Yöntem makalesi

Embriyonik Meckel Kıkırdak içinde Zebrabow klonal Hücre Analizi aracılığıyla Kondrosit interkalasyonu ve Yön Yayılması Görselleştirme

DOI:

10.3791/52935

⸱

21 Ekim 2015

 ,  ,  , 
1Massachusetts General Hospital, Center for Regenerative Medicine, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kraniyofasiyal kemiklerin Hücre organizasyonu uzun öne sürülmüştür ancak doğrudan görüntülenmiştir olmamıştı. Çok spektral hücre etiketleme ve in vivo canlı olarak Görüntüleme Zebra balığı alt çene dinamik hücre davranışı görselleştirme sağlar. Burada, biz detay protokolü Zebrabow transgenik balık işlemek için doğrudan hücre ardalanması ve Meckel kıkırdak kondrosit morfolojik değişiklikleri gözlemek.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Omurgalı kraniofasial yapıların geliştirilmesi hücre göçü, çoğalması, yapışma ve farklılaşma hassas koordinasyon gerektirir. Meckel kıkırdağı, birinci farengeal kemer türevinin, bir Desenlendirme kranial nöral krest (CNC) hücrelerin göçünü ve ilerici bölümleme, çoğalmasını ve farklılaştırılmış kondrositlerin organizasyonunu gerektirir. Çeşitli çalışmalar alt çene morfolojilerinden sırasında CNC göç tarif, ama kondrositler Meckel kıkırdak büyümesi ve uzantısı organizasyonu gerçekleştirmek nasıl ayrıntıları belirsizliğini korumaktadır. Sox10 kısıtlı ve kimyasal olarak neden olunan Cre rekombinaz aracılı rekombinasyon ve böylece ayrı bir klonal popülasyonları yansıtan progenitör hücrelerin ve bunların soyu bir multi-spektral etiketleme oluşturma farklı floresan protein (RFP, YFP ve CFP) PERMÜTASYON oluşturur. Konfokal zaman atlamalı fotoğraf kullanarak, kıkırdak gözlemlemek mümkündür Behaviya Zebra balığı Meckel kıkırdak gelişimi sırasında.

Çok bantlı cep etiketleme Meckel kondrosit uzantısı göstermek için bilim adamları sağlar. Çene prefigures Meckel kıkırdağı, uzatma aşamasında, kondrositlere onlar organize bir tek hücreli katmanlı satırda yığını olarak uzantısı etkileyecek enterkale. Hücre uzantısı aracılık etmek, bu örgütlü interkalasyon sürecinin başarısızlığı biz çene malformasyonlar gözlemlediğimiz hipoplastik mandibula için hücresel mekanistik açıklama sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kraniyofasiyal gelişme hücre çoğalması, göç ve farklılaşma 1,2, 3 sürücü karmaşık moleküler, hücresel ve doku etkileşimleri gerektirir. Bu sıkı regüle ve karmaşık bir süreç kraniofasial deformiteler en yaygın doğum anomalileri 1-9 arasında olacak şekilde genetik ve çevresel pertürbasyonlar tabidir. Cerrahi girişimler geliştirme temelini anlamak, kraniofasyal anomaliler için tedavinin temelini kalırken gelecek tedaviler yenilik şarttır. Bu nedenle, yakınsama ve uzatma ve hücre entegrasyonu morfolojilerinden ve mekanizmaları okuyan kraniofasyal iskeletin 1 oluşumuna yepyeni bakış açıları sağlar.

Kranial nöral krest geçirmek ve birinci faringeal kemer çene prefigures Meckel kıkırdağı, oluşturmak için uzatmak, daha sonra eşleştirilmiş formu mandibular süreçler doldurmak. Morphogenesis oMeckel kıkırdağı f yönlü çoğalması, hücre kutuplaşma ve farklılaşma 1,10 üzerinden kondrosit organizasyon gerektirmektedir. Ancak, Meckel kıkırdak büyümesi ve uzantısı kondrosit örgütünün karışıklık belirsizliğini koruyor. Dinamik hücre davranışını anlamak gibi hipoplastik mandibula fenotipleri 11 olarak çene boyutu, etkileyen konjenital anomali anlamak için çok önemlidir.

