Yöntem makalesi

Embriyonik Meckel Kıkırdak içinde Zebrabow klonal Hücre Analizi aracılığıyla Kondrosit interkalasyonu ve Yön Yayılması Görselleştirme

DOI:

10.3791/52935

⸱

21 Ekim 2015

 ,  ,  , 
1Massachusetts General Hospital, Center for Regenerative Medicine, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kraniyofasiyal kemiklerin Hücre organizasyonu uzun öne sürülmüştür ancak doğrudan görüntülenmiştir olmamıştı. Çok spektral hücre etiketleme ve in vivo canlı olarak Görüntüleme Zebra balığı alt çene dinamik hücre davranışı görselleştirme sağlar. Burada, biz detay protokolü Zebrabow transgenik balık işlemek için doğrudan hücre ardalanması ve Meckel kıkırdak kondrosit morfolojik değişiklikleri gözlemek.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Omurgalı kraniofasial yapıların geliştirilmesi hücre göçü, çoğalması, yapışma ve farklılaşma hassas koordinasyon gerektirir. Meckel kıkırdağı, birinci farengeal kemer türevinin, bir Desenlendirme kranial nöral krest (CNC) hücrelerin göçünü ve ilerici bölümleme, çoğalmasını ve farklılaştırılmış kondrositlerin organizasyonunu gerektirir. Çeşitli çalışmalar alt çene morfolojilerinden sırasında CNC göç tarif, ama kondrositler Meckel kıkırdak büyümesi ve uzantısı organizasyonu gerçekleştirmek nasıl ayrıntıları belirsizliğini korumaktadır. Sox10 kısıtlı ve kimyasal olarak neden olunan Cre rekombinaz aracılı rekombinasyon ve böylece ayrı bir klonal popülasyonları yansıtan progenitör hücrelerin ve bunların soyu bir multi-spektral etiketleme oluşturma farklı floresan protein (RFP, YFP ve CFP) PERMÜTASYON oluşturur. Konfokal zaman atlamalı fotoğraf kullanarak, kıkırdak gözlemlemek mümkündür Behaviya Zebra balığı Meckel kıkırdak gelişimi sırasında.

Çok bantlı cep etiketleme Meckel kondrosit uzantısı göstermek için bilim adamları sağlar. Çene prefigures Meckel kıkırdağı, uzatma aşamasında, kondrositlere onlar organize bir tek hücreli katmanlı satırda yığını olarak uzantısı etkileyecek enterkale. Hücre uzantısı aracılık etmek, bu örgütlü interkalasyon sürecinin başarısızlığı biz çene malformasyonlar gözlemlediğimiz hipoplastik mandibula için hücresel mekanistik açıklama sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kraniyofasiyal gelişme hücre çoğalması, göç ve farklılaşma 1,2, 3 sürücü karmaşık moleküler, hücresel ve doku etkileşimleri gerektirir. Bu sıkı regüle ve karmaşık bir süreç kraniofasial deformiteler en yaygın doğum anomalileri 1-9 arasında olacak şekilde genetik ve çevresel pertürbasyonlar tabidir. Cerrahi girişimler geliştirme temelini anlamak, kraniofasyal anomaliler için tedavinin temelini kalırken gelecek tedaviler yenilik şarttır. Bu nedenle, yakınsama ve uzatma ve hücre entegrasyonu morfolojilerinden ve mekanizmaları okuyan kraniofasyal iskeletin 1 oluşumuna yepyeni bakış açıları sağlar.

Kranial nöra....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Massachusetts General Hospital Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) protokol numarası # 2010N000106 altındaki tüm prosedürleri onayladı. Bu değerlendirme ve laboratuvar Animal Care International (AAALAC) rehberlerin Akreditasyon Derneği ile uyumludur.

1. Reaktifler ve Malzeme Hazırlanması

  1. 50X E3 embriyo orta 1 L hazırlayın (Tablo 2 bakınız) (Bakınız Tablo 1) ve 1X E3 embriyo orta 1 L hazırlar.
  2. 1X E3 1 L propiltiyourasil'i 30 mg ekleyerek N-feniltiyoüre (PTU) E3 embriyo orta hazırlayın. Karıştırma O / N PTU tamamen çözülene sağlamak. Oda sıcaklığında saklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bütün montaj Alsiyan mavi lekeler Geleneksel kıkırdak görselleştirme gelişmekte Meckel kıkırdağı gözlemleyerek ve yaygın olarak nihai hücresel organizasyonu 12 (Şekil 1A) görselleştirmek için kullanılan çok değerli olmuştur. Ayrıca soy sox10 kullanarak izleme, fazla mesai gelişen kıkırdak analiz etmek için: Kaede transgenik çizgiler, canlı embriyolar 2,12 (Şekil 1B) hücre göçü, yakınsama ve uzatma çalışma sağladı. Ancak, kraniofasyal iskelet yapıs.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıdaki birbirini tamamlar açıklandığı gibi alcian mavi ve photoconvertible transgenik hatları kıkırdak ve kemik gelişimi karmaşık sürecini tanımlamak için kullanılır. Ancak, organogenezis sırasında canlı hücre göç ve organizasyon uzun hipotez ve dolaylı olarak gösterdi ama görüntülenmiştir asla edilmiştir. Bir kıkırdak Belirli Cre ile birleştiğinde Zebrabow-M transgen doğru, kemik ve kıkırdak oluşumunda yer, tüm bu olayların eş zamanlı canlı gözlem izin verir. Bu teknik mikrognati açıklanan belirgin özelliklerinden .......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar nazik balık imkan ve çizgilerin mükemmel bakım için Zebrabow-M transgenik çizgi, pDEST vektör için Geoffrey Burns ve Renee Ethier-Daigle paylaştığınız için Alex Schier teşekkür ederiz.

FİNANSMAN:

Biz Çocuklar için Shriners Hastaneleri Çocukları (ECL) ve post-doktora eğitimi bursları için NIDCR RO3DE024490 ve Shriners Hastaneleri cömert fonlama desteği (LR ve YK) için minnettarız.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
PronaseRoche Yaşam Bilimleri10165921001500 &mu hazırlayın; l 50 mg / ml'de stok alikotları
MetilselülozSigma-AldrichM0262
PTU (N-Feniltiüre)Sigma-AldrichP7619
TrikainSigma-AldrichE10521
4-HidroksiTamoksifenSigma-AldrichT176
24 x 60 lamelFisher Scientific12-548-5P
18 x 18 lamelFisher Scientific12-540A
25 x 25 lamelFisher Scientific12-540C
pENTR5'-TOPO TA Klonlama KitiYaşam teknolojileri K591-20
pENTR/D-TOPO Klonlama Kiti Yaşam TeknolojileriK2400-20
pENTR3'-pATol2Kit302
pDESTGeoffrey Burns laboratuvarlarından
hediye Parlak alan mikroskobu 
Floresan mikroskobu 
Konfokal mikroskop
Görüntü işleme yazılımı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dougherty, M., et al. Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis. Development. 140, 76-81 (2013).
  2. Dougherty, M., et al.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Zebrabow Clonal AnalysisChondrocyte IntercalationMeckel s CartilageConfocal Time LapseSOX10 ERT2 CreTamoxifen InductionCranial Neural CrestMultispectral LabelingClonal Cell AnalysisZebrafish Embryos

İlgili makaleler