Yöntem makalesi

Ismarlama Mikrodiyaliz Probe Tasarım

DOI:

10.3791/53048

⸱

21 Temmuz 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Goethe University of Frankfurt, 2Department of Pharmaceutical Chemistry, Goethe University of Frankfurt, 3Department of Clinical Pharmacology, Goethe University of Frankfurt

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrodiyaliz sinirbilim araştırmalarında yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bu nedenle ticari sondalar Büyük demand.In bir sonda düzeneği az 10 $ için güvenilir, eş, ısmarlama Mikrodiyaliz probu oluşturmak için ayrıntılı olarak açıklanmıştır, bu çalışma vardır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrodiyaliz sinirbilim araştırmalarında yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bu nedenle ticari sondalar beyin omurilik sıvısında, fizyolojik, farmakolojik ve patolojik değişiklikleri izlemek için büyük bir talep vardır. Ne yazık ki, ticari sondalar kamu kurumlarında araştırma grupları için pahalıdır. Bu çalışmada, bir sonda düzeneği az 10 $ için güvenilir, eş, ısmarlama Mikrodiyaliz probu oluşturmak için ayrıntılı olarak açıklanmıştır. mikrodiyaliz sondası 30 kDa'lık bir moleküler kesme sahip bir polisülfon zar oluşur. Prob nitro (100-1,600 Da aralığında), farklı molekül ağırlığı ve farklı fiziko-kimyasal özelliklere sahip maddelerin geri kazanımları karşılaştırılmıştır bölgesindeki. Prob, küçük bileşikler, glukoz, laktat, asetilkolin, ATP için yaklaşık% 20 bir in vitro iyileşme elde edilir.% 2-6 kadar 1,000-1,600 Da miktarı arasında bir molekül ağırlığına sahip nöropeptid için in vitro geri kazanımını. Bu nedenle, daha yüksek bir moleküler w isenöropeptid sekiz, in vitro kurtarma değerlerinde moleküler ağırlıkları alt aralığı (500 Da) bileşiklerin diyaliz in vitro iyileşme oranı üzerinde hiçbir büyük etkisi vardır indirdi. Mevcut buluş, başka bir kesme değeri ile zar malzemesi ile bir diyaliz membranı kullanımını sağlar. Bu nedenle, bu ölçüye prob takımı, geniş bir molekül ağırlığı aralığı içinde maddeleri diyaliz etmek için yeterli esneklik avantajı vardır. Burada, fare ve sıçan beyin bölgelerinde mikrodiyaliz için geçerlidir 2 mm'lik bir kuru uzunluğu olan bir mikrodiyaliz sondası getirmektedir. Bununla birlikte, sondanın boyutları, kolayca daha büyük hayvanlarda kullanılmak üzere daha büyük bir değişim uzunlukları için adapte edilebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrodiyaliz sinirbilim araştırmalarında yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Son 50 yılda, minimal invazif mikrodiyaliz tekniği sürekli hücre dışı alanda küçük molekül ağırlıklı bileşikler yerel konsantrasyonlarını izlemek için köklü bir yöntem haline geliştirilmiştir. Neredeyse her interstisyel doku sıvısı serbestçe hareket hayvanlarda incelenebilir.

Gaddum 1960'larda push-pull tekniğini tanıttı. O Feldberg et al bir yaklaşım modifiye. Burada tubokurarin bir Kanülün yan karıncıkta biten ve bir kanül 1 üzerinden de çıkış maddesinin toplanması yoluyla perfüze edildi. Gaddum eş zamanlı ucu 2 çevreleyen nöronlardan salınan nörotransmitterler çıkarırken iki eş çelik iğne oluşan bir kanül bir çözelti ayrı beyin bölgelerinde implante ve perfüze edildiği itme-çekme tekniğini geliştirdi. Ne yazık ki, doku damaucu etrafında kanül kaynaklanan ge bu yöntemin uygulamaya sınırlı. Bu yöntemin bir başka gelişme de, Bito ve arkadaşları toplanan solüsyonu, bir diyaliz zarı çevreleyen dokudan ayrılmış olan bir diyaliz torbası yöntem geliştirmiştir. Onlar köpek boyunlarının deri altı doku içine bir diyaliz kesesi implante. Diyaliz çantasının içeriği, protein içermez ve iyonların ve amino asitlerin 3 için pek çok hafta sonra analiz edilebilir. Bir sonraki gelişme dialytrode, ilk olarak 1972 yılında 4 Delgado tarafından açıklanan ilkel bir mikrodiyaliz prob oldu. küçüktü ve daha az doku 5 yerinden böylece Nihayet, Ungerstedt ve arkadaşları mıkrodıyalız prob tasarımını geliştirdi.

Bir eş mıkrodıyalız probu kan kılcal benzer şekilde davranır. Sistem sürekli ilgi analit eksik ise çevredeki doku sıvısının iyonik bileşimi içeren bir çözelti ile perfüze. ThDış çözelti ya da dokusu ile temasta e diyaliz zarı yarı geçirgendir. Bu onların konsantrasyon gradyanı 6 boyunca prob içine maddelerin pasif difüzyon izin verir. geçirgenliği, molekül ağırlığı, şekil, şarj ve bileşiğin pH gibi pek çok değişkene bağlıdır. Membran malzemesinin özelliklerine, membranın gözenek büyüklüğü ve hızı 7 akış nedeniyle bu da sınırlıdır.

1. Şekil, 2 eş merkezli bir mikrodiyaliz sondası göstermektedir. perfüzyon sıvısı kaynaşmış silika çevreleyen metal kovan içine bir giriş hortumu yoluyla girer. Metal kovan içinde, o erimiş silis boyunca aşağı akarsuları ve bahşiş bırakır. Diyaliz zarı ve politetrafloroetilen (PTFE) (örneğin Teflon gibi) -tubing arasındaki boşluğa perfüzyon sıvısı daha sonra yukarı doğru akar. Burada, doku maddelerin dağılma zarı çevreleyen olduğu ortaya çıkar. diyalizat PTF aracılığıyla prob bırakırTüp çıkışına bağlanır ve toplanabilir E-tüp.

mikrodiyaliz tekniği in vivo teknikleri diğerine göre birçok avantajı vardır. Sonda diyalizat hiçbir enzimler veya hücreleri içeren sonuç ile fiziksel bir bariyer oluşturur. Bu nedenle, var analizden önce, sıyırma sıvısının saflaştırılması için bir ihtiyaç vardır, ve analitlerin bir enzimatik bozunma meydana gelir. Oksidatif parçalanma boru analitlerin geçişi sırasında oluşabilir, ancak bu genellikle perfüzat için bir antioksidan (örneğin askorbik asit) eklenerek önlenebilir. Alternatif olarak, nöropeptitlerin oksidatif hasar, örneğin, verimli diyalizatı 8 toplamak için bir ipucu ile çıkış boru değiştirerek bastırıldı. Diyalizat analitik yöntem neredeyse her türlü doğrudan incelenebilir ve çoklu analitler aynı anda tahsil edilebilir. Bu sistem, uyanık hayvanlarda kullanılabilir, ve hemen hemen tüm beyin bölgelerinde olabilirincelenmiştir. Ayrıca, sonda vasıtasıyla ilaçların infüzyon mümkün (retrodialysis) 'dir. Bununla birlikte, mikrodiyaliz tekniği sınırlamalar vardır. biraz düşük çözünürlüklü zaman nörotransmitter değişiklikleri ile ilgili gerçek zamanlı bilgi sağlamaz. Bir invaziv olduğundan, prob implantasyonu bu adımda 7,9,10 sırasında gerekli olan nörotransmiter konsantrasyonlarını etkileyebilir cerrahi travma ve anestezi, neden olur.

diyalizat bileşik konsantrasyonu, hücre-dışı sıvı gerçek bileşik konsantrasyonu, sadece küçük bir miktar ihtiva eder. Hücre-dışı sıvı bilinmeyen bir bileşik konsantrasyonunun hesaplanması için, bağıl in vitro geri hesaplanmalıdır. Bireysel Her prob için in vitro kazanımlarının akrabası ve her bileşik tayini in vivo deney başlamadan önce gereklidir. Bu amaç için, prob ihtiva eden bir çözelti içine daldırılmaktadırperfüzyon sıvısı ise ilgi analit ilgi analit eksik aynı çözümdür. Diyalizat bileşik konsantrasyonlarının belirlenmesi sonra, bu veriler, çevredeki sıvıda konsantrasyon sevk edilmesi yer alır. Birkaç maddelerin in vitro geri tayinleri aynı zamanda 9 uygulanabilir.

Birçok sinirbilim araştırma grupları farklı beyin bölgeleri dışı uzayda nörotransmitterlerin ve metabolitleri araştırmak için Mikrodiyaliz tekniğini kullanın. Böylece, ticari sondalar sinirbilim araştırması ortamında büyük talep bulunmaktadır. Piyasada mevcut probların büyük avantajı yüksek fonksiyonel güvenilirlik olduğunu. Ticari problar için deneysel set-up iyi kurulmuş ve birçok tanınmış nörotransmitterlerin ve metabolitleri için doğrulanmıştır. Bununla birlikte, ticari olarak temin edilebilen mikrodiyaliz ekipmanları pahalıdır ve th uygulama 11 daha az bükülebilen, oysaherhangi bir uygulama için adapte edilebilir ve daha az $ 10 imal edilebilir, bir mikrodiyaliz sondası tertibatı ayrıntılı olarak sunulan bir iştir. Bu ısmarlama sonda çeşitli beyin bölgelerinde 8 soruşturmalar için test bir eş mikrodiyaliz prob olduğunu.

Farklı molekül ağırlığı (100-1,600 Da aralığında) ile olan maddelerin in vitro prob kurtarma, farklı fiziko-kimyasal özellikleri karşılaştırılmıştır., Bir molekül ağırlığına sahip bir molekül ağırlığı en az 200 Da, ATP ile glikoz, laktat ve asetilkolin in vitro geri belirlenmesini yaklaşık 500 Da ve nöropeptidlerin anjiyotensin II, 1000 Da üzerinde olan bir molekül ağırlığına sahip P maddesi ve somatostatin gerçekleştirilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hazırlanması PTFE tüp

  1. 2.5 cm parçaya PTFE tüp kısaltın. Fiziksel boyutları tahmin etmek için bir ölçek kağıt kullanın. (Şekil 3a bakınız)
  2. Çıkış boru bağlantı kolaylaştırmak için belirli bir açıyla bir bitiş kesin. (Şekil 3a bakınız)
  3. Zımpara kağıdı kullanılarak Kabalaştır PTFE boru epoksi yapıştırıcı yapıştırılmasını sağlamak için.

2. Sigortalı Silika hazırlanması

  1. 2.25 cm'lik bir parça içine erimiş silis kısaltın. (Şekil 3a bakınız)

3. PTFE tüp içine Sigortalı Silika ekleme

  1. Düz ucundan 1 cm mesafeden onu delmek için boş PTFE fiber içine 30 G kanül yerleştirin. Sürecini kolaylaştırmak için PTFE boru bükün. (Şekil 3B)
  2. Rehberlik gibi kanül kullanılarak PTFE tüp içine erimiş silis yerleştirin. (Şekil 3c bakınız)
  3. Yavaşça kanül kaldırmak ve erimiş silis sabitleyin. (GörmekŞekil 3d)
  4. erimiş silis düz ucunda 5 