Zebra balığı embriyolar Meckel kıkırdağı morfolojilerinden ayrıntılı çalışma için birçok gelişimsel ve genetik avantajlar sunuyoruz. Onların genetik tractability, şeffaflık, ex vivo ve hızlı bir gelişme canlı görüntüleme 6 hücre hareketi ve organizasyon gözlem için iyi kredi güçlü avantajları vardır. Böyle sox10 olarak soy-tracing araçları kullanarak: kaede transgenik çizgi, biz ve diğerleri embriyonik kraniofasyal iskeletin 1,5 nöral krest kökenlerini tasvir var. Usiubi ile ERT2-Cre: sox10 ng Zebrabow-M transgenik hat, bu Kraniofasiyal gelişimi sırasında hücresel hareketlerin ayrıntılarını keşfetmek için artık mümkün. Zebrabow-M, farklı flüoroforlar ifadesini süren ubikuitin promotörü, Lox sitelerinin 8 tarafından sınırlanan her biri ile tasarlanmış bir transgenik bir çizgidir. Zebrabow-M varsayılan fluorofor RFP ifade Kırmızı. Cre ifade indüksiyon sonrasında Zebrabow-M birleşir inşa ve hücreler embriyo çoklu spektral ifade oluşturarak farklı fluorophores (RFP, OBP ve YFP) birleşimini ifade eder. Farklı yan yana atalarıdır kaynaklandığını hücre popülasyonları klonal etiketli böylece rekombinasyon olaydan sonra etiketli hücrelerden bölmek Tüm kızı hücreleri daha sonra klonal, etiketli. Bu klonlama hücre etiketleme ile klonal çözünürlüğe sahip hücre proliferasyon ve migrasyon (Şekil 1 ve 2) takip edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Massachusetts General Hospital Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) protokol numarası # 2010N000106 altındaki tüm prosedürleri onayladı. Bu değerlendirme ve laboratuvar Animal Care International (AAALAC) rehberlerin Akreditasyon Derneği ile uyumludur.

1. Reaktifler ve Malzeme Hazırlanması

  1. 50X E3 embriyo orta 1 L hazırlayın (Tablo 2 bakınız) (Bakınız Tablo 1) ve 1X E3 embriyo orta 1 L hazırlar.
  2. 1X E3 1 L propiltiyourasil'i 30 mg ekleyerek N-feniltiyoüre (PTU) E3 embriyo orta hazırlayın. Karıştırma O / N PTU tamamen çözülene sağlamak. Oda sıcaklığında saklayın.
  3. , Pronaz çözelti hazırlamak 1X E3 15 ml Pronaz (0,5 mg / ml) 150 ul sulandırmak için. Bu miktar 1 petri için yeterlidir. Hemen kullanın.
  4. Metilselüloz çözeltisi hazırlayın.
    1. 25 ml% 0.2 tricaine 75 ml karıştırılarak E3-tricaine çözeltisi hazırlayın1X E3. E3-tricaine çözeltisi 75 ml metilselüloz, 3 g kaynatılır.
    2. E3-tricaine çözeltisi ile 100 ml nihai hacme tamamlanır. Nihai metilselüloz çözüm sarımsı bir renk tonu ile viskoz ve opak olduğunu. Depolama: RT ışıktan korunmalıdır.
  5. Tamoksifen stok ve indüksiyon çözümü
    1. 4-OH,% 100 etanol içinde eritilmesi ile 5 mm tamoksifen stok çözelti hazırlayın. -80 ° C'de saklayın stoku.
    2. Indüksiyon çözüm elde etmek 1X E3 arzu konsantrasyonunda tamoksifen taze seyreltme hazırlayın. DİKKAT! Kullanmadan önce MSDS'ye danışın.
  6. Tablo 3 uyarınca% 0.2 tricaine 1 L hazırlayın.
  7. Konfokal slaytlar edinin. Bir blok oluşturmak için bir araya dört coverglass (18 x 18) Tutkal sonra ortada embriyonun montaj izin 2 cm arayla 24 x 60 coverglass 2 blok yerleştirin.

