Rev. 88, 451-487 (2008).
  3. Patrakka, J., Tryggvason, K. New insights into the role of podocytes in proteinuria. Nat. Rev. Nephrol. 5, 463-468 (2009).
  4. Savin, V. J., Sharma, R., Lovell, H. B., Welling, D. J. Measurement of albumin reflection coefficient with isolated rat glomeruli. J. Am. Soc. Nephrol. 3, 1260-1269 (1992).
  5. Gloy, J., et al. Angiotensin II depolarizes podocytes in the intact glomerulus of the Rat. J. Clin. Invest. 99, 2772-2781 (1997).
  6. Nitschke, R., et al. Angiotensin II increases the intracellular calcium activity in podocytes of the intact glomerulus. Kidney Int. 57, 41-49 (2000).
  7. Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).
  8. Snitsarev, V. A., McNulty, T. J., Taylor, C. W. Endogenous heavy metal ions perturb fura-2 measurements of basal and hormone-evoked Ca2+ signals. Biophys. J. 71, 1048-1056 (1996).
  9. Fukuda, A., Fujimoto, S., Iwatsubo, S., Kawachi, H., Kitamura, K. Effects of mineralocorticoid and angiotensin II receptor blockers on proteinuria and glomerular podocyte protein expression in a model of minimal change nephrotic syndrome. Nephrology (Carlton). 15, 321-326 (2010).
  10. Abramowitz, J., Birnbaumer, L. Physiology and pathophysiology of canonical transient receptor potential channels). FASEB J. 23, 297-328 (2009).
  11. Heeringa, S. F., et al. A novel TRPC6 mutation that causes childhood FSGS. PLoS ONE. 4, e7771(2009).
  12. Zhang, X., Song, Z., Guo, Y., Zhou, M. The novel role of TRPC6 in vitamin D ameliorating podocyte injury in STZ-induced diabetic rats. Mol. Cell. Biochem. 399, 155-165 (2015).
  13. Bohrer, M. P., et al. Mechanisms of the puromycin-induced defects in the transglomerular passage of water and macromolecules. J. Clin. Invest. 60, 152-161 (1977).
  14. Olson, J. L., Rennke, H. G., Venkatachalam, M. A. Alterations in the charge and size selectivity barrier of the glomerular filter in aminonucleoside nephrosis in rats. Lab. Invest. 44, 271-279 (1981).
  15. Schiessl, I. M., Castrop, H. Angiotensin II AT2 receptor activation attenuates AT1 receptor-induced increases in the glomerular filtration of albumin: a multiphoton microscopy study. Am J Physiol Renal Physiol. 305, F1189-F1200 (2013).
  16. Ilatovskaya, D. V., Levchenko, V., Ryan, R. P., Cowley, A. W., Staruschenko, A. NSAIDs acutely inhibit TRPC channels in freshly isolated rat glomeruli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 408, 242-247 (2011).
  17. Peti-Peterdi, J. Calcium wave of tubuloglomerular feedback. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, F473-F480 (2006).
  18. Peti-Peterdi, J., Warnock, D. G., Bell, P. D. Angiotensin II directly stimulates ENaC activity in the cortical collecting duct via AT(1) receptors. J. Am. Soc. Nephrol. 13, 1131-1135 (2002).
  19. Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305, C1050-C1059 (2013).
  20. Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidney Int. 305, C1050-C1059 (2014).
  21. Schaldecker, T., et al. Inhibition of the TRPC5 ion channel protects the kidney filter. J. Clin. Invest. 123, 5298-5309 (2013).
  22. Roshanravan, H., Dryer, S. E. ATP acting through P2Y receptors causes activation of podocyte TRPC6 channels: role of podocin and reactive oxygen species. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 306, F1088-F1097 (2014).
  23. Anderson, M., Roshanravan, H., Khine, J., Dryer, S. E. Angiotensin II activation of TRPC6 channels in rat podocytes requires generation of reactive oxygen species. J. Cell. Physiol. 229, 434-442 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Podosit Kalsiyum G r nt lemeGlomeruli zolasyonuKonfokal MikroskopiYama Kenet ElektrofizyolojisiFloresan Boya Y klemeKalsiyum Konsantrasyonu l myon Kanal AktivitesiRenal Epitel H creleri

İlgili makaleler