Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Patch Kelepçe ve Canlı Floresan Mikroskobu uygulanması Taze İzole PKD Epitelinin Fonksiyonel Properties Monitör

9.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53035

⸱

1 Eylül 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 2Department of Integrative Biology & Pharmacology, University of Texas Health Science Center at Houston

Bu makalede

Özet

Renal tübüler epitel ifade iyon kanalları polikistik böbrek hastalığı patolojisinde önemli bir rol oynamaktadır. Burada taze kemirgen böbrekler izole kistik epitel patch-kelepçe analizi ve hücre içi kalsiyum seviyesi ölçümleri gerçekleştirmek için kullanılan deneysel protokolleri açıklayın.

Özet

Polikistik böbrek hastalığı sırasında Kist başlatma ve genişletme tübüler hücre çoğalması, lümen sıvı birikimi ve hücre dışı matriks oluşumu anormallikleri ile karakterize karmaşık bir süreçtir. Iyon kanalları ve hücre içi kalsiyum sinyalizasyon aktivitesi tübüler epitelyum işlevlerini belirleyen temel fizyolojik parametrelerdir. Biz taze böbrek kistleri izole epitel mono tabakaları hücre içi Ca 2 + düzeyinin patch-kelepçe tekniği ve kayıt iyon kanalları aktivitenin gerçek zamanlı gözlem için uygun bir yöntem geliştirdi. PCK sıçan, otozomal resesif polikistik böbrek hastalığı (polikistik böbrek hastalığı) genetik bir modelidir, iyon kanalları ve kalsiyum akışının ex vivo analiz için kullanılmıştır. Burada anlatılan tek kanal aktivitesini ve hücre içi Ca + 2 dinamiklerini kistik mono tabakaları ve PCK veya normal Sprague Dawley (SD) sıçanların olmayan dilate tübüller izole ve izlemek için tasarlanmıştır ayrıntılı bir adım-adım bir yöntemdir.Bu yöntem, enzimatik işleme gerektiren ve taze izole epitel Tek tabakalı bir yerli ortamda analiz izin vermez. Ayrıca, bu teknik, hücre içi kalsiyum değişikliklere çok duyarlı olduğu ve hassas ölçümler için yüksek çözünürlüklü görüntüler üretir. Son olarak, izole edilmiş bir kistik epitel Antikorların ya da boyalar, çeşitli biyokimyasal deneyler için birincil kültürleri hazırlanması ve saflaştırılması ile lekeleme için kullanılabilir.

Giriş

İyon kanalları, hücre büyümesi ve farklılaşması dahil olmak üzere bir çok fizyolojik işlevler, önemli bir rol oynamaktadır. Otozomal dominant ve resesif polikistik böbrek hastalığı (sırasıyla ADPKD ve ORPBH) tübüler epitel hücre kökenli böbrek sıvı dolu kistlerin gelişimi ile karakterize genetik bozukluklardır. Polikistik böbrek polycystins 1 ve hücre proliferasyonu ve farklılaşmasının düzenlenmesinde rol oynayan 2, zar proteinlerini kodlayan PKD1 ya PKD2 genlerin mutasyonu neden olmaktadır. Kendi başına veya PKD1 ile bir kompleks olarak PKD2 da Ca2 + geçirgen katyon kanalı 1 olarak işlev görür. PKHD1 kodlayan genin Fibrosistin (tubulogenesis ve / veya epitel polarite devamını sağlayan bir kirpikler ilişkili reseptör benzeri protein) mutasyonları ORPBH 2 genetik ivme bulunmaktadır. Kist büyümesi karmaşık bir fenomen rahatsız çoğalması 3,4, anjiyogenez 5 dediferansiyasyon ve kutupsal kaybı eşlik etmektedirtübüler hücrelerin 6-8 lık.

Kistik epitel Arızalı reabsorbsiyon ve artırılmış salgı lümen ve kist genişlemesi 9,10 sıvı birikimine katkıda bulunur. Bozulmuş akım bağımlı [Ca 2 +] i sinyal de PKD 11-15 döneminde cystogenesis ile bağlantılı olmuştur.