2. Embriyo Hazırlık

  1. Transjenik hatlar.
    Not: Zebrabow-M Alex Schier laboratuarından gelen cömert bir hediye oldu.
  2. sox10: ERT2-Cre
    NOT: Standart moleküler klonlama yöntemleri kullanılarak ERT2-Cre ve ticari teknoloji klonlama rekombinasyon elde: hedefleme vektör pDestTol2- sox10 oluşturun.
    1. Lens hedef bir LR reaksiyonunda giriş klonu (pENTR3'-poliA) birleştirin 5 'sox10 promotörünün 7.2Kb, bir ağ geçidi, orta clone (pME-ERT2-Cre) ve 3 ihtiva eden giriş klonu (pENTR5'- sox10p)' Vektör pDestTol2- α-kristalin: YFP.
    2. Yapı arındırın pDestTol2- sox10: ERT2-Cre. Bir hücre aşamasında embriyoların WT (F0) içerisine Tol2 transposaz mRNA (50 ng / ul) ile arıtılmış, yapı (100 ng / | il), Co-enjekte edilir.
    3. Germ-line iletimi için ekran F0 yetişkin kurucuları F1 embriyolar güçlü sarı floresan dayalı.
  3. sox10: ERT2-Cre, Zebrabow-M
    1. Zebrabow-M outcrossERT2-Cre transgenik hat: sox10 hattı (2.1.1).
    2. Güçlü bir yerde RFP ifade ve YFP objektif işaretleyici ve yetişkinler kadar onları büyümeye sergileyen seçin embriyolar.

3. Embriyo Koleksiyon

  1. Sox10 birkaç çift ayarlayın: ERT2-Cre, Zebrabow-M transgenik zebrafish 5 pm ve Gün 1 6 saatleri arasında.
  2. Ertesi gün, sabah bölücüler çekin ve öğlen yumurta toplamak.
  3. Petri ve embriyoların dechorionate için Pronase çözeltisi 15 ml ekleyin aktarabilirsiniz.
  4. Embriyoların yaklaşık% 60'ı dechorionated edilene kadar 1 ila 5 dakika için embriyolar inkübe edin. Pronase çözümü süzülerek reaksiyonu durdurmak ve taze E3 orta embriyolar 3-4 kez yıkayın.
  5. RT O / N at E3 içinde dechorionated embriyolar inkübe ve onları 10 Somitlerin aşamaya ulaşmak için geliştirmek sağlar. Farklı gelişim büyümeyi önlemek için debriyaj başına 50-60 embriyolar kuluçkaya yatmaktadır.

4. Tedavi

  1. Onlar 10 Somitlerin aşamada sağlamak için bir ışık alan mikroskobu altında embriyo gelişim aşamasını kontrol edin.
  2. Kırmızı floresan proteini (RFP) filtresi ile bir floresan mikroskop kullanılarak, parlak kırmızı embriyolar izole.
  3. Petri hidroksitamoksifen çözeltisi 10 uM ekleme ve 3 saat için 28,5 ° C 'de izole edilmiş embriyolar inkübe edilerek Cre rekombinasyon indüksiyonu geçin.
  4. Tamoksifen çözüm Durusu ve E3 embriyolar birkaç kez yıkayın.
    DİKKAT! Özel bir biyolojik atık kapta tamoksifen çözüm atın.
  5. 28.5 ° CO / N embriyolar kuluçkaya yatmaktadır.
  6. Embriyolar yaklaşık 28-29 Somitlerin aşaması (24 saat civarında sonrası fertilizasyon) olduğunda, E3-PTU çözümü ahirette 28.5 ° C embriyolar kuluçkaya yatmaktadır.
    Not: PTU burada geliştirme embriyolar melanophores oluşumunu inhibe etmek için kullanılabilir. Bu tedavi için gerekli olanOtomatik floresan melanophores tarafından floresan sinyal bozulmasını önlemek.
  7. 28.5 ° C embriyolar inkübe

5. Embriyo Seçimi

  1. Tam gelişmiş kraniofasyal yapıları görselleştirmek için, Kırmızı sinyal ve Cre ifade işaretleyici pozitifliği (retinada sarı) yoğunluğu için 4 gün sonra döllenme embriyolar seçin.
  2. E3 /% 0.015 tricaine çözeltisi ile embriyolar anestezisi. Yavaşça embriyo prodding zaman aktif hareketler veya fin aktivite gözlenir zaman Anestezi onaylanır.

6. metilselüloz içinde Embriyo Montaj

  1. Metilselüloz bir damla içeren bir petri kabı içine görüntüleme için seçilen embriyo transferi ve yavaşça metilselüloz ile embriyo mumyalamak.
  2. Temiz bir konfokal slayt, taze metilselülozun bir damla koyun ve bir Microloader ucunu kullanarak damla içinde embriyo monte edin. Pozisyon embriyo dorsal dokunmamaya dikkat çekicidoğrudan embriyo.
  3. 25 x 25 lamel monte embriyo Kapak ve gerekirse lamel manipüle ederek embriyonun konumunu ayarlamak.
  4. Embriyo artık görüntüye hazırdır.

Floresan Mikroskopi 7. Analiz

  1. Embriyo odaklama için, 20x kuru lens objektif (iğne deliği boyutu 2.0 mikron sayısal açıklık 0.75) kullanın.
  2. Mikroskop L100 düğmesine basın ve yazılım kanalları seçin.
  3. Konfokal kurulum düğmesini seçin ve 'auto' tıklayın ve pencereyi kapatmadan önce aşağıdaki kanalları seçmek: Ch1: CFP, Ch2: GFP, CH3: RFP veya mCherry
  4. 'Kilidini kaldırmak' düğmesini tıklamadan önce CH2 ve CH3 açın. Taramaya başlamak için 'oyun' tıklayın.
  5. İstenen görüntü kalitesi ac kadar iyi ½ çerçeve / sn ve yüksek gerilim (YG) 150 ile başlayan ve daha sonra buna göre ayarlarını ayarlayarak yapılır ilgi yapısı, odaklanınhieved. RFP nedenle YG ayarlamak diğer renkler daha parlak olacaktır. YFP ve RFP pozitif hücreler hem bulmak için Z konumunu değiştirin.
  6. Ayarlarıyla sonra, embriyonun görüntüyü yakalamak. Her bölünmüş kanalda görüntü işleme konfokal görüntüleme yazılımı formatı ve TIFF formatında resminizi kaydedin.
  7. Daha sonra, CFP görüntüleme için, CH2 ve CH3 kapatıp Ch1 açın. Odak alanını değiştirmeden 5. adımda olduğu gibi ayarları yeniden ayarlayın.
    NOT: OBP nedeniyle iğne deliği boyutunu ayarlayarak atlatılabilir mavi kanalda arka sinyaline tespit etmek çok zor olabilir. Daha büyük bir iğne deliği boyut sinyali / arka plan gürültü oranını azaltarak floresan iyi algılama izin verir. Ancak, büyük iğne deliği görüntü kalitesinden ödün, konfokal etkisini azaltacaktır. Bu nedenle, ayarlar dikkatli ayarlanması istenen görüntü kalitesini ve yoğunluğunu elde etmek için gereklidir.
  8. Görüntü yakalamak ve (her ikisi de formatta konfokal yazılım ve T kaydetmekGörüntü işleme için IFF). Görüntüler daha sonra katmanları birleştirme ve Pan ve 8 arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi renk ayarlarını iyileştirmek için ortak görüntü işleme yazılımı kullanılarak işlenebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bütün montaj Alsiyan mavi lekeler Geleneksel kıkırdak görselleştirme gelişmekte Meckel kıkırdağı gözlemleyerek ve yaygın olarak nihai hücresel organizasyonu 12 (Şekil 1A) görselleştirmek için kullanılan çok değerli olmuştur. Ayrıca soy sox10 kullanarak izleme, fazla mesai gelişen kıkırdak analiz etmek için: Kaede transgenik çizgiler, canlı embriyolar 2,12 (Şekil 1B) hücre göçü, yakınsama ve uzatma çalışma sağladı. Ancak, kraniofasyal iskelet yapıs...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıdaki birbirini tamamlar açıklandığı gibi alcian mavi ve photoconvertible transgenik hatları kıkırdak ve kemik gelişimi karmaşık sürecini tanımlamak için kullanılır. Ancak, organogenezis sırasında canlı hücre göç ve organizasyon uzun hipotez ve dolaylı olarak gösterdi ama görüntülenmiştir asla edilmiştir. Bir kıkırdak Belirli Cre ile birleştiğinde Zebrabow-M transgen doğru, kemik ve kıkırdak oluşumunda yer, tüm bu olayların eş zamanlı canlı gözlem izin verir. Bu teknik mikrognati açıklanan belirgin özelliklerinden ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar nazik balık imkan ve çizgilerin mükemmel bakım için Zebrabow-M transgenik çizgi, pDEST vektör için Geoffrey Burns ve Renee Ethier-Daigle paylaştığınız için Alex Schier teşekkür ederiz.

FİNANSMAN:

Biz Çocuklar için Shriners Hastaneleri Çocukları (ECL) ve post-doktora eğitimi bursları için NIDCR RO3DE024490 ve Shriners Hastaneleri cömert fonlama desteği (LR ve YK) için minnettarız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
PronaseRoche Yaşam Bilimleri10165921001500 &mu hazırlayın; l 50 mg / ml'de stok alikotları
MetilselülozSigma-AldrichM0262
PTU (N-Feniltiüre)Sigma-AldrichP7619
TrikainSigma-AldrichE10521
4-HidroksiTamoksifenSigma-AldrichT176
24 x 60 lamelFisher Scientific12-548-5P
18 x 18 lamelFisher Scientific12-540A
25 x 25 lamelFisher Scientific12-540C
pENTR5'-TOPO TA Klonlama KitiYaşam teknolojileri K591-20
pENTR/D-TOPO Klonlama Kiti Yaşam TeknolojileriK2400-20
pENTR3'-pATol2Kit302
pDESTGeoffrey Burns laboratuvarlarından
hediye Parlak alan mikroskobu 
Floresan mikroskobu 
Konfokal mikroskop
Görüntü işleme yazılımı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dougherty, M., et al. Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis. Development. 140, 76-81 (2013).
  2. Dougherty, M., et al. Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model. The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).
  3. Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
  4. Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).
  5. Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525(2013).
  6. McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research. Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).
  7. Mossey, P. Dental education and CPD: are you being served. British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).
  8. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  9. Vieira, A. R. Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).
  10. Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development. PLoS genetics. 10, e1004726(2014).
  11. Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence. Teratology. 65, 116-120 (2002).
  12. Javidan, Y., Schilling, T. F. Development of cartilage and bone. Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).
  13. McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140, 3254-3265 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Zebrabow Clonal AnalysisChondrocyte IntercalationMeckel s CartilageConfocal Time LapseSOX10 ERT2 CreTamoxifen InductionCranial Neural CrestMultispectral LabelingClonal Cell AnalysisZebrafish Embryos

İlgili makaleler