Bu ko-immünopresipitasyon protokolü, influenza A virüsü nükleoproteini ile insan hücrelerindeki antiviral Mx1 proteini arasındaki etkileşimi incelemeye izin verir. Protokol, Mx1 ve influenza A virüsü nükleoproteininin başarılı bir şekilde birlikte immünopresipitasyonu için N-etilmaleimidin önemini vurgulamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnfluenza A virüsü nükleoproteini Fare MX1 Protein Co-immunopresipitasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Proteinler arasındaki etkileşimi incelemek, işlevlerini anlamada anahtardır. Karmaşık bir numunedeki proteinlerin diğer makromoleküllerle etkileşimlerini incelemek için sıklıkla kullanılan çok güçlü bir yönteme ko-immünopresipitasyon denir. Tarif edilen ko-immünopresipitasyon protokolü, antiviral miksovirüs direnç proteini 1 (Mx1) ile viral hedeflerinden biri olan influenza A virüsü nükleoproteini (NP) arasındaki etkileşimin gösterilmesine ve daha fazla araştırılmasına izin verir. Protokol, transfekte edilmiş memeli hücreleri ile başlar, ancak influenza A virüsü ile enfekte olmuş hücreleri başlangıç materyali olarak kullanmak da mümkündür. Hücre lizizinden sonra, viral NP proteini spesifik bir antikor ile aşağı çekilir ve elde edilen bağışıklık kompleksleri protein G boncukları ile çökeltilir. NP'nin başarılı bir şekilde aşağı çekilmesi ve antiviral Mx1 proteininin ko-immünopresipitasyonu daha sonra western blotlama ile ortaya çıkar. Mx1'in NP ile başarılı bir şekilde birlikte immünopresipitasyonu için bir ön koşul, hücre lizis tamponunda N-etilmaleimid (NEM) varlığıdır. NEM alkilatlar serbest tiyol grupları. Muhtemelen bu reaksiyon, Mx1'in spesifik bir konformasyonunu, viral hedefini veya bilinmeyen bir üçüncü bileşeni koruyarak zayıf ve/veya geçici NP-Mx1 etkileşimini stabilize eder. Ko-immünopresipitasyon deneylerinin önemli bir sınırlaması, proteinlerin protein G boncuklarına veya antikorlarına spesifik olmayan bağlanmasından kaynaklanan kontamine proteinlerin yanlışlıkla aşağı çekilmesidir. Bu nedenle, yanlış pozitif sonuçları hariç tutmak için kontrol ayarlarını dahil etmek çok önemlidir. Tarif edilen ko-immünopresipitasyon protokolü, farklı omurgalı türlerinden Mx proteinlerinin viral proteinler, herhangi bir protein çifti veya bir proteinin diğer makromoleküller ile etkileşimini incelemek için kullanılabilir. NEM'in zayıf ve/veya geçici etkileşimleri stabilize etmedeki faydalı rolü, her etkileşim çifti için ayrı ayrı test edilmelidir.
Giriş
Myxovirus direnci (Mx) proteinler, viral patojenlere karşı doğal bağışıklık savunma önemli bir parçasıdır. Bu proteinler tip I ve tip III interferonlar tarafından indüklenen büyük Dynamin benzeri GTPazlar bulunmaktadır. karşılık gelen Mx genleri, bir ya da birden çok kopya halinde hemen hemen tüm omurgalıların içinde bulunmaktadır ve bunların gen ürünleri Ortomiksoviridae (örn., influenza virüsü), Rhabdoviridae (örn., veziküler stomatit virüsü), Bunyaviridae (örneğin, de dahil olmak üzere, virüslerin bir geniş inhibe eder. la crosse virüsü) ve (örneğin, insan bağışıklık eksikliği virüsü-1), 1-4 Retroviridae. Bu ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Not: Aşağıdaki transfeksiyon ve ko-immünopresipitasyon protokolü 9 cm Petri kabı biçimi için kurulur. Diğer formatlar protokolü ölçekleme sonra da mümkündür.
1. Tohum insan embriyonik böbrek (HEK) 293T hücreleri
- % 10 fetal dana serumu, 2 mM L-glutamin, 0.4 mM Na-piruvat ile takviye edilmiş Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde 12 ml 9 cm'lik petri tabağı başına 1.2 x 10 6 hücre transfeksiyondan önce HEK293T hücreleri bir gün Seed, 0.1 mM temel olmayan amino asit, 100 U / ml penisilin ve 0.1 mg / ml streptomisin.
- Hücreler, 37 ° C'de 16 saat ve% 5 CO2 büyütün.
- Görme tr....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
N-etilmaleimit sistein proteazlarını geri dönülmez (Şekil 1) önlenmesi için, örneğin, serbest tiyol gruplarını düzenlemek için kullanılabilecek bir organik bileşiktir.
Antiviral MX1 proteini influenza virüs nükleoprotein ile etkileşerek bir virüs çoğalmasını engeller. Burada anlatılan optimize ko-immünopresipitasyon protokolü bu NP-MX1 etkileşim çalışma sağlar. HEK293T hücreleri grip NP proteininin varlığı veya yokluğu antiviral MX1 bir protein için ifade vektörleri.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Antiviral proteinler ve bunların viral hedeflere arasındaki etkileşimi incelemek bu proteinlerin antiviral mekanizmasının ayrıntılarını anlaşılması çok önemlidir. Bu yeni antiviral stratejilerin geliştirilmesi için temel virüsler ve onların ana-evrimleşmiş eş nasıl yeni anlayışlar vermek ve olabilir. Burada anlatılan optimize ko-immünopresipitasyon protokol fare MX1 protein ve viral hedef, grip NP proteini arasındaki etkileşimi incelemek için izin verir. NP-MX1 etkileşimi NEM (Şekil 3) yokluğunda saptan.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.
Teşekkürler
Bu çalışma FWO-Vlaanderen, IOF projesi IOF10 / StarTT / 027 ve Gent Üniversitesi Özel Araştırma Hibe BOF12 / GOA / 014 tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| DMEM yüksek glikoz | Gibco | 52100-047 | |
| N-Etilmaleimid | Sigma | E-3876 | Toksik |
| Igepal CA-630 | Sigma | I-30212 | NP40 |
| Proteaz inhibitörü kokteyli | Roche | 11 873 580 001 | |
| anti-NP monoklonal antikoru | NIH Biyosavunma ve Ortaya Çıkan Enfeksiyonlar Araştırma Kaynakları Deposu | NR-4282 | asit klonlarının karışımı A1 ve A3 |
| anti-RNP poliklonal serum | NIH Biyosavunma ve Ortaya Çıkan Enfeksiyonlar Araştırma Kaynakları Deposu | NR-3133 | A/İskoçya/840/74 (H3N2) |
| Protein G Sefaroz 4FF | GE Sağlık | 17-0618-01 | |
| Hiperfilm ECL 18 x 24 cm | GE Sağlık | 28-9068-36 | |
| ECL batı lekeleme substratı | Pierce | 32106 |
Kaynaklar
- Verhelst, J., Hulpiau, P., Saelens, X. Mx proteins: antiviral gatekeepers that restrain the uninvited. Microbiol Mol Biol Rev. 77 (4), 551-566 (2013).
- Goujon, C., et al. Human MX2 is an interferon-induced post-entry inhibitor of HIV-1 infection. Nature.....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
