Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fare Modelinde Kuruluş ve İYE ve CAUTI Karakterizasyonu

20.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/52892

⸱

23 Haziran 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Center for Women's Infectious Disease Research, Washington University School of Medicine

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

Üriner sistem enfeksiyonlarını (İYE) modelleme yeteneği, bakteriyel patogenezi anlayabilmek ve yeni terapötiklerin geliştirilmesini sağlayabilmek için çok önemlidir. Bu çalışmanın amacı, insanlarda görülen bulguları özetleyen ve tahmin eden deneysel İYE ve kateterle ilişkili İYE'nin fare modellerini göstermektir.

Özet

İdrar yolu enfeksiyonları (İYE) son derece yaygın bir morbidite nedenidir ve antibiyotik tedavisine giderek dirençlidir. Dişiler orantısız İYE tarafından tutulmuş olan: Bütün kadınların% 50'si yaşamları boyunca bir İYE olacak. Ayrıca, ilk İYE yaşam, ağrı ve rahatsızlık, günlük faaliyetlerin bozulması kalitesinde ciddi bozulma bazı acı sık nüks ile nüks yaşayacaktır var bu kadınların% 20-40, sağlık maliyetleri artmıştır ve birkaç tedavi seçenekleri diğer uzun süreli antibiyotik profilaksisi daha. Üropatojenik Escherichia coli (UPEC) İYE edinilen toplumun temel etkenidir. Kateter ilişkili ÜSE (CAUTI) bir milyon yılda ABD'de olaylar ve dramatik sağlık masrafları için muhasebe en yaygın hastane kökenli bir enfeksiyondur. UPEC ayrıca CAUTI birincil nedeni iken, diğer etkenler de dahil olmak üzere Enterococcus artan öneme sahiptirfaecalis'in. İşte bu insan hastalıklarının klinik özellikleri birçok recapitulate iki köklü fare modellerini kullanmaktadır. İYE için, C3H / HeN modeli konak yanıtları, IBC oluşumu ve ipliklenmenin dahil insanlarda gözlenen UPEC virulans özellikleri birçok özetlediği. CAUTI, kateter, mesane implantlar korumak C57BL / 6 fareleri kullanan bir model için, E. duyarlı olduğu gösterilmiştir faecalis'in mesane enfeksiyonu. Bu temsili modeller yeni terapötik ve yönetim veya önleme stratejilerinin geliştirilmesine öncülük etmektedir İYE hastalığın patogenezinde içine çarpıcı yeni anlayışlar kazanmak için kullanılmaktadır.

Giriş

İdrar yolu enfeksiyonları (İYE) en sık görülen bakteriyel enfeksiyon hastalıklarından biridir ve İYE edinilen kazanım, toplum ve hastane kaynaklı mekanizmasına dayanan iki kategoriye ayrılabilir. Toplum kökenli İYE sık sık aksi takdirde sağlıklı kadın ve çalışmalarda meydana kadınların yaklaşık% 50'si yaşamları 1 en az bir İYE olacaktır göstermiştir. Ayrıca, nüks önemli bir sorundur. Bir başlangıç ​​akut enfeksiyon olan bir kadın antibiyotik tedavisi ve birçok kadın sık nüks 2 yaşamaya devam uygun olmasına rağmen altı ay içinde ikinci bir enfeksiyonu olan bir% 25-40 şansı var. Bu enfeksiyona neden olan bakteriler de giderek daha fazla antibiyotiğe dirençli karıştırıcı tedavi protokolleri 3-6 hale gelmektedir. İYE hastalığın etkilerini ve yaygınlığını vurgulayan ABD'de sağlık ile ilgili giderler yaklaşık 2,5 milyar dolara mal bireylerin milyonlara her yıl etkiler1,7 .Nosocomial esas olarak kalıcı kateter gibi yabancı cisimlerin varlığı ile ilişkilidir İYE satın almıştır. Kateter ilişkili İYE (CAUTI) bu tür enfeksiyonların 8% 70-80 ~ muhasebe, İYE edinilen en sık görülen hastane kalır. Ayrıca, CAUTI artmış morbidite ve mortalite ile ilişkili ve ikincil kan dolaşımı enfeksiyonlarının 9 en sık nedenidir olduğunu.

İYE edinilen UPEC ilişkili topluluk cinsel ilişki, kötü hijyen veya farklı konak arasındaki diğer mikrobik nüfus dinamikleri sırasında mekanik manipülasyonu yoluyla gastrointestinal sistemde rezervlerden mesane içine bakterilerin giriş kaynaklandığı 10'a nişler düşünülmektedir. Bir kez mesane içinde UPEC kapsül, demir toplama sistemleri, toksinler, bir virülans plazmid, tRNAs, patojenite adaları ve patogenezde rol oynadığı gösterilmiştir kolonizasyon faktörleri de dahil olmak üzere çok sayıda virülans faktörleri, istihdam 11-14. UPEC kolonizasyon kurulması için kritik, UPEC da stereokimyasal özgüllük 15 reseptörlerini tanıyan yapışkan hastabakıcı usher yolu (CUP) pili çok tip kodlar. FimH adezin uçlu tip 1 pili, UPEC ile ifade edilmektedir ve her ikisi de, insan ve fare keseli 18 lümen yüzeyi üzerinde ifade edilir uroplakins 16 ve α-1, β-3 integrinleri, 17 manosile bağlar. Bu FimH aracılı etkileşimler bakteri kolonizasyonu ve yüzeyel epitel hücrelerinin 19,20 işgali kolaylaştırmak. Tek bir bakteri hızla olgunlaşması üzerine, ~ 10 4 bakteri 21 içerebilir bir hücre içi bakteri topluluğu (IBC) oluşturmak için bölebilirsiniz nereye kez hücre içinde, UPEC sitoplazmaya kaçabilir. IBC formasyonu en az altı farklı fare soylarında gösterilmiştir, C3H / Hen, C3H / HeJ, C57BL / 6, FMA, FVB / NJ ve BALB / c ve farklı UPE bir çok çeşitliC suşları ve diğer Enterobacteriaceae 22-24. Ancak IBC formasyonunun zamansal ve uzamsal farklılıklar fare arka plan ve enfekte UPEC gerginlik bağlı olarak değişebilir. C3H Giriş / prototip UPEC ile enfekte HeN fareler UTI89 suşları veya CFT073, IBC formasyonu gibi erken 3 HPI (saat sonrası enfeksiyonu) gibi bakterilerin küçük biyokütlelerin olarak görüntülenebilir. Bu topluluk genişletmeye devam ediyor ve çubuk şekilli bakteriler terminal farklılaşmış yüzeysel şemsiye hücrelerinin sitoplazmik alan büyük bir yüzdesini işgal zaman kalkınma yaklaşık 6 HPI bir "orta noktası" ulaştığında benzer boyutları görüntüleyen çoğunluğu ile nispeten senkron bir şekilde bu erken IBC formu ve morfolojisi. ~ 8 hpi bir basilinin gelen IBC değişim bakteri morfolojisi koklar için. IBC doğada geçicidir. Böylece, bakteriyel nüfusunun sürekli genişleme 12-18 hpi sonuçlarından IBC olgunlaşma, hücre wi dışarı onların ipliklenmenin ve dağılma ardındankomşu hücreler 23 sonraki yayılmasını th. Bu nedenle, IBC hücresi konak bağışıklık tepkilerinin ve antibiyotikler 25 korunmuş bir ortamda hızlı bir bakteri büyümesi sağlar. farelerde görülür UPEC enfeksiyonun farklı aşama, aynı zamanda, insanlarda 22,26-28 İYE modellemek için kullanılabilecek yararlı bir araç olarak İYE fare modelini destekler, bu IBC ve ipliklenmenin olarak insanlarda görülür.

Kadınların çoğunluğu yaşamları boyunca bir İYE yaşarken, bu enfeksiyonların sonucu sık tekrarlayan sistit, hiçbir nüks akut kendini sınırlayan enfeksiyon uzanabilir. Dahası, çalışmalar genetik bir bileşeni İYE yatkınlık 29 katkıda düşündüren, İYE güçlü ailesel geçtiği gösterilmiştir. Biz kliniklerde görülen farklı İYE sonuçları kendilenmiş fare suşlarının 30 arasında deneysel UPEC enfeksiyonu farklı sonuçların tarafından yansıtılmış olabilir bulduk. Örneğin, C3H / HeN, FMADBA ve C3H / HeOuJ fare bulaşıcı bir doza bağlı bir şekilde, kalıcı, yüksek titre bakteriler (> 10 4 koloni oluşturan birim (CFU) / ml), yüksek titre bakteriyel özelliği uzun ömürlü, kronik sistit, duyarlı kurban mesane yükü> 4 hafta sonrası enfeksiyon (TEFE), kronik inflamasyon ve ürotelyal nekroz. Bu fareler de kronik sistit gelişimi için biyobelirteçleri olarak hizmet ilk 24 HPI içinde IL-6, G-CSF, KC ve IL-5 serum seviyelerini gösterir. Plasebo çalışmaları İYE sistit ilk belirtiler sonra birkaç hafta boyunca kendi idrarda bakteri yüksek düzeyde tutacaktır karşılaşan kadınların büyük bir yüzdesi antibiyotik tedavisi 31 verilmediği takdirde göstermiştir ki gibi bu doğru, bazı kadınlarda İYE doğal seyrini temsil edebilir , 32. Dahası, C3H / HeN fareleri kullanılarak, kronik sistit öyküsü sonraki şiddetli tekrarlayan enfeksiyonlar için önemli bir risk faktörü olduğunu gördük. Tekrarlayan İYE çoğu si iseİYE ve C3H / HeN fare gnificant klinik bulgusu şu anda önceki maruz kaldıktan sonra artan yatkınlık özetlediği tek okudu modeldir. İkinci İYE sonuç Akut UPEC enfeksiyonu yaklaşık bir hafta içinde mesane iltihabı ve bakteriüri çözünürlüğe sahip, kendini sınırlayan nerede C57Bl / 6 fareler değinmeyecek. İlginç olarak, bu modelde, UPEC kolaylıkla UPEC potansiyel insanlarda 33 aynı suşu tekrarlayan İYE dair bir yöntemi, 34 açıklayan bir aktif İYE yeniden başlatmak için atıl bir durumda ortaya çıkan yeteneğine sahip olan mesane dokusu içinde hareketsiz hücre içi rezervuarlar oluştururlar.

İYE duyarlılık genetik etkilere ek olarak, mesane içine bir kateter giriş büyük bir enfeksiyona sahip olarak bir enfeksiyon neden olabilecek bakteri dizi artan olasılığını artırır. Bu insan idrar kateterizasyon histolojik neden olduğu gösterilmiştir venedeniyle mekanik sağlam bir inflamatuvar yanıt ile sonuçlanan stres, pul pul dökülme, lamina propria ve submucusa, ürotelyal incelme ödem ve ürotelyum ve böbrek 35,36 mukozal lezyon mesanede immünolojik değişiklikler. Buna ek olarak, kateter ve böylece CAUTI neden çeşitli türleri tarafından kullanılan bir ortam yaratmak bakteriyel bağlanması için bir yüzey temin eder. UPEC hala büyük bir katkı olmakla birlikte, Enterococcus faecalis bu CAUTI 37% 15 oluşturmaktadır. E. faecalis ciddi bir sağlık sorunu 38 poz, direnç ortaya çıkması vankomisin ile antibiyotiklere dirençli giderek hale geliyor. E. faecalis toksinler ve kateter ve epiteline 38 hem tutturmak için gerekli adezinler dahil olmak üzere birçok virülans faktörleri sahiptirler. Üriner kateterizasyon sırasında, ev sahibi idrar yolu 39,40 mikrobiyal yapışma, çarpma ve yayılması savunmasızdır. E. faecabir mekanizmanın parçası mesane inat ve bir fare CAUTI modelinde 41 çoğaltılamaz böbrekler için yaymak olarak lis kateter üzerinde bir biyofilm oluşturmaktadır. Son zamanlarda, üriner kateter içinde gösterilmiştir, fibrinojen (FG) enflamatuar yanıtın bir parçası olarak mesane içine salınır. Fg mont kateter mesanede birikir ve E. için önemlidir faecalis biyofilm oluşumu, bir ek iskele olarak işleyen. CAUTI bir C57BL / 6 fare modelinde, o keşfettik E. faecalis biyofilm kateter üzerinde oluşumu ve mesane böylece sebat, özellikle ucu adhesin EbpA EBP pilus bağlıydı. Biz EbpA N-terminal alanı, özellikle kateter kaplama FG bağlanır olduğu bulunmuştur. Buna ek olarak, tespit E. faecalis enfeksiyon sırasında metaboliti kaynağı, böylece biyofilm oluşumunu 42 artırılması olarak FG kullanır.

Fare model under kritik kanıtlanmıştırzanmıştır yanı sıra idrar yolu enfeksiyonu ve CAUTI 41 klinik belirtilerini tahmin. Bu yazıda sistit UPEC inokulum hazırlanması göstermek UTI89 ve C3H / HeN farelerin transüretral aşılama izole. Ayrıca, E. kateter C57BL / 6 farelerinde yerleştirilmesi ve aşılama için bir protokol göstermektedir faecalis'in OG1RF süzün. Bu tekniklerin her ikisi de farelerde tutarlı ve güvenilir üriner veya CAUTI yol açar. Biz de kronik veya tekrarlayan sistit analizi için akut sistit ve idrar toplama sırasında IBC oluşumunu gözlemlemek için kullanılan teknikleri gösterilecek. C3H / HeN fareler ilk bakteri istilası, IBC formasyonu, ipliklenmenin ve kronik sistit 23,33,43 geliştirilmesi dahil olmak üzere UPEC patogenezinde yönlerini incelemek için kullanılmıştır. Bu hastalık oluşturma parametreleri de diğer fare arka 22,33 çeşitli çalışmalar yapılmıştır. CAUTI için C57BL / 6 modeli müteakip bakteriyel işbirliği ile mesane içine yabancı cisim implantasyonu için izin verir7 gün boyunca muhafaza edilebilir lonization, enfeksiyon sonrası 41. Bu modeller daha sonra değinmeyecek veya klinik insan popülasyonlarında gözlenmiştir çok olan konak yanıtları, yıkmak için bakteriyel hastalık mekanizmaları, İYE ev sahipliği yanıtları ve mekanizmaların değerlendirilmesi için yararlı olmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Etik bildirimi: Washington Üniversitesi Hayvan Çalışmaları Komitesi 2013/01/11 onaylanmış ve 2016/01/11 sona eriyor oldu protokol numarası 20120216, bir parçası olarak, tüm fare enfeksiyonları ve prosedürleri onayladı. Hayvanların genel bakım Ulusal Araştırma Konseyi ve USDA Hayvan Bakım Kaynak Kılavuzu Laboratuvar Hayvanları Bakım için rehber ve Kullanım ile uyumlu idi. Ötenazi prosedürleri ile tutarlı "Hayvanlar 2013 sürümü için Ötenazi için AVMA kurallarına".

1. UPEC İYE Protokolü, Aşılanması İğne Hazırlama (Şekil S1)

  1. 30 G iğne kapağını çıkarın. Iğne miline PI10 boru yaklaşık 1 inç geçirin. Gecede iğne meclisleri sterilize, UV. Kateterize iğneler steril petri tabaklarında süresiz olarak saklanabilir.

2. UPEC bakteriyel inokulum hazırlanması

  1. UTI89 inokulum hazırlayın (aşı öncesinde 72 saat başlatmakyon gün)
    1. Dondurulmuş stoktan LB (Luria-Bertani) agar plaka üzerine Streak UTI89. 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin. Bir koloni seçin ve 125 ml'lik bir flask içinde, 10 ml LB içine inoküle. Statik, 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
    2. Statik, 37 ° C'de ilave bir 24 saat boyunca yeni 125 ml'lik bir flask içinde LB 10 ml, gece boyunca kültürün 10 ul inoküle.
    3. Transferi 3 ml 3 dakika boyunca 7.000 xg'de steril 1.5 ml tüplere ve santrifüj (zorlanma ve istenen inokulum boyutuna göre değişir) ve 1x PBS pelet ve santrifüj ikinci kez tekrar süspansiyon. PBS 1x 1 ml bakteri pelletini.
  2. Bakteriyel optik yoğunluk ölçün ve istenen inokulum yoğunluğu konsantrasyon ayarlayın. kullanılan inokulum standart konsantrasyonu 10 7 bakteri; Ancak, bu çalışmanın tasarımı sayesinde değişebilir.

3. Bakteriyel Aşılama

  1. % 70 etanol ve c iş istasyonu temizleyin(steril akış kaputu kullanın veya) emici kağıt ile alana.
  2. 1 ml (TB) şırıngaya hazırlanan bakteri inokulum 0.9 ml kadar çizin (hava kabarcıkları). Sonra steril polietilen boru döşeme, inokulum içeren şırınga üzerine, PI10 boru ile bir hazırlanan steril aşılama iğne takın.
    NOT: mesane delinmesiyle önlemek için iğne ucu yukarıda boru 1 mm bırakın.
  3. Parafilm 1 inç kare parça kesin ve üstüne cerrahi kayganlaştırıcı bir dab (bir kuruş yaklaşık boyutu) koyun.
  4. Kadar (protokol üretmektedir takiben) izofluran veya buharlaştırıcı odasının 3 ml ile ıslatılmış pamuk topları ile bir çay demlik topu içeren 32 onsluk cam kavanoz koyarak dişi C3H / HeN fareler anestezi bilinçsiz ama hala normal nefes (1 nefes / sn) .
    NOT: Bazı IACUC komiteleri bir kavanoz ya da buharlaştırıcı kullanımını tasvip etmiyoruz. Kurumunuzun IACUC komitesinin göstergesini takip ediniz.
    NOT: Eğer cam kavanozizofluran-soakd pamuk topları kullanıldığı çay-top ve / veya burun konisi ile hayvan dikkatlice anestezik doz aşımı ve ölümleri önlemek için dikkat edilmelidir. Bir buharlaştırıcı ve anestezi odasına kullanmanın avantajı yanlışlıkla aşırı doz önler kontrollü izofluran yönetimini sağlamasıdır. DİKKAT: İsofluranın bir inhalasyon anestezik. İyi havalandırılan bir alanda kullanın ve inhalasyon en aza indirmek.
  5. Kavanoz / buharlaştırıcı fareyi çıkarın ve bir kağıt havlu üzerine sırtında üzerine yerleştirin ve bacaklarını yayıldı.
  6. Bir burun konisi olan fare burun küçük bir miktar ihtiva eden bir pamuk (yaklaşık 1-2 ml veya 50 ml konik tüp (kontrollü isoflurance bir buharlaştırma birimleri donatılmıştır doz sunar buharlaştıncıya bağlı bir tüp) Kapak ) izofluran.
  7. Yavaşça idrar neden ve işeme mesane sağlamak için mesane palpitate. % 100 etanol silin ile periüretral alanı silin. Içine, ilk aşılama iğne / şırınga gelin dabCerrahi yağlayıcı.
  8. , Transüretral aşılama iğne takmadan yaklaşık 12 mm, ve mesane yavaşça (10 ul / sn) içine inokulum dağıtmak için hafifçe şırınga pistonu bastırarak bakteri solüsyonu 50 ul her fare inoküle edin. Fare aşılama iğne çıkarın.
    NOT: aşılamak başlayan üretral açılışında inokulum derhal iade iğnenin yanlış veya eksik ekleme gösterir.
  9. Burun konisi fareyi çıkarın ve kafesine geri. Yineleyin her fare için 3,3-3,8 adımları. Inokulum koşulları / suşları anahtarlama eğer / ne zaman, onaylanmış bir kesici kapta şırınga ve iğne aşılama imha ve yeniden 3.2 adım başlar.
    NOT: üropatojenik organizmalarla aşılama genellikle şiddetli ağrı belirtilerine neden olmaz. Ancak nadir durumlarda, patojenlerin yüksek dozlarda tatbik ateş, gıda ve su alımı ve anormal davranışları azalmaya neden olabilir. BirNimal sağlık deney boyunca izlenmelidir. Aşikar ağrı semptomları bildirimi, örneğin Buprenorfin (0.05-0.1 mg / kg verilen deri altına) olarak, bir ağrı kesici, varsa, uygulanabilir. Prosedürler her kurumun IACUC uygun olmalıdır.

Bakteriyel Yüklerin 4. Belirlenmesi

  1. Her mesane ve böbrekler çifti hasat edilmesi için ayrı 5 ml tüpler hazırlayın. 1x PBS / tüp / fare mesane 1ml ekleyin hasat edilecek. 1x PBS / tüp 0.8 ml ilave edilir / fare böbrek çifti hasat edilmesi. Belirli bir fareye karşılık her tüp etiketleyin. 1:10 seri dilüsyonları için her bir oyuğa 1x PBS 180 ul ihtiva eden bir 96-çukurlu plaka hazırlanması.
  2. % 70 etanol ile çalışma alanını temizleyin ve emici bir kapak veya kağıt havlu ile alanı kapsayacak.
  3. Fare, yaklaşık 1 dakika boyunca nefes duruncaya kadar izofluran ile fare anestezisi sonra emici kapağı veya kağıt havlu üzerine koyun, (adım 3.4). Euthana diğer yöntemlersia aynı zamanda, karbon dioksit gibi IACUC komite tarafından kabul edilir, ve izofluran doz aşımı için ikame edilebilir.
  4. Baş üssünde boyun kısıtlama ve yatay vücuttan çıkık oluşana kadar kuyruk çekme oluşur hızlı servikal dislokasyon ile fare Kurban.
    NOT: Çoğu IACUC komiteleri ötanazi ve servikal dislokasyon ikincil aracı gerektiren yaygın bir yöntemdir. IACUC komitesi tarafından onaylandı Ancak, diğer yöntemler de kullanılabilir.
  5. Sırtında ölü fare yerleştirin ve karın% 70 etanol sprey. Fareyi teşrih, böbrek diseksiyonu aşağıdaki kandan potansiyel kontaminasyonu en aza indirmek için bu sırayla, mesane ve böbreklerde hasat. 1x PBS içeren hazırlanmış 5 ml tüpler içine bağımsız organlar yerleştirin (adım 4.1).
    NOT: Harici diseksiyon ve organ toplama kontaminasyonu minimize etmek için farklı makas kullanın.
  6. Organlar t sağlamak için tüp dokununO PBS 1x. Her fare için yineleyin 4,3-4,5. Temiz makas ve her bir farenin sonra% 70 etanol içinde forseps.

5. Bakterilerin Kurtarma

  1. , Bir doku homojenleştirici ile böbrek başına 15 saniye ve mesane 30 saniye 5 ml tüpler hasat kesesi ve böbrek homojenize edilir. 1x PBS,% 70 etanol ve örnekler arasında 1x PBS homojenizer sekans durulayın.
  2. 10 -8 dışarı seri 01:10 dilüsyonları yapın ve LB agar plakaları üzerinde CFU için her seyreltme (koloni oluşturan birim) plaka. 37 ° C'de plakaları gece inkübe ve koloniler ertesi gün saymak.

6. IBC numaralandırma

  1. Aseptik mesane çıkarın ve bir silikon alt kısma sahip bir 6-yuvalı plaka içindeki 1 x PBS içinde yerleştirin. Plakalar, bir silikon elastomer kiti kullanılarak ve de her biri yaklaşık olarak silikon 1 cm dökme hazırlanabilir, bkz talimatları üretmektedir. Makas kullanılarak yarısında mesane kesin.
  2. Küçük metal işaretçilerine kullanma hafifçe blad splayder, böylece mesane lümen yukarı bakacak. Ürotelyumun maksimum miktarda maruz sağlamak için mesane bölümlerinin dış kenarlarında işaretçilerine yerleştirmek için emin olun.
  3. Yayvanlaşmasıyla sonra, yavaşça 1x kez PBS ile mesane yıkayın. Pipet ile 1x PBS çıkarın. Tüm yayvan mesane karşılamak için yeterli% 3 paraformaldehid ekleyerek mesane sabitleyin. DİKKAT: Paraformaldehyde kanserojen olduğunu. Eldiven içeren uygun koruyucu donanım, her zaman giyilmelidir. Bertaraf kurumsal kurallara uymalıdır.
  4. 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. Paraformaldehit çözüm çıkarın. 1x bir kez PBS ile yıkayın.
  5. (PBS 1X 2 mM MgCl2,% 0.01 sodyum deoksikolat ve% 0.02 Nonidet-p40in) LacZ yıkama çözeltisi, yıkama başına 5 dakika için üç kez yıkayın.
  6. Yeterince LacZ leke yıkama solüsyonu çıkarın ve ekleme (9.5 mi LacZ yıkama çözeltisi, 0.4 mi 25 mg / ml X-gal ve 100 mM K-ferrosiyanür / K-ferrisiyanür 0.1 mi) mesane kapsayacak. 30 ° C overni inkübeışıktan koruyarak GHT.
  7. Inkübatör yayvan mesane çıkarın ve diseksiyon kapsamı, 40-60X büyütme ile görüntülendi gibi mavi puncta görünür IBC, gözlemlemek.
    NOT: Bazen fare üretranın altında tüpün yerleştirilmesi öncesinde idrar olabilir. Bu durumda, yeniden idrar toplamak için denemeden önce 15-20 dakika bekleyin.

7. İdrar Bakteriüri CFU Sayımı İçin Toplama (CAUTI için Uygulanamaz)

  1. İdrar öncesi toplamak veya enfeksiyonu yayınlamak için yavaşça (fare kafesinin üst) kuyruğunu tutan ve düz bir yüzeye yükseltilmiş üzerine yerleştirerek fare dizginlemek.
  2. Fare üretranın altında steril 1.5 ml tüp tutun. Yavaşça mesaneye baskı uygulamak için kuyruk yakın farenin arkasına bastırın. 1.5 ml tüp idrar yakalayın.
  3. 10 -7 dışarı seri 1:10 dilüsyonları yapın ve uygun LB her seyreltme plaka 37 ° C'de plakaları gece inkübe ve koloniler ertesi gün saymak.

8. CAUTI Modeli Protokol, CAUTI Modeli için Kateter İğne Hazırlık (Şekil S2)

  1. 30 G iğne kapağını çıkarın. PE10 boru ve RenaSIL gibi silikon boru 5 mm büyüklüğündeki bir 7 mm parça kesin. Boru iğne tabanını dokunana kadar PI10 boru ile iğne geçirin.
  2. Daha sonra PE10 içeren iğne üzerine 5 mm parça besleme. Gecede iğneler derlemeleri sterilize, UV.
    NOT: silikon tüp yüklerken, iğne ucu geçmiş uzanan boru yaklaşık 1 mm bırakın.

9. E. faecalis OG1RF bakteriyel inokulum hazırlanması

  1. Aşılama gün önce 48 saat başlangıç ​​OG1RF inokulum hazırlayın. Donmuş stoktan bir BHI (Beyin Kalp infüzyonu) plakası üzerine Şerit OG1RF.
  2. Bir koloni seçin ve BHI 10 ml içine aşılamak ve 37 ° C'de 18 saat süreyle statik büyümek. Kültür santrifüj ve steril 1 x PBS içinde 1 ml hacim pelet (3 kez) yıkama.
  3. 1x PBS içine bakteri pelletini. Bakteriyel optik yoğunluk ölçün ve istenen inokulum boyutuna konsantrasyonunu ayarlayın. kullanılan inokulum standart konsantrasyonu 10 7; Ancak, bu çalışmanın tasarımı nedeniyle değişebilir

10. Kateter Yerleştirilmesi

  1. % 70 etanol ile iş istasyonu temizleyin ve bir emici kapak alanı ile kapak (ya da steril akış kapağı kullanın).
  2. Boş 1 ml (TB) şırınga kateter iğne takın. Parafilm 1 inç kare parça kesin ve üstüne cerrahi kayganlaştırıcı bir dab (bir kuruş yaklaşık boyutu) koyun.
    Not: iki farklı iğneler katetere bağlı implantasyonu için gerekli olan mekanik manipülasyon kateterin biriktirme ve minimize yanlışlıkla aşılama için aşı için kullanılmıştır. Bu aynı zamanda daha az aşılama iğneleri hazırlama kolaylık sağlar.
  3. Bir çay içeren 32 onsluk cam kavanozda koyarak C57BL / 6 fareler anesteziizofluran veya buharlaştırıcı odasının 3 ml batırılmış pamuk topları ile -infuser top bilinçsiz ama hala normal nefes (1 nefes / sn) kadar (aşağıdaki protokol üretmektedir).
  4. Sonra bir kağıt havlu üzerine sırtında fare koymak ve bacaklarını yayıldı. Küçük bir miktar izofluran (yaklaşık 1-2 ml) içeren pamuk topları ile bir burun konisi veya 50 ml konik tüp ile fare burun örtün.
    DİKKAT: İsofluranın bir inhalasyon anestezik. İyi havalandırılan bir alanda kullanın ve araştırmacı tarafından solunmasını en aza indirmek.
  5. Yavaşça idrar neden ve işeme mesane sağlamak için mesane palpitate. % 100 etanol silin ile periüretral alanı silin.
  6. Bir pamuk uçlu aplikatör kullanarak% 10 povidon-iyot çözeltisi ile periüretral alan dezenfekte edin. Cerrahi yağlayıcı içine ilk aşılama iğne / şırınga gelin hafifçe sürün.
    Not: Povidine-iyot alkol daha kuvvetli bir aseptik çözelti, kateter yerleştirilmesi için kullanılır. Kateter implantasyonu gerektirirdaha fazla mekanik manipülasyon kateter ve kirlenme dolayısıyla daha büyük bir potansiyele eklemek için.
  7. Üretral kateter deliğe yerleştirin. Bir kez, cımbız kullanın dolayısıyla (5 mm silikon), küçük kateter itme ve mesane içine yatırılması, mesane doğru (7 mm PI10) uzun bir parça itmek için. Hemen hala bağlı 7 mm boru ile, iğne çıkarın.

11. Bakteriyel Aşılama

  1. Burun konisi fareyi çıkarın ve kafesine geri bölüm 9. itibaren hazırlanan inokulum kullanarak, bölüm 3 bakteriyel aşılama protokolü takip

Kurban Her Zaman Noktasında 12.

  1. Mesane ve böbrek 5 ml tüpler (organlar adım 4.1 izleyin için) ve kateter 1.5 ml Eppendorf tüp hazırlayın. Kateter numune için 1.5 ml'lik Eppendorf tüpü içine 1 x PBS içinde 1 ml ilave edilir
  2. Adımları 4,3-4,5 izleyin. Mesane, böbrek ve kateter hasat, fare teşrih, pla1x PBS ve 1.5 ml Eppendorf içine kateter (adım 12.1 bakınız) ihtiva eden 5 ml tüpler içine, bağımsız bir doku dans ediyorum.
    NOT: Harici diseksiyon ve kirlenmeyi en aza indirmek için organ toplama ve kateter alımı için farklı bir makas kullanın
  3. Sonra adım 4.6 izleyin.

13. Bakteriyel Kurtarma

  1. Organları için adımları 5.1 ve 5.2 izleyin. 30 saniye boyunca maksimum hızda bakteri kateterler kurtarma, vorteks için 5 dakika ilave bir 30 saniye boyunca maksimum hızda sonra vorteks banyo sonikatör kullanarak ve kateter örnekleri sonikasyon.
  2. 10 -8 dışarı seri 01:10 dilüsyonları yapın ve BHI plakaları üzerinde CFU sayımı için her seyreltme plaka. Gece boyunca 37 ºC inkübe ve koloniler ertesi gün saymak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

komplikasyonsuz ve kateter ilişkili İYE intravezikal modelleri bu ortak ve pahalı enfeksiyonları yönetmek bakteriyel patogenezi, konak dokusunda bu hastalıkların etkisi, ve geliştirme ve yeni yaklaşımların test moleküler mekanizmaların için esnek platformlar sunmak. Fare zorlanma ve patojene bağlı olarak, intravezikal aşılama akut başlatmak veya modüle edilmesi için gerekli faktörleri (Şekil 1 ve 3), kronik veya tekrarlayan (Şekil 2) sistiti aydınlatmak için konak-patoj...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Komplike olmayan topluluk İYE birkaç milyon birinci basamak ziyaretleri her yıl 46 için muhasebe yaygın ve masraflı enfeksiyonudur satın aldı. Buna ek olarak, Cautis artık CAUTI 45 edinilen hastaneden kaynaklanan tedavi eklenen maliyet sağlayıcıları tazmin Medicare ve Medicaid Hizmetleri Merkezleri gibi sağlık sağlayıcıları için son derece pahalı hale gelmiştir ortak sağlık edinilen enfeksiyon vardır. Bu protokollerin açıklandığı İYE, hem komplike olmayan sistit ve CAUTI fare modelleri, başlatma ba...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

Teşekkürler

Bu iş için finansman, ORWH SCOR P50 DK064540 tarafından RO1 DK 051406, RO1 AI 108749-01, F32 DK 101171, ve F32 DK 104516-01 sağlandı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kateter ve iğne hazırlama malzemesi:
30 G iğnelerBD Precision Glide30510630 G x ½ (0,3 mm x 13 mm)
PE10 polietilen boruBD427400İç çap -0,011 inç (0,28 mm); dış çap – 0,024 inç (0,61 mm)
RenaSIL 025 platinle kürlenmiş silikon boruBraintree Scientific, IncSIL 025iç çap-0,012 x dış çap 0,025, 25 ft coil
Enfeksiyonlar için malzeme:
İzoflonan – IsothesiaButler Schein29405 250ml
Şeffaf Cam Düz Kenarlı KavanozKimble Chase5413289V 21
Paslanmaz Çelik Çay DemlikSchefs-AmazonPremium Gevşek Yapraklı Çay Demlik By Schefs - Paslanmaz Çelik - Büyük Kapasite -
Steril olmayan pamuk toplarıFisherbrand22-456-880
50 ml Falcon tüpleriVWR89039-660
Isotec 3 -buharlaştırıcıOhmeda1224478
Kulak yumruğuFisher Scientific13-812-201(gerektiğinde)
Betadine çözeltisiBetadine çözeltisi% 10 Povidie-iyot topikal çözeltisi
Q-ipuçlarıFisher Scientific22-037-9246 inç
Tezgah için çocuk beziFisherbrand14206 63Emici Alt Pedler (20" X36 inç paspaslar)
Cerrahi yağlayıcıSurgilube0281-0205-36
Diseksiyon makasıGüzel Bilim aletleri, INC14084-08
Mikro-Adson ForsepsGüzel Bilim aletleri, INC11018-12
1 ml şırıngaBD309659Tüberkülin kayma ucu
ParafilmBemisPM9964 inç x 125 FT
Eppendorf rafFisherbrand05-541-1
Eppendorf tüpleriMIDSCIAVX-T-17-C
Toplama kateterleri, mesaneler ve böbrekler:
HomojenizatörPRO Scientific INCBio-Gen Pro 200
Organ homojenizasyonu için5 ml polipropilen yuvarlak tabanlı tüpBD352063
Kağıt havluGeorgia-Pacific
EtanolPharmco-AAPER11100020S200 kanıt
Costar ve ticaret; Şeffaf Polistiren 96 Kuyulu PlakalarCorning3788
1x Fosfat sodyum salinSigma-AldrichP3813
BRANSONIC Ultrasonik temizleyici 1210Branson Ultrasonik Şirketi1210
IBC malzemeler:
6 kuyulu doku kültürü test plakasıTekno Plastik Ürünler92006
PimGüzel Bilim Araçları26002-20
Sylgard 184Dow Corning3097358-1004Silikon Elastomer Kiti
X-gal (5-bromo-4-kloro-3-indolil-b-D-galaktozit)İnvitrojen15520-034Ultrasaf
N, N-DimetilformamidSigma AldrichD4551
MgCl2< / sub> (Magnezyum klorür)Sigma AldrichM8266
Sodyum deoksikolatSigma AldrichD6750
Nonidet-P40Roche11754599001Oktilfenolpoli (etilenglikoleter) n
Potasyum hekzasiyanoferrat (II) trihidrat (K-ferrOcyanide)Sigma AldrichP3289
Potasyum hekzasiyanoferrat (III) (K-ferrIsiyanür)Sigma Aldrich60299

Kaynaklar

  1. Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. Dis Mon. 49, 53-70 (2003).
  2. Foxman, B., et al. Risk factors for second urinary tract infection among college women. American journal of epidemiology. 151, 1194-1205 (2000).
  3. Gupta, K., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Increasing antimicrobial resistance and the management of uncomplicated community-acquired urinary tract infections. Annals of internal medicine. 135, 41-50 (2001).
  4. Gupta, K., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Isolation of fluoroquinolone-resistant rectal Escherichia coli. after treatment of acute uncomplicated cystitis. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 56, 243-246 (2005).
  5. Gupta, K., Sahm, D. F., Mayfield, D., Stamm, W. E. Antimicrobial resistance among uropathogens that cause community-acquired urinary tract infections in women: a nationwide analysis. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 89-94 (2001).
  6. Gupta, K., Scholes, D., Stamm, W. E. Increasing prevalence of antimicrobial resistance among uropathogens causing acute uncomplicated cystitis in women. Jama. 281, 736-738 (1999).
  7. Jarvis, W. R. Selected aspects of the socioeconomic impact of nosocomial infections: morbidity, mortality, cost, and prevention. Infect Control Hosp Epidemiol. 17, 552-557 (1996).
  8. Lo, E., et al. Strategies to prevent catheter-associated urinary tract infections in acute care hospitals: 2014 update. Infection control and hospital epidemiology : the official journal of the Society of Hospital Epidemiologists of America. 35, 464-479 (2014).
  9. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature reviews Urology. 7, 653-660 (2010).
  10. Hooton, T. M., Stamm, W. E. Diagnosis and treatment of uncomplicated urinary tract infection. Infect Dis Clin North Am. 11, 551-581 (1997).
  11. Hannan, T. J., et al. LeuX tRNA-dependent and -independent mechanisms of Escherichia coli. pathogenesis in acute cystitis. Molecular microbiology. 67, 116-128 (2008).
  12. Cusumano, C. K., Hung, C. S., Chen, S. L., Hultgren, S. J. Virulence plasmid harbored by uropathogenic Escherichia coli. functions in acute stages of pathogenesis. Infection and immunity. 78, 1457-1467 (2010).
  13. Dhakal, B. K., Mulvey, M. A. The UPEC pore-forming toxin alpha-hemolysin triggers proteolysis of host proteins to disrupt cell adhesion, inflammatory, and survival pathways. Cell host & microbe. 11, 58-69 (2012).
  14. Garcia, E. C., Brumbaugh, A. R., Mobley, H. L. Redundancy and specificity of Escherichia coli. iron acquisition systems during urinary tract infection. Infection and immunity. 79, 1225-1235 (2011).
  15. Bergsten, G., Wullt, B., Svanborg, C. Escherichia coli., fimbriae, bacterial persistence and host response induction in the human urinary tract. International journal of medical microbiology : IJMM. 295, 487-502 (2005).
  16. Zhou, G., et al. Uroplakin Ia is the urothelial receptor for uropathogenic Escherichia coli.: evidence from in vitro FimH binding. J Cell Sci. 114, 4095-4103 (2001).
  17. Eto, D. S., Jones, T. A., Sundsbak, J. L., Mulvey, M. A. Integrin-mediated host cell invasion by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 3, e100(2007).
  18. Taganna, J., de Boer, A. R., Wuhrer, M., Bouckaert, J. Glycosylation changes as important factors for the susceptibility to urinary tract infection. Biochemical Society transactions. 39, 349-354 (2011).
  19. Mulvey, M. A., et al. Induction and evasion of host defenses by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli. Science. 282, 1494-1497 (1998).
  20. Mysorekar, I. U., Mulvey, M. A., Hultgren, S. J., Gordon, J. I. Molecular regulation of urothelial renewal and host defenses during infection with uropathogenic Escherichia coli. The Journal of biological chemistry. 277, 7412-7419 (2002).
  21. Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population Dynamics and Niche Distribution of Uropathogenic Escherichia coli. during Acute and Chronic Urinary Tract Infection. Infect. Immun. 79, 4250-4259 (2011).
  22. Garofalo, C. K., et al. Escherichia coli. from urine of female patients with urinary tract infections is competent for intracellular bacterial community formation. Infection and immunity. 75, 52-60 (2007).
  23. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli. in urinary tract pathogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 1333-1338 (2004).
  24. Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae. urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infection and immunity. 76, 3337-3345 (2008).
  25. Anderson, G. G., et al. Intracellular bacterial biofilm-like pods in urinary tract infections. Science. 301, 105-107 (2003).
  26. Robino, L., et al. Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli. recurrent urinary tract infections. Pathogens and disease. 68, 78-81 (2013).
  27. Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4, e329(2007).
  28. Horsley, H., et al. Enterococcus faecalis subverts and invades the host urothelium in patients with chronic urinary tract infection. PloS one. 8, e83637(2013).
  29. Hopkins, W. J., Uehling, D. T., Wargowski, D. S. Evaluation of a familial predisposition to recurrent urinary tract infections in women. American Journal of Medical Genetics. 83, 422-424 (1999).
  30. Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli. urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infection and immunity. 66, 2798-2802 (1998).
  31. Mabeck, C. E. Treatment of uncomplicated urinary tract infection in non-pregnant women. Postgraduate medical journal. 48, 69-75 (1972).
  32. Ferry, S., Holm, S., Stenlund, H., Lundholm, R., Monsen, T. The natural course of uncomplicated lower urinary tract infection in women illustrated by a randomized placebo controlled study. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 36, 296-301 (2004).
  33. Hannan, T. J., Mysorekar, I. U., Hung, C. S., Isaacson-Schmid, M. L., Hultgren, S. J. Early severe inflammatory responses to uropathogenic E. coli. predispose to chronic and recurrent urinary tract infection. PLoS Pathog. 6, (2010).
  34. Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli. persistence and eradication from the urinary tract. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 14170-14175 (2006).
  35. Glahn, B. E., Braendstrup, O., Olesen, H. P. Influence of drainage conditions on mucosal bladder damage by indwelling catheters. II. Histological study. Scandinavian journal of urology and nephrology. 22, 93-99 (1988).
  36. Goble, N. M., Clarke, T., Hammonds, J. C. Histological changes in the urinary bladder secondary to urethral catheterisation. British journal of urology. 63, 354-357 (1989).
  37. Ronald, A. The etiology of urinary tract infection: traditional and emerging pathogens. Dis Mon. 49, 71-82 (2003).
  38. Arias, C. A., Murray, B. E. The rise of the Enterococcus.: beyond vancomycin resistance. Nature reviews. Microbiology. 10, 266-278 (2012).
  39. Garibaldi, R. A., Burke, J. P., Dickman, M. L., Smith, C. B. Factors predisposing to bacteriuria during indwelling urethral catheterization. The New England journal of medicine. 291, 215-219 (1974).
  40. Warren, J. W. Catheter-associated urinary tract infections. Infect Dis Clin North Am. 11, 609-622 (1997).
  41. Guiton, P. S., Hung, C. S., Hancock, L., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. Enterococcal biofilm formation and virulence in an optimized murine model of foreign body-associated urinary tract infections. Infection and immunity. 78, 4166-4175 (2010).
  42. Flores-Mireles, A. L., Pinkner, J. S., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. EbpA vaccine antibodies block binding of Enterococcus faecalis. to fibrinogen to prevent catheter-associated bladder infection in mice. Science translational medicine. 6, 254ra127(2014).
  43. Martinez, J. J., Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Pinkner, J. S., Hultgren, S. J. Type 1 pilus-mediated bacterial invasion of bladder epithelial cells. The EMBO Journal. 19, 2803-2812 (2000).
  44. Hultgren, S. J., Schwan, W. R., Schaeffer, A. J., Duncan, J. L. Regulation of production of type 1 pili among urinary tract isolates of Escherichia coli. Infection and immunity. 54, 613-620 (1986).
  45. Chenoweth, C. E., Gould, C. V., Saint, S. Diagnosis, Management, and Prevention of Catheter-Associated Urinary Tract Infections. Infect. Dis. Clin. North Am. 28, 105-+(2014).
  46. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7, 653-660 (2002).
  47. Justice, S. S., Hunstad, D. A., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Filamentation by Escherichia coli. subverts innate defenses during urinary tract infection. Proc Natl Acad Sci USA. 103, (1988).
  48. Song, J., et al. TLR4-mediated expulsion of bacteria from infected bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14966-14971 (2009).
  49. Wang, H., Min, G., Glockshuber, R., Sun, T., Kong, X. P. Uropathogenic E. coli. adhesin-induced host cell receptor conformational changes: implications in transmembrane signaling transduction. Journal of molecular biology. 392, 352-361 (2009).
  50. Cusumano, C. K., et al. Treatment and prevention of urinary tract infection with orally active FimH inhibitors. Science translational medicine. 3, 109-115 (2011).
  51. Langermann, S., Ballou, W. R. Vaccination utilizing the FimCH complex as a strategy to prevent Escherichia coli. urinary tract infections. J Infect Dis. 183, S84-S86 (2001).
  52. Langermann, S., et al. Vaccination with FimH adhesin protects cynomolgus monkeys from colonization and infection by uropathogenic Escherichia coli. J Infect Dis. 181, 774-778 (2000).
  53. Langermann, S., et al. Prevention of mucosal Escherichia coli. infection by FimH-adhesin-based systemic vaccination. Science. 276, 607-611 (1997).
  54. Alteri, C. J., Hagan, E. C., Sivick, K. E., Smith, S. N., Mobley, H. L. T. Mucosal Immunization with Iron Receptor Antigens Protects against Urinary Tract Infection. Plos Pathogens. 5, (2009).
  55. Russo, T. A., et al. The siderophore receptor IroN of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. is a potential vaccine candidate. Infect. Immun. 71, 7164-7169 (2003).
  56. Schwartz, D. J., et al. Positively selected FimH residues enhance virulence during urinary tract infection by altering FimH conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15530-15537 (2013).
  57. Czaja, C. A., et al. Prospective cohort study of microbial and inflammatory events immediately preceding Escherichia coli. recurrent urinary tract infection in women. J Infect Dis. 200, 528-536 (2009).
  58. Chen, S. L., et al. Genomic Diversity and Fitness of E. coli. Strains Recovered from the Intestinal and Urinary Tracts of Women with Recurrent Urinary Tract Infection. Science Translational Medicine. 5, 2013(2013).
  59. Schilling, J. D., Mulvey, M. A., Vincent, C. D., Lorenz, R. G., Hultgren, S. J. Bacterial invasion augments epithelial cytokine responses to Escherichia coli. through a lipopolysaccharide-dependent mechanism. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 166, 1148-1155 (2001).
  60. Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population Dynamics and Niche Distribution of Uropathogenic Escherichia coli. during Acute and Chronic Urinary Tract Infection. Infect. Immun. 79, 4250-4259 (2011).
  61. Chan, C. Y., St John,, L, A., Abraham, S. N. Mast Cell Interleukin-10 Drives Localized Tolerance in Chronic Bladder Infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
  62. Justice, S. S., Lauer, S. R., Hultgren, S. J., Hunstad, D. A. Maturation of intracellular Escherichia coli. communities requires SurA. Infect. Immun. 74, 4793-4800 (2006).
  63. Justice, S. S., Hunstad, D. A., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Filamentation by Escherichia coli. subverts innate defenses during urinary tract infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19884-19889 (2006).
  64. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli. in urinary tract pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 1333-1338 (2004).
  65. Guiton, P. S., Hannan, T. J., Ford, B., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. Enterococcus faecalis. Overcomes Foreign Body-Mediated Inflammation To Establish Urinary Tract Infections. Infect. Immun. 81, 329-339 (2013).
  66. Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder. Journal of Immunology. 176, 3080-3086 (2006).
  67. Rosen, D. A., Hung, C. -S., Kline, K. A., Hultgren, S. J. Streptozocin-induced diabetic mouse model of urinary tract infection. Infect. Immun. 76, 4290-4298 (2008).
  68. Daneshgari, F., Leiter, E. H., Liu, G., Reeder, J. Animal Models of Diabetic Uropathy. Journal of Urology. 182, S8-S13 (2009).
  69. Guiton, P. S., et al. Combinatorial Small-Molecule Therapy Prevents Uropathogenic Escherichia coli. Catheter-Associated Urinary Tract Infections in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56, 4738-4745 (2012).
  70. Totsika, M., et al. A FimH Inhibitor Prevents Acute Bladder Infection and Treats Chronic Cystitis Caused by Multidrug-Resistant Uropathogenic Escherichia coli. ST131. Journal of Infectious Diseases. 208, 921-928 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Düzeltme


Formal Correction: Erratum: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model
Posted by JoVE Editors on 8/18/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. The Protocol section has been updated.

The ethics statement has been updated from:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20120216, which was approved 01/11/2013 and expires 01/11/2016. Overall care of the animals was consistent with The guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

to:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20150226, which expires 12/10/2018. Overall care of the animals was consistent with The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

Step 3 has been updated from:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a 32 ounce glass jar containing a tea-infuser ball with cotton balls soaked with 3 ml of isoflurane or vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a jar or vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    NOTE: If glass jar with tea-ball and/or nose cone with isoflurane-soakd cotton balls are used, the animal must be carefully observed to avoid anesthetic overdose and death. The advantage of using a vaporizer and anesthesia chamber is that it provides controlled isoflurane administration that avoids accidental overdoses. CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the jar/vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) or 50 ml conical tube with a cotton ball containing a small amount (approximately 1-2 ml) of isoflurane.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.

to:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) to maintain anesthetization.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.

Etiketler

Üriner Sistem EnfeksiyonuKateter Kaynaklı İYEBakteriyel İnokülumİntravezikal İnokülasyonCFU SayımıIBC OluşumuMesane HasadıKateter İmplantasyonuÜropatojenik E. coli
Fare Modelinde Kuruluş ve İYE ve CAUTI Karakterizasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.