Burada, tek bir kanal aktivitesi ve PCK sıçanlardan izole edilen kistik epitel mono tabakaları, hücre içi Ca + 2 seviyeleri patch-clamp ölçümleri için uygun bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, başarılı bir epitelyal Na + kanalı (ENaC) 10 aktivitesinin karakterize edilmesi için tarafımızdan uygulandı ve [Ca2 +] i Ca2 + geçirgen TRPV4 ve purinerjik sinyal kaskadı 13 tarafından uyarılan işlemleri bağımlı.

Bu çalışmalarda, biz PCK fareleri PKHD1 geninde kendiliğinden mutasyon nedeniyle ORPBH bir model kullanılır. PCK zorlanma originall olduSprague-Davvley (SD) sıçanlarda 16 böylece SD sıçanlarına PCK soyu ile karşılaştırma için uygun bir kontrol olarak kullanılır türetilen y. Bunun bir sonucu olarak, aynı PCK sıçanlardan izole edilen sıçan SD nefron segment ve Genişletilmemiş toplama kanalları hem kistik epitelyum üzerinde deneyler için iki farklı karşılaştırma grupları olarak kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Aşağıda açıklanan deneysel prosedürleri Wisconsin ve Houston Texas Sağlık Bilimleri Merkezi Üniversitesi Tıp Koleji'nde Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi National Institutes uyarınca idi. Şekil 1 doku izolasyon ve işleme prosedürünün ana adımları gösterir. Kısaca, PCK veya SD sıçanların böbrekleri sağlıklı olmayan aranan tübüllerden veya kistleri ya oluklar toplama epitel mono tabakaları elle izolasyonu için kullanılır. Burada 4-16 hafta eski PCK sıçanlar 10,13 böbreklerin okudu.

1. Böbrek Kist ve Bağlantı Pipet (CNT) / İzolasyonu Toplama Kanalları (CD) Kesimleri

  1. Izofluran (% 5 indüksiyon,% 1.5 2.5 bakım) / tıbbi sınıf O 2 ya da başka bir onaylanmış yöntemle deneysel hayvan anestezisi. Hayvanlar sürekli olarak yeterli le sağlamak için izlenmesi gerekirAnestezi vel. Kararlı solunum hızı ve ayak tutam tepki uygun anestezi onaylamak için kullanılır.
  2. Laparotomi gerçekleştirin ve abdominal aort 17 ile fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile böbreklerin yıkayın.
    1. Polietilen boru kateteri (PE50) hazırlayın ve PBS ile dolu bir şırınga pompası bağlayın. Yan ve mezenterik ve çölyak arterler dallanma ile inen aorta erişmek için pamuklu karın organları kaydırmaya taraftan karın karşısında çapraz karın bir kesi yapmak, sonra linea alba boyunca cilt ve karın duvarı kesti. Onların kuruluğunu önlemek için daha fazla işlemler sırasında ılık serum fizyolojik ile iç organları nemlendirin.
    2. Tek mezenterik ve çölyak arterler etrafında bitişik harfleri (# 1) ve başka bitişik harfleri (# 2) diyaframın altında aort etrafında (kravat yok) yerleştirin. Yavaşça bir ayrı. İnce forseps ile çevresindeki bağ dokuları diseksiyon ve iki bitişik harfler koyun künt tarafından abdominalis ~ 3Sol renal arter altına mm (# 3) ve iliak arterler bifurkasyon yukarıda (# 4).
    3. Bağ 4. Kravat ve sol renal arter ve bağ # 3 arasında aort etrafında bir gemi kelepçe takın. Sıkıca kateter düzeltmek için bağ 3. kullanın, kelepçe ve aorta kateterizasyonu bağ 4. arasında bir kesi yapmak.
    4. Kelepçe bırakın ve kan nabız düzgün yüklenmesini sağlamak için kateterin görünür olduğundan emin olun. 6 ml 'lik bir oranda perfüzyon başlayın / dak, alaşımlar # 1 ve # 2 kravat ve sol renal damar kesilir. Organlar tamamen beyazlatılmış kadar 1-2 dakika süreyle yıkamaya devam edin.
    5. Makasla böbrek kan damarları, üretra ve çevresindeki bağ ve yağ dokuları kesmek böbrekleri toplamak. Ardından böbrek kapsülü kısa gözyaşı yapmak ve bunları açarlar için böbrekleri soyun. Buz soğukluğunda PBS içine böbrekler yerleştirin. Ötenazi bir torakotomi ile teyit edilir.
  3. Poli-L-lisin ile kaplanmış 5 x 5 mm cam kapak fiş hazırlayın. Bir kapak GLA Cutbir elmas kalem ve yerine, her bir cam çip üzerine% 0.01 steril filtre edilmiş Poli-L-Lizin çözeltisi, yaklaşık 20 | il ile ss. Tuzlu ve diseksiyon için saatçi forseps iki çift hazırlayın.
  4. 1-2 mm kalınlığında dilimler halinde ~ arasında frontal düzlem boyunca bir jiletle böbrekler kesin. Bir stereomikroskop altında dilim birini yerleştirin. Dokuların izolasyonu buz gibi soğuk tuzlu su içinde yapılmalıdır.
  5. Yuvarlak şekilli boşlukların (Şekil 2A) gibi bir stereomikroskop altında kist bulun; duvarları genellikle çoğaldı kan damarlarının belirgin ağını içerir. Kullanımı ince uçlu forseps bir tek tabakalı alanı elde etmek mümkün olduğunca ince bir kist iç epitel tabakası teşrih. Poli-L-lisin ile kaplanmış cam bir çip için takın. Sabit Poli-L-Lizin yüzey araştırmacısı sıkıca camına iç kist tabakası konumlandırmak sağlar. Pipetler (Şekil 2B) için erişim sağlamak için apikal yüzü yukarı bakacak şekilde kist Açığa.
  6. PCK veya SD sıçan çocuk kullanınolmayan dilate CNT / CCDsegments 18-21 izolasyonu için papilla içeren ney merkez dilim.
    Not: Papiller dokular korteks az ve forseps ile papiller boru şekilli bantlar tutarak ve dilim ince sektörlere bölünebilen ekseni radyal boyunca yırtılarak daha dayanıklıdırlar. Bireysel tübüller görünür ve kapak cam yongaları yerleştirilmek üzere dışarı çekilebilir.
  7. , Bifurkasyonlarında tarafından proksimal tübüllerin ve büyük belirgin görünür hücreler (Şekil 2C) daha yüksek şeffaflık CNT / CCD kesimleri belirleyin. Mikropipetler sürüş için uygun mikromanipülatörler ile donatılmış bir mikroskop altında ekli tübüllere ile cam kapak çipi yerleştirin. Cama onların kenarları keskin Mikropipetler bölünmüş açık tübüllerine kullanma ve takın (Şekil 2B) apikal yüzey erişilebilir hale getirmek için.

2. Tek Kanallı Patch-kelepçe Elektrofizyoloji

  1. Banyo solüsyonu ile yama-kelepçe odasına doldurun ve kapak cam çip transferiodasına izole edilmiş dokular ile. Patch-kelepçe mikropipetler güvenilir on-hücre (hücre-bağlı) ölçümler için 7-10 M? Direncini sahip olduğundan emin olun.
  2. Hücre bağlı ölçümler için, 20x'e amplifikatör kazanç oranını ayarlamak ve sekiz kutuplu Bessel filtresi ile 300 Hz akımları düşük geçmektedir. ENaC kanallarının izlenmesi için, mM banyo çözeltisi, kullanın: 150 NaCI, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 HEPES (pH 7.4); Pipet: 140 LiCİ, 2 MgCl2, 10 HEPES (pH 7.4).
  3. Bir hücre bağlı modda 10 geleneksel bir yama-kelepçe deney. Epitel Tek tabakalı bir hücre seçin ve apikal membran pipet yaklaşım. Hafif bir emme uygulayarak bir pipet ve hücre zarı arasında sıkı bir dirençli sızdırmazlık elemanı oluşturmaktadır. Yüksek dirençli gigaohm kapatmanın meydana getirildiği zaman, bir tutma potansiyelinde bir boşluk içermeyen bir protokol ilgi kanalının izlenmesi aktivitesi için başlanmalıdır.
  4. Giga gelen mağaza boşluk içermeyen tek kanallı güncel verilerSonraki analiz için Ohm mühürler. Genellikle yama-kelepçe kurulumları 18 ile sağlanan bir yazılım paketi kullanarak kanal olayları analiz. Kanalların ortalama açık olasılık N yama ve P o aktif kanal sayısına atıfta nerede NPO olarak kanal aktivitesini hesaplamak olduğunu.
    NOT: en fazla 30 dakika süreyle patch-clamp deneyleri izole kist veya tübüller kullanın.

Epitel hücrelerinde hücre içi kalsiyum konsantrasyonu 3. oranlı metrik Epifloresans Ölçümleri

  1. DMSO içinde çözülmüş 5 mM, Fura-2AM kullanın. Bireysel 500 ul konik tüpler içine kısım stok çözeltisi (yaklaşık 10 ul). Altı aya kadar -20 ° C'de derin dondurucuda ışık ve mağaza koruyun.
  2. PSS 30-40 dakika süreyle izole kistleri ve split-açık tübüller inkübe (mM: 145 NaCl, 4.5 KCl, 2 MgCl2, 2 CaCl2 ve pH 7.35 10 HEPES) 5 uM Fura-2:00 boya ve 0.0 içeren% 5 pluronik asit asetoksimeti esterleri dağıtmak yardımcı olur. Bunun için, yükleme kokteyli ihtiva eden 3.5 cm tabak içinde yer dokular, ışıktan korumak ve oda sıcaklığında yavaş bir karıştırıcı üzerinde inkübe edin.
  3. Inkübasyondan sonra PSS temiz ve daha Epifloresans görüntüleme gerçekleştirmek için bir mikroskop altında dokuyu yerleştirmek için medyayı içeren Fura-2 AM değiştirin.
  4. CCD kamera ve filtre tekerleği ile donatılmış istikrarlı bir ışık kaynağı (monokromatör sistemi) açın (her filtre pozisyon filtresi olarak adlandırılan her zaman seçili kendi zayıflama düzeyi ile ilişkili olabilir).
  5. Parlak saha, dokuyu bulun. Floresans sinyalinin tespiti için geçiş ve sinyal doymasını önlemek için nötral yoğunluk filtreleri ve lamba gücüyle ışık kaynağının yoğunluğunu ayarlamak.
  6. 0.125 Hz veya daha yüksek frekansı ile 340/380 nm'de rasyometrik uyarma ile doku numunesinde Fura-2:00 floresan izleyin. Doğru çözünürlülüğü için 40 × / NA 1.3 veya benzeri objektif lens kullanmation görüntüsü.
  7. Görüntü işleme ve hesaplamalar için görüntü dizisi ithal. Kanal bölmek ve bir hyperstack gri tonlama modu kullandığınızdan emin olun. Birkaç ilgi alanları (tek kist hücreleri veya kistik doku seçilen alanlar) seçin ve tercih edilen veri analiz yazılımı içine her bir kanal (340 ve 380 nm) için yoğunluk değerlerini hesaplamak; her bir veri noktasından çıkarma arka yoğunluk değerleri.
  8. Her zaman noktası için Fura-02:00 340 380 kanalların yoğunluklarının oranı hesaplanır. Plot dağılım / her bölge için Ca 2+ geçici hat noktası-time değişiklikleri ve hesaplamak ortalama / SE değerleri.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Cystogenesis potansiyel ENaC tutulumu ORPBH murin modelleri ve doku kültürleri 26-28 PKD ilerlemesi 22-25 ve anormal sodyum reabzorpsiyonunda sinyal kesintiye epidermal büyüme faktörü (EGF) gözlemlenen çeşitli çalışmalar tarafından ortaya konmuştur. Örneğin, Veizis ve ark., Amiloride duyarlı Na + absorpsiyon ORPBH 29 olmayan ortolog BPK fare modelinde CD hücrelerinde azalmış olduğunu göstermiştir. Biz son zamanlarda kistleri bozulmuş sodyum ve su reabsorbsiyonu cystog...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Biz ORPBH bir murin genetik modelinde elde edilen kistik epitel mono tabakaları için geleneksel kumanda klemp tekniği ve epifloresans kalsiyum görüntüleme uygulamaları tarif. Protokol en dikkat kistleri (protokoller bölümünün adım 1.5) izolasyonuna ve elektrofizyolojik çalışmalar ödenmesi gereken üç adımda, oluşur. Bu anahtar prosedürler kapsamlı eğitim ve sabır gerektiren ve okuyucu seferde hüsrana olmamalıdır.

Her şeyden önce, en dikkat kist tek tabakalı izolasyon sürecine dikkat edilmelid...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar mikroskobu deneyleri ile mükemmel teknik yardım için Glen Slocum (Wisconsin Tıp Koleji) ve Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc.) teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma (AS) R01 HL108880 (OPO kadar) R01 DK095029 ve (TSP) K99 HL116603 (TSP) Ulusal Böbrek Vakfı IG1724, (OPO kadar) Amerikan Kalp Derneği 13GRNT16220002 ve hibe Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından da desteklenmiştir (DVI) Nefroloji American Society Ben J. Lipps Araştırma Bursu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Fura-2Yaşam TeknolojileriF-14185
Fluo-8AAT Bioquest21091
Poli-L-lizinSigma-AldrichP4707
Plüronik asitSigma-AldrichF-68  çözüm
ShakerBoekel Scientific260350
Işık kaynağıSutter Instrument CoLambda XLentegre deklanşör/filtre tekerleği sürücülü
Nötr yoğunluk filtreleriNikonND4, ND8
ObjektifNikonSFluo 40/1.3 DIC WD 0.22    yağ
KameraAndor TeknolojileriZyla sCMOS
Nikon  mikroskop (ters)NikonNikon Eclipse TE2000-S
Kapak CamıThermo Scientific6661B52
Elmas kalemFisher Scientific22268912
Görüntü elde etme yazılımıNikonNikon NIS-Elements 
Görüntü analiz yazılımıImageJhttp://imagej.nih.gov/ND Utility eklentisi, görüntülerin yerel Nikon Instruments .nd2 formatında içe aktarılmasına olanak tanır
Kayıt/perfüzyon odasıWarner InstrumentsRC-26
Yama Kelepçesi amplifikatörüMoleküler CihazlarMultiClamp 700B
Veri Toplama SistemiMoleküler CihazlarDigidata 1440AAxon Digidata® Sistem
Alçak Geçiren FiltreWarner InstrumentsLPF-88 kutuplu Bessel
Borosilikat cam kılcal damarlarDünya Hassas Aletler1B150F-4
Mikropipet ÇektirmeSutter Aleti CoP-97Alevli/Kahverengi tip mikropipet çektirme
MicroforgeNarishigeMF-830Japonya
Motorlu MikromanipülatörSutter Instrument CoMP-225
Ters mikroskopNikonEclipse Ti
Mikrotitreşim izolasyon masasıFaraday kafesi ile donatılmışTMC
Çok kanallı valf perfüzyon sistemiAutoMake ScientificValve Bank II
Kayıt/perfüzyon odasıWarner InstrumentsRC-26
YazılımıMoleküler CihazlarpClamp 10 . 2
Sıcaklık kontrollü ameliyat masası Kemirgenler içinMCW çekirdeği
Binoküler stereomikroskopNikonSMZ745
Şırınga pompası tabanlı perfüzyon sistemiHarvard Aparatı
polietilen boruSigma-AldrichPE50
İzofloran anestezihttp://www.vetequip.com/911103
Diğer temel reaktiflerSigma-Aldrich
,

Kaynaklar

  1. Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
  2. Zhang, M. Z., et al. PKHD1 protein encoded by the gene for autosomal recessive polycystic kidney disease associates with basal bodies and primary cilia in renal epithelial cells. Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 101 (8), 2311-2316 (2004).
  3. Chang, M. Y., et al. Haploinsufficiency of Pkd2 is associated with increased tubular cell proliferation and interstitial fibrosis in two murine Pkd2 models. Nephrol. Dial. Transpl. 21 (8), 2078-2084 (2006).
  4. Park, F., Sweeney, W. E., Jia, G., Roman, R. J., Avner, E. D. 20-HETE mediates proliferation of renal epithelial cells in polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (10), 1929-1939 (2008).
  5. Huang, J., Woolf, A., Long, D. Angiogenesis and autosomal dominant polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 28 (9), 1749-1755 (2013).
  6. Wilson, P. D. Apico-basal polarity in polycystic kidney disease epithelia. Bioch Biophys Acta. 1812 (10), 1239-1248 (2011).
  7. Wilson, P. D. Epithelial cell polarity and disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 272 (4 Pt 2), F434-F442 (1997).
  8. Wilson, P. D., et al. Reversed polarity of Na(+) -K(+) -ATPase: mislocation to apical plasma membranes in polycystic kidney disease epithelia. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 260 (3 pt 2), F420-F430 (1991).
  9. Murcia, N. S., Sweeney, W. E., Avner, E. D. New insights into the molecular pathophysiology of polycystic kidney disease. Kidn. Intern. 55 (4), 1187-1197 (1999).
  10. Pavlov, T. S., Levchenko, V., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Staruschenko, A. Impaired epithelial Na+ channel activity contributes to cystogenesis and development of autosomal recessive polycystic kidney disease in PCK rats. Ped. Res. 77 (1), 64-69 (2014).
  11. Siroky, B. J., et al. Loss of primary cilia results in deregulated and unabated apical calcium entry in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 290 (6), F1320-F1328 (2006).
  12. Hovater, M. B., et al. Loss of apical monocilia on collecting duct principal cells impairs ATP secretion across the apical cell surface and ATP-dependent and flow-induced calcium signals. Purin. Signal. 4 (2), 155-170 (2008).
  13. Zaika, O., et al. TRPV4 Dysfunction Promotes Renal Cystogenesis in Autosomal Recessive Polycystic Kidney Disease. J. Am. Soc. Nephrol. 24 (4), 604-616 (2013).
  14. Rohatgi, R., et al. Mechanoregulation of intracellular Ca2+ in human autosomal recessive polycystic kidney disease cyst-lining renal epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294 (4), F890-F899 (2008).
  15. Xu, C., et al. Attenuated, flow-induced ATP release contributes to absence of flow-sensitive, purinergic Cai2+ signaling in human ADPKD cyst epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 296 (6), F1464-F1476 (2009).
  16. Katsuyama, M., Masuyama, T., Komura, I., Hibino, T., Takahashi, H. Characterization of a novel polycystic kidney rat model with accompanying polycystic liver. Exp. Animals. 49 (1), 51-55 (2000).
  17. Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol. Biol. 998, 355-369 (2013).
  18. Pavlov, T. S., et al. Deficiency of renal cortical EGF increases ENaC activity and contributes to salt-sensitive hypertension. J. Am. Soc. Nephrol. 24, 1053-1062 (2013).
  19. Mironova, E., Bugay, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A., Stockand, J. Recording ion channels in isolated, split-opened tubules. Methods Mol. Biol. 998, 341-353 (2013).
  20. Pavlov, T. S., et al. Endothelin-1 inhibits the epithelial Na+ channel through betaPix/14-3-3/Nedd4-2. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (5), 833-843 (2010).
  21. Sun, P., et al. High Potassium Intake Enhances the Inhibitory Effect of 11,12-EET on ENaC. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (10), 1667-1677 (2010).
  22. Zheleznova, N. N., Wilson, P. D., Staruschenko, A. Epidermal growth factor-mediated proliferation and sodium transport in normal and PKD epithelial cells. Biochim. Biophys. Acta. 1812 (10), 1301-1313 (2011).
  23. Sweeney, W. E., von Vigier, R. O., Frost, P., Avner, E. D. Src inhibition ameliorates polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (7), 1331-1341 (2008).
  24. Sweeney, W. E., Avner, E. D. Functional activity of epidermal growth factor receptors in autosomal recessive polycystic kidney disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 275 (3 Pt 2), F387-F394 (1998).
  25. Orellana, S. A., Sweeney, W. E., Neff, C. D., Avner, E. D. Epidermal growth factor receptor expression is abnormal in murine polycystic kidney. Kidn. Intern. 47 (2), 490-499 (1995).
  26. Rohatgi, R., et al. Cyst fluid composition in human autosomal recessive polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 20 (4), 552-553 (2005).
  27. Rohatgi, R., Greenberg, A., Burrow, C. R., Wilson, P. D., Satlin, L. M. Na transport in autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD) cyst lining epithelial cells. J. Am. Soc. Nephrol. 14 (4), 827-836 (2003).
  28. Olteanu, D., et al. Heightened epithelial Na+ channel-mediated Na+ absorption in a murine polycystic kidney disease model epithelium lacking apical monocilia. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290 (4), C952-C963 (2006).
  29. Veizis, I. E., Cotton, C. U. Abnormal EGF-dependent regulation of sodium absorption in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288 (3), F474-F482 (2005).
  30. Wilson, P. D. Polycystic kidney disease. NEJM. 350 (2), 151-164 (2004).
  31. Hillman, K. A., et al. P2X(7) receptors are expressed during mouse nephrogenesis and in collecting duct cysts of the cpk/cpk mouse. Exp. Nephrol. 10 (1), 34-42 (2002).
  32. Turner, C. M., Ramesh, B., Srai, S. K., Burnstock, G., Unwin, R. J. Altered ATP-sensitive P2 receptor subtype expression in the Han:SPRD cy/+ rat, a model of autosomal dominant polycystic kidney disease. Cells Tissues Organs. 178 (3), 168-179 (2004).
  33. Hillman, K. A., et al. The P2X7 ATP receptor modulates renal cyst development in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. 322 (2), 434-439 (2004).
  34. Wilson, P. D., Hovater, J. S., Casey, C. C., Fortenberry, J. A., Schwiebert, E. M. ATP release mechanisms in primary cultures of epithelia derived from the cysts of polycystic kidneys. J. Am. Soc. Nephrol. 10 (2), 218-229 (1999).
  35. Schwiebert, E. M., et al. Autocrine extracellular purinergic signaling in epithelial cells derived from polycystic kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282 (4), F763-F775 (1152).
  36. Stockand, J. D., et al. Purinergic inhibition of ENaC produces aldosterone escape. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (11), 1903-1911 (2010).
  37. Pochynyuk, O., et al. Paracrine Regulation of the Epithelial Na+ Channel in the Mammalian Collecting Duct by Purinergic P2Y2 Receptor Tone. J. Biol. Chem. 283 (52), 36599-36607 (2008).
  38. Zaika, O., Mamenko, M., Boukelmoune, N., Pochynyuk, O. IGF-1 and insulin exert opposite actions on ClC-K2 activity in the cortical collecting ducts. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 308 (1), F39-F48 (2015).
  39. Lalo, U., Pankratov, Y., Kirchhoff, F., North, R. A., Verkhratsky, A. NMDA receptors mediate neuron-to-glia signaling in mouse cortical astrocytes. J. Neurosci. 26 (10), 2673-2683 (2006).
  40. Lalo, U., Andrew, J., Palygin, O., Pankratov, Y. Ca2+-dependent modulation of GABAA and NMDA receptors by extracellular ATP: implication for function of tripartite synapse. Biochem. Soc. Trans. 37 (Pt 6), 1407-1411 (2009).
  41. Li, D., et al. Inhibition of MAPK stimulates the Ca2+ -dependent big-conductance K channels in cortical collecting duct). Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 103 (51), 19569-19574 (2006).
  42. Bugaj, V., Mironova, E., Kohan, D. E., Stockand, J. D. Collecting duct-specific endothelin B receptor knockout increases ENaC activity. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302 (1), C188-C194 (2012).
  43. Pavlov, T. S., et al. Regulation of ENaC in mice lacking renal insulin receptors in the collecting duct. FASEB J. 27 (7), 2723-2732 (2013).
  44. Gleason, C. E., et al. mTORC2 regulates renal tubule sodium uptake by promoting ENaC activity. J. Clin. Invest. 125 (1), 117-128 (2015).
  45. Frindt, G., Palmer, L. G. Acute effects of aldosterone on the epithelial Na channel in rat kidney. Am. J. Physiol. Renal Physiol. , (2015).
  46. Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidn. Int. 86 (3), 506-514 (2014).
  47. Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305 (10), C1050-C1059 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

yon Kanal AktivitesiH cre i KalsiyumKistik Monotaba zolasyonuElektrofizyolojik Kay tKalsiyum G r nt lemeKonfokal MikroskopiFloresan Boya Y kleme
Patch Kelepçe ve Canlı Floresan Mikroskobu uygulanması Taze İzole PKD Epitelinin Fonksiyonel Properties Monitör
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.