Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kronik sonra fare dalak DNA hasar ve Onarım Ölçme

10.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/52912

⸱

3 Temmuz 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Radiological Protection Research and Instrumentation, Canadian Nuclear Laboratories

Bu makalede

Özet

Fare dalak lenfositlerinde kronik in vivo düşük doz ışınlamanın neden olabileceği DNA hasar seviyelerindeki ve DNA onarım kapasitesindeki değişiklikleri, DNA çift sarmallı kırılmaların bir belirteci olan fosforile histon H2AX'i ölçerek, akış sitometrisi kullanarak değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır.

Özet

Düşük doz radyasyon yüksek radyasyon dozları tarafından üretilen etkilerden nicelik ve nitelik olarak farklı biyolojik etkileri çeşitli üretebilir. Doğru ve bilimsel haklı bir şekilde, çevre, mesleki ve halk sağlığı güvenliği ile ilgili sorulara yanıt ağır doğru radyasyon ve kimyasal madde iyonize olarak düşük doz kirleticilerin, biyolojik etkilerini ölçmek için yeteneği dayanır. DNA hasarı ve onarımı nedeniyle kanser gibi potansiyel uzun vadeli sonuçları, sağlık riskleri en önemli erken göstergeleridir. Burada fare dalak hücrelerinde DNA hasarı ve onarımı üzerine γ- ve β-radyasyon düşük dozlarda in vivo maruz kalma kronik etkisini incelemek için bir protokol açıklar. DNA çift iplikli kırılmalara bir genel kabul görmüş kalem kullanarak, γH2AX denilen fosforile histon H2AX, biz DNA hasarı sadece düzeylerini değerlendirmek için nasıl kullanılabileceğini göstermek değil, aynı zamanda değişirDNA onarım kapasitesi potansiyel in vivo pozlarda düşük dozda tarafından üretilen. Örneklerin çok sayıda immunofluorescently etiketli γH2AX hızlı, doğru ve güvenilir bir ölçüm sağlar akım sitometrisi. DNA çift sarmallı mola onarımı (DNA onarımını tetiklemek için tatili yeterli sayıda üretmek için 2 Gy zorlu doz ayıklanır splenositlerin teşhir ederek ve isteyerek (1 saat sonrası radyoterapi) ve kalan DNA hasarını ölçerek 24 saat değerlendirilebilir post-ışınlama). Kalıntı DNA hasarı eksik onarımı ve uzun vadeli genomik instabilite ve kanser riski göstergesi olabilir. Kolayca in vivo çalışmalar (örneğin, kromozom anormallikleri, kemik iliği retikülositlerde Mikronukleus frekansları, gen ekspresyonu, vs.) gibi ölçülebilir diğer deneylerden ve son-nokta ile birlikte, bu yaklaşım, biyolojik etkileri arasında doğru ve bağlamsal değerlendirme sağlar düşük düzeyde stres.

Giriş

(Kitle iletişim araçlarının şiddetlenir) radyasyon ve Hiroşima ve Nagasaki atom bombalama ve nadir nükleer santral kazalarının görüntüleri ile tahrik radyasyon halkın korku iyonize düşük ya da çok düşük dozlarda ya potansiyel zararlı etkileri üzerinde önemli tartışma, yol açmıştır çok sıkı radyasyondan korunma yönetmeliği ve potansiyel bilimsel haklı değildir standartları. Son üç yıl içinde, çok sayıda raporlar zararlı olmaması ve düşük doz radyasyon 1-4 tarafından uyarılan potansiyel olarak yararlı biyolojik etkiler varlığını hem de belgelenmiştir. büyük radyasyon sağlık risk faktörü radyasyon yüksek veya orta doz alan atom bombası kurtulanların epidemiyolojik çalışmalara dayanarak tahmin edilen kanser olasılığı vardır. (Yani doğrusal-no-eşik veya LNT modeli olarak adlandırılır) Bu verilerin lineer ekstrapolasyonu düşük dozlarda kanser riskini tahmin etmek için kullanılır. Ancak, bu yaklaşım, dünya çapında bilimsel kabul almadıve ağır 5 tartışmalıdır.

Daha çalışmalar bu konuyu açıklığa kavuşturmak ve muhtemelen radyasyondan korunma standartlarını iyileştirmek için gerekli olduğu açıktır. Bu tür çalışmalar, DNA hasarı oranları, DNA tamiri ve mutasyon olarak ve son puan (insan etkileri tahminde için en iyi) in vivo hayvan modellerinde kronik tedaviler (çevresel ve mesleksel maruziyet en iyi yaklaşım), içermelidir. DNA mutagenez ve kanser gelişimi 6 yol açabilir radyasyon etkileri ve eksik ya da yanlış onarım zarar için öncelikli hedef olduğu bilinmektedir.

DNA çift iplikli sonları (DSB), DNA lezyonlarının en zararlı türlerinden biri olan ve hücre ölümü ve tümörogenez 7 yol açabilir. Dolayısıyla, önemli bir güvenilir ve doğru bir düşük doz radyasyon ve / veya kimyasal kirleticilerin gibi diğer stres, maruz kaldıktan sonraki DSB düzeyini ölçmek mümkün edilir. En duyarlı ve spesifik belirteçler biriDNA DSB γH2AX 8 olarak adlandırılan, fosforile edilmiş histon H2AX, henüz diğer belirteçler ve yöntemler 9,10 önerilmiştir. Bu H2AX moleküllerinin binlerce indüklenen bir DSB yakınında, bir anti-γH2AX antikoru ve floresan mikroskobu 11 immünofloresan etiketleme tek tek DSB saptanmasını sağlayan γH2AX oluşumunda yer olduğu tahmin edilmektedir. cevap 30 dakika ila 60 maksimuma ulaşan, çok hızlıdır. Kanıt γH2AX sonları sitelere diğer onarım faktörleri çekerek ve kırık DNA uçlarını çapa ve (12 gözden) diğer onarım proteinleri için erişim sağlamak için kromatin yapısını değiştirerek DNA DSB tamirini kolaylaştırır var. DNA DSB onarım tamamlanması üzerine, γH2AX fosforile de ve / veya bozulmaya uğrar ve yeni sentezlenen H2AX molekülleri kromatin 10 etkilenen bölgelerde γH2AX yerini alır. ΓH2AX oluşumunu ve kaybı olabilir İzleme,Bu nedenle, DNA DSB onarım kinetik kesin bir tahmininin sağlanması. Bu yaklaşım, Radyosensitivitenin 13-15 ile ilişkili olduğu gösterilmiş olan radyasyon ve hızı ve kalıntı DSB seviyelerinin yüksek dozlarda ışınlandı, çeşitli insan tümör hücre çizgilerinde DSB onarım incelemek için kullanılmıştır.

Biz bu deneysel bir yaklaşım modifiye ve DNA DSB düzeyleri ve tamiri (Şekil 1) Kronik γ- ve β-radyasyon düşük dozlarda etkilerini incelemek için canlı bir fare çalışmasında bunu uyguladık. İlk olarak, içme suyu içinde çözülmüş β-radyasyon için toz haline getirilmiş, su (HTO) şeklinde ya da trityum tarafından yayılan (hidrojen-3) ya da organik olarak bağlanmış trityum (OBT) farelerin bir uzun vadeli kronik maruz kalma gerçekleştirmek için bir yöntem ortaya koymaktadır . İki form birikir ve / ya da farklı vücut ve dolayısıyla dağıtma, farklı biyolojik etkilere beklenmektedir. Her iki form nükleer endüstride potansiyel tehlikeler vardır. Bu tedavibunların nispi biyolojik etkinliğinin değerlendirilmesi için çok önemlidir, iki radyasyon türlerinin doğru bir karşılaştırmasını izin vermek için, bir eşdeğer bir doz oranında γ-radyasyonuna kronik maruz kalınması ile paraleldir. Beta-radyasyon γ-radyasyon, yüksek enerjili fotonların den çok farklı kılan, elektron oluşmaktadır. Bu nedenle farkı, Β-radyasyon çoğunlukla iç sağlık tehlikesi temsil eder ve γ-radyasyon ile karşılaştırıldığında farklı biyolojik etkilere neden olabilir. Bu komplikasyon β-radyasyon için YTO yaydığı maruz düzenlenmesi üzerinde önemli tartışmalar sonuçlandı. Böylece, halk için içme suyu YTO düzenleyici düzeyleri Avrupa'da 100 Bq / L Avustralya'da 75,000 Bq / L arasında değişmektedir. Bu γ-radyasyon eşdeğer dozlara tibial osteotomi biyolojik etkilerini karşılaştırmak için, bu nedenle çok önemlidir. İkincisi, DNA DSB oranı immunofluorescently tespit γH2AX etiketli kullanarak kronik maruziyetin tamamlanmasıyla izole splenositlerde ölçülürflow sitometri tarafından ed. Bu in vivo maruz kalma açtığı DNA hasarının ölçüde değerlendirilmesini sağlamaktadır. Ancak, bu gibi düşük düzeyde maruz DNA DSB tespit edilebilir herhangi bir fiyat vermeyebilir beklemek mantıklıdır; Bunun yerine, bazı gizli değişiklikleri / yanıtları DNA hasarı onarmak için hücrelerin yeteneğini etkileyebilir ki beklenebilir. Bu değişiklikler bulursa, olabilir, ya uyarıcı (zararlı bir etki üreten) (faydalı bir etki oluşturarak) ya da inhibitör. önerilen protokol hasarı önemli miktarda üretir radyasyon yüksek bir doz ile ekstre splenositlerin zorlayarak bu tür değişiklikleri ortaya sağlar (örneğin, 2 Gy yaklaşık 50 hücre başına DNA DSB veya 3 üretilmesi -. Toplam γH2AX seviyesinde 5 kat artış) . Daha sonra, DSB onarım başlangıç ​​ve bitiş yansıtan oluşumu ve γH2AX kaybı, akış sitometrisi tarafından izlenir. Bu şekilde, taban ve DNA DSB tedavisi kaynaklı seviyeleri sadece ölçülen edilebilir, ancakAyrıca hücrelerin yeteneği üzerindeki potansiyel etkisi yanıt ve onarım DNA hasarı çok daha yüksek stres seviyeleri tarafından uyarılan.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm fare kullanımı ve tedavi prosedürleri, yerel hayvan bakım komitesi tarafından yasama ve / veya hayvan bakım programları tarafından belirlenen ve onaylanan kurallara uymalıdır. Bu protokol açıklanan tüm yöntemler, yerel hayvan bakım komitesi onayı ile Hayvan Bakımı Kanada Konseyi kurallarına uygun olarak yapıldı.

DİKKAT: radyoaktivite ile tüm çalışma (dahil, ancak radyoaktif hayvan dokuları, yatak atık taşıma, Trityum taşınması, dış γ-radyasyon sınırlı olmayan) Yasama ve / veya radyasyon koruma yetkilileri tarafından belirlenen kurallara uymak gerekir ve yetkili tarafından gerçekleştirilmelidir sertifikalı laboratuvar ve / veya tesis personel.

1. Hayvan Çalışması

  1. Hayvan gruplandırma
    1. Fareler, bir dış kuruluş gelen yapıyorsanız, hayvan barınağında en az 10 gün süreyle hayvan iklime alıştırmak. Çalışma birden fazla tedavi grupları içeriyorsa, hayvan tedarikçisi al gönderebilirsiniz sağlamaktek bir toplu iş olarak l hayvanlar.
    2. Rastgele grup başına 10 farelerden oluşan gelişigüzel tedavi gruplarına tahsis fareler. C57BL / 6 suşu erkek fareler kullanıyorsanız, saldırganlık sorunları azaltmak için kendi tesislerinde çok genç C57BL / 6 erkek rasgele ön düzenlemek hayvan tedarikçisi var.
  2. İç β-Radyasyon Fareler Kronik Maruz
    1. YTO ve OBT çözeltiler (toz haline getirilmiş olan prolin, alanin ve glisin amino asitler karışımı) orjinal stok seyreltilmesi ile bir fare, içme suyu içinde çalışan trityum konsantrasyonları (10 kBq / L ve 1 MBq / L) hazırlayın.
    2. Bir sıvı sintilasyon sayacı kullanılarak radyoaktivite ölçülerek, içme suyu içinde trityum nihai konsantrasyonlar doğrula. Gerekirse, konsantrasyonları ayarlayın.
    3. Trityum suya erişim ad libitum sağlayarak bir ay boyunca hayvanları davranın. Tedavi su, iki haftalık dönemde düşük alırsa, daha fazla su ekleyin. Aksi takdirde, iki hafta şişe değiştirin.
    4. Treat sahte-ışınlanmış kontrolfareler aynı. Ayrı bir "temiz" bir odada veya havadan trityum çapraz bulaşmayı önlemek için pozitif hava basıncı altında ayrı bir "temiz" raf tutun.
  3. Dış γ-Radyasyon Fareler Kronik Maruz
    Not: γ-ışınlama tesisi / ekipman konumuna bağlı olarak değişir.
  4. Dozimetri mevcut yöntemler kullanarak, istenilen doz oranlarını üreten radyasyon alanlarına sahip bir γ-radyasyon kaynağından mesafeleri belirler. Hayvan kafesleri kapsayan alanlarda radyasyon alanlarının homojenliği sağlamak.
    Not: 1.7 μGy / h 1 MBq / gövde L tritium ile üretilen bir doz hızı eşdeğerdir.
  5. Bir ay boyunca adım 1.3.1 belirlenen mesafelerde fare kafesleri koyarak fareler Açığa. 30 dakika γ-ışınlama günlük kesinti en aza indirin. Toplam absorbe doz ölçmek için termolüminesans dozimetreleri kullanın.

2. Kurbanlar ve Örnekleme

  1. Takılı 70 mikron hücre süzgeçler, 15 ml ve 1.5 ml tüpler ile steril cerrahi aletler, 60 mm petri kaplarına hazırlayın, hepsi bir biyolojik güvenlik kabini içinde% 5 fetal sığır serumu (FBS) ve yeri ile desteklenmiş RPMI medya. Işin sterilite sağlanması çok önemlidir.
  2. Her bir 60 mm Petri kabı içine RPMI ortam 5 ml koyun.
  3. Yerel hayvan bakım komitesi tarafından onaylanmış bir yöntem kullanılarak fareler Kurban. Servikal dislokasyon bu protokolü açıklanan splenosit çalışmaları için iyi bir seçimdir. (MFISH, sitokalasin bloğu mikronükleus ya da başka yaygın genetoxicity deneyleri için, örneğin), diğer deneyler için kan örnekleri gerekmektedir, ancak, izofluran ile anestezi sonrasında içi kardiyak ponksiyon kullanın.
  4. Baş sizden uzağa bakacak şekilde, sırt yatma hayvan yerleştirin. % 70 etanol ile fare aşağı püskürtün. Forseps kullanarak, üretral açılış anteriora cildi kapmak ve perine bölgesinde makas ile küçük bir kesi yapmak.
    1. Bu kesi itibaren, sadece altında kas duvarı cildi kesip değil dikkatli olmak, göğüs boşluğuna ventral orta hat boyunca kesilir. Orta hatta uzak cildi parçalara ayır.
    2. Forseps ile karın duvarı kavrayın ve karın boşluğunu açmak için kas duvarının medyan ekseni boyunca kesti.
  5. Hafifçe aynı anda makas ile bağ dokusu uzakta kesim sırasında üzerinde çekerek nazikçe steril forseps ile sürükleyici ve dalak tarafından tüketim.
  6. 1.5 ml tüp içinde dalak (dalak yaklaşık 1/10) ve yerine küçük bir parça kesin. Ek bileşen ilave deneyler için -80 ° C'de daha sonra depolama için sıvı azot içinde dondurularak.
  7. Önceden tevzi RPMI ortam 5 ml bir 60 mm Petri kabı içinde bir hücre süzgecinden içine dalak kalan yerleştirin.
  8. Bir sonraki fare devam edin.
    Not: Çıkarılan dalak medya ile 60 mm yemekleri tutulabilir farelerin kalan feda iken (en fazla 2 saat boyunca)ed. 5 ve 15 fareler arasında, katılan insan sayısına bağlı olarak, bir gün içinde işlenebilir.

Splenosit kültürleri 3. hazırlanması

  1. Kavisli ucu ile steril forseps ile bir hücre süzgeç içine kıyma ile dalak homojenleştirin.
  2. Hücre süzgecinden çıkarın ve 15 ml'lik bir tüp içine 60 mm çanak filtre hücre süspansiyonu toplanır.
  3. Hücrelerin geri kalanı toplamak için ortam 5 ml hücre süzgecinden durulayın.
  4. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj tüpleri.
  5. Boşaltın süpernatan ve RPMI, 10 ml pelet yeniden askıya.
  6. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj tüpleri.
  7. Boşaltın süpernatan ve RPMI, 5 ml tam içinde topağın tekrar askıya.
  8. 25 ml'lik bir doku kültürü şişesi içine Aktarım hücre süspansiyonu, 4 ml bir CO2 inkübatör kaldırma (37 ° C,% 5 CO2,% 80 nem)

4. Radyasyon Zorlu ve Sabitleme

  1. Transferi4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g buz ve santrifüj üzerinde 1.5 ml'lik bir tüp içine adım 3.8 hücre süspansiyonu 1 ml kalmıştır. Bu örnek ölçülen DNA hasarı, bir DNA onarım eğrisinin oluşturulması için, her iki tedavi kaynaklı hasar ve t = 0, veri noktasını temsil eder.
  2. Dikkatle bir vakum pompası kullanılarak süpernatant aspire. Yavaşça TBS tamponu (20 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCI, 2.7 mM KCI) 1 ml pelet yeniden askıya.
  3. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj tüpleri. Dikkatle bir vakum pompası kullanılarak süpernatant aspire. Yavaşça TBS 300 ul pelet yeniden askıya.
  4. Düşük hızda bir girdap ile karıştırılarak birlikte, -20 ° C,% 100 etanol içinde 700 ul ilave edin. Kapağı kapatın ve karıştırmak için birkaç kez ters çevirin.
  5. -20 ° C'de örnekleri saklayın. Etanol içinde sabit splenositler γH2AX sinyal içerisinde herhangi önemli bir kayıp olmadan en az 12 ay boyunca -20 ° C 'de muhafaza edilebilir.
  6. Zorlu bir γ-rad ile adım 3,8 splenosit kültürleri saçmak Mevcut ışınlama cihazı kullanarak bir doz hızı ≥ 200 mGy / dk 2 Gy iation dozu.
    Not: Bu ışınlama amacı tamir makineleri meydan DNA DSB ikna etmektir. X-ışınları, aynı zamanda bu amaç için kullanılabilir.
  7. Hemen bir CO 2 inkübatör kültürleri dönün.
  8. 1 saat zorlu 2 Gy radyasyon sonrası, biyolojik güvenlik kabini için inkübatör kültürleri kaldırın. Temsili bir numune kısım toplamak için, yavaşça buz üzerinde 1.5 ml tüp bir pipet ve hücre süspansiyonu transferi 1 ml kullanarak hücrelerin yeniden askıya. CO 2 inkübatör hücre kültürleri dönün.
  9. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj tüpleri. Dikkatle bir vakum pompası kullanılarak süpernatant aspire. Yavaşça TBS 1 ml pelet yeniden askıya.
  10. Tekrarlayın 4.3 adımları - 4.5.
  11. 24 saat zorlu 2 Gy γ-radyasyon, hasattan sonra ve adım 4.8 açıklandığı gibi 24 saat numunenin = at düzeltmek - 4.10.
tle "> 5. Anti-γH2AX Antikor ile Immunofluorescent Etiketleme

Not: Genellikle, 15 - 30 günlük örnekler immunofluorescently etiketlenmiş ve tek seferde akış sitometresi ile analiz edilebilir. Tedavi grupları arasında bir karşılaştırma sağlamak için her bir gruptan bir örnek (ler) içerir. Ayrıca daha detaylı bilgi için 16 referans bakın.

  1. Buz üzerinde etiketli numune sayısı için tüplerin seti işlenecek ve yer hazırlayın. 12 x 75 mm kapatılmamış cam tüpler kullanın. Sterilite, bu iş için gerekli değildir. ("2nd Ab sadece") Sadece ikincil antikor ile etiketleme için bir ek tarihsel kontrol örneği ekleyin. Bir çalışma içinde çalıştırmak sitometri her akışında bu tarihi kontrol örneği kullanın.
  2. Her tüpe buz soğukluğunda TBS 0.5 ml ilave edilir.
  3. 5 saniye süreyle -20 ° C'de, girdap gelen sabit splenositlerin çıkarın ve TBS ile hazırlanan borular için 0.5 ml'lik bir şişe aktarılır. -20 ° C depolama geri numunelerin kalanını yerleştirin veYedek örnek olarak tutun.
  4. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj splenositler. Süpernatant boşaltacaktır ve yavaşça% 1 FBS içeren buz gibi soğuk TBS içinde 1 ml pelet yeniden askıya
  5. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüje hücreleri. TST tamponunda (TBS içinde% 0.05 Triton X-100,% 2 FBS) 1 ml pelet yeniden askıya hafifçe süpernatant boşaltacaktır ve. Buz üzerinde 20 dakika süreyle inkübe edin.
  6. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüje hücreleri. Süpernatant boşaltacaktır ve yavaşça 1 seyreltilmiş birincil anti-γH2AX antikoru 200 ul pelet yeniden askıya: TCT tampon maddesi içinde 150. "2nd Ab sadece" kontrol numunesi için TDT 200 ul kullanın.
  7. 45 'lik bir açıda dönen bir çalkalayıcı üzerinde Pozisyon borular - 60 ° ve oda sıcaklığında 300 xg'de 1.5 saat çalkalanır.
  8. TCT tampon maddesi içinde 200 seyreltme: tüpler kuluçka iken, bir 1 Alexa-488 ile konjüge edilmiş keçi anti-fare ikincil antikoru yeterli bir hacmi (200 ul / numune) hazırlanması.
    Not: Alexa-488 içeren tüm çalışmakonjuge antikor (5.10 aşağıda 5.16 adımları) loş ışık koşullarında yapılmalı ve etiketli örnekler alüminyum folyo tüpler sararak ışıktan korunmalıdır.
  9. 1.5 saat inkübasyon işlemi tamamlandıktan sonra, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de Her bir tüp ve santrifüj% 2 FBS içeren buz gibi soğuk TBS içinde 1 ml. % 2 FBS içeren TBS içinde 1 ml pelet yeniden askıya hafifçe süpernatant boşaltacaktır ve.
  10. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. Aşama 5.8 ile ilgili ikincil antikor çözeltisinin 200 ul pelet yeniden askıya hafifçe süpernatant boşaltacaktır ve.
  11. Aşama 5.7 olarak 1 saat süre ile bir çalkalama platformu üzerinde inkübe edin.
  12. % 1 FBS içeren buz gibi soğuk TBS 1 ml ilave edilir.
  13. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. Süpernatant boşaltacaktır ve yavaşça buz soğukluğunda TBS içinde 1 ml pelet yeniden askıya.
  14. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. Süpernatant boşaltacaktır ve yavaşça 50 ug / ml ihtiva eden TBS içinde 0.5 ml pelet yeniden askıyapropidiyum iyodür.
  15. Işıktan korunan, oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir.
  16. Alet özgü protokoller 16 kullanarak bir akış sitometresinde örnekleri analiz edin. Numune başına en az 10.000 hücre okuyun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Splenosit için beklenen grafikler burada açıklanan yöntem kullanılarak hazırlandı sitometrisi Şekil 2, akış örneklerini göstermektedir. Hücreler ilk scatter plot dayalı kapılı (Şekil 2A ve 2B, elektronik hacim forward scatter eşdeğerdir). FL3 / propidyum iyot histogramlar (Şekil 2B ve 2E), normal hücre döngüsü dağılımı onaylayın. FL1 kanalı kullanılarak hesaplanır γH2AX sinyal ortalama tedavi edil...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu makalede sunulan protokol iyonize radyasyon dahil olmak üzere çeşitli kimyasal ve fiziksel ajanların düşük seviyelerde, genotoksik etkilerini inceleyen in vivo çalışmalar büyük ölçekli fare yürütülmesi için yararlıdır. Bizim eşsiz spesifik patojen içermeyen bir hayvan tesisi GammaBeam 150 ışınlayıcılar ile donatılmış ve 30 metre uzunluğundaki ışınlama salonu yüzlerce ya da farelerin hatta binlerce düşük ya da çok düşük doz oranı aydınlatılmasını kapsayan yaşam boyu çalışmalar yürütmektedir verir. Kronik düşü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, bilinen herhangi bir rakip finansal çıkar olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

Yazarlar, Radyokoruma ve Nükleer Güvenlik Enstitüsü'nden (Paris, Fransa) meslektaşlarımız Sandrine Roch-Lefevre ve Eric Gregoire'ın katkılarını kabul etmek ister. Bu çalışma, Kanada Nükleer Laboratuvarları (Chalk River, Ontario, Kanada), CANDU Sahipleri Grubu (Toronto, Ontario, Kanada), Kanada Nükleer Güvenlik Komisyonu ve Radyokoruma ve Nükleer Güvenlik Enstitüsü (Paris, Fransa) Kanada Hükümeti Bilim ve Teknoloji programı tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
HTO: tritiated su, [3H]yerel olarak bir nükleer reaktörden elde edilir stok aktivitesi 3.7 GBq/mL;  Perkin Elmer'den HTO ile ikame edilebilir
OBT: Alanin, L-[3-3H]: organik bağlı trityum (OBT)Perkin ElmerNET348005MC1 mCi/ml (185 MBq)
OBT: Glisin, [2-3H]: organik bağlı trityumPerkin ElmerNET004005MC1 mCi/ml (185 MBq)
OBT: Prolin, L-[2,3-3H]: organik olarak bağlı trityum (OBT)Perkin ElmerNET323005MC1 mCi/ml (185 MBq)
tritiye edilmiş su, [3H] (HTO)Perkin ElmerNET001B005MCyerel kaynaklı HTO'nun ikamesi   
Yerel olarak üretilenGammaBeam 150 ışınlayıcıKanada Limited Atom Enerjisi, yeterince düşük aktiviteye sahip başka bir g-radyasyon kaynağı ile ikame edilebilir 
Tween-20Sigma AldrichP1379-500ML
RPMIFisher ScientificSH3025501L-Glutamin ve HEPES ile Hyclone RPMI 1640 500mL
fetal sığır serumuSigma AldrichF1051-100ML
anti-gH2AX antikoru, klon JBW301Millipore05-636
Alexa fluor-488 keçi anti-fare antikoruLife Technologies (eski adıyla Invitrogen)A21121
propidyum iyotSigma AldrichP4864-10ML1 mg/ml
etanolTicari AlkollerP006-EAAN500 ml şişeler Mutlak Etanol
1.5 ml tüplerFisher Scientific2682550mikrosantrifüj tüpleri
15 ml tüplerFisher Scientific05-539-5steril polipropilen santrifüj tüpleri
sıvı nitrojenLindeP110403
12 x 75 mm kapaksız cam tüplerFisher ScientificK60B1496126düz uçlu tek kullanımlık borosilikat cam tüpler
T25 şişeleriVWRCA15708-120nunc tisue kültürü 25ml şişe (tedarikçi no. 156340)
makasGüzel Bilim Araçları14068-12Wagner makas 12 cm keskin/keskin
forseps, düzGüzel Bilim Aletleri11008-13Semken forseps 13 cm, düz forseps
, kavisliGüzel Bilim Aletleri11003-12Dar Model forseps 12 cm, kavisli
60 mm petri kaplarıVWRCA25382-100BD Falcon doku kültürü kabı 60 x 15 mm
hücre süzgeçleri, 70 mmFisher Scientific08-771-2Falcon hücre süzgeçleri 50/kutu
PBS tarifi: 200 ml deiyonize suda çözülmüş 1 tablet, gerekirse pH'ı 7.4'e ayarlayın.Sigma AldrichP4417-100TABFosfat Tamponlu Tuzlu Tabletler
TBS tarifi: 10x stok
30 g TRIS HClSigma AldrichT3253-1KGTrizma hidroklorür
88 g NaClFisher ScientificS271-500Sodyum Klorür
2 g KClFisher ScientificP217-500Potasyum Klorür
1 L deiyonize suda çözün, pH'ı 7.4'e
yapmak için ayarlayın

Kaynaklar

  1. Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice. Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).
  2. Shadley, J. D. Chromosomal adaptive response in human lymphocytes. Radiat Res. 138 (Suppl 1), S9-12 (1994).
  3. Wiencke, J. K., Afzal, V., Olivieri, G., Wolff, S. Evidence that the [3H]thymidine-induced adaptive response of human lymphocytes to subsequent doses of X-rays involves the induction of a chromosomal repair mechanism). Mutagenesis. 1 (5), 375-380 (1986).
  4. Mitchel, R. E. The dose window for radiation-induced protective adaptive responses. Dose-Response. 8 (2), 192-208 (2010).
  5. Tubiana, M., Feinendegen, L. E., Yang, C., Kaminski, J. M. The linear no-threshold relationship is inconsistent with radiation biologic and experimental data. Radiology. 251 (1), 13-22 (2009).
  6. Gent, D. C., Hoeijmakers, J. H., Kanaar, R. Chromosomal stability and the DNA double-stranded break connection. Nat Rev Genet. 2 (3), 196-206 (2001).
  7. Jackson, S. P. Sensing and repairing DNA double-strand breaks. Carcinogenesis. 23 (5), 687-696 (2002).
  8. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  9. Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J Cell Biol. 151 (7), 1381-1390 (2000).
  10. Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).
  11. Sedelnikova, O. A., Rogakou, E. P., Panyutin, I. G., Bonner, W. M. Quantitative detection of (125)IdU-induced DNA double-strand breaks with gamma-H2AX antibody. Radiat Res. 158 (4), 486-492 (2002).
  12. Yuan, J., Adamski, R., Chen, J. Focus on histone variant H2AX: to be or not to be. FEBS Lett. 584 (17), 3717-3724 (2010).
  13. Taneja, N., et al. Histone H2AX phosphorylation as a predictor of radiosensitivity and target for radiotherapy. J Biol Chem. 279 (3), 2273-2280 (2004).
  14. Olive, P. L., Banath, J. P., Sinnott, L. T. Phosphorylated histone H2AX in spheroids, tumors, and tissues of mice exposed to etoposide and 3-amino-1,2,4-benzotriazine-1,3-dioxide. Cancer Res. 64 (15), 5363-5369 (2004).
  15. Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4(2010).
  16. Blimkie, M. S., Fung, L. C., Petoukhov, E. S., Girard, C., Klokov, D. Repair of DNA double-strand breaks is not modulated by low-dose gamma radiation in C57BL/6J mice. Radiat Res. 1815 (5), 548-559 (2014).
  17. Runge, R., et al. Fully automated interpretation of ionizing radiation-induced gammaH2AX foci by the novel pattern recognition system AKLIDES(R). Int J Radiat Biol. 88 (5), 439-447 (2012).
  18. Jucha, A., et al. FociCounter: A freely available PC programme for quantitative and qualitative analysis of gamma-H2AX foci. Mutat Res. 696 (1), 16-20 (2010).
  19. Garty, G., et al. The RABIT: a rapid automated biodosimetry tool for radiological triage. Health Phys. 98 (2), 209-217 (2010).
  20. Kovalchuk, I. P., et al. Age-dependent changes in DNA repair in radiation-exposed mice. Radiat Res. 182 (6), 683-694 (2014).
  21. Rube, C. E., et al. DNA repair in the context of chromatin: new molecular insights by the nanoscale detection of DNA repair complexes using transmission electron microscopy. DNA Repair. 10 (4), 427-437 (2011).
  22. Amundson, S. A., Do, K. T., Fornace, A. J. Induction of stress genes by low doses of gamma rays. Radiat Res. 152 (3), 225-231 (1999).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

DNA Hasarı OnarımıAkış SitometrisiGamma H2AXDüşük Doz RadyasyonÇift Zincir KırıklarıRadyasyon Maruziyetiİmmünofloresan EtiketlemeHücre İzolasyonu
Kronik sonra fare dalak DNA hasar ve Onarım Ölçme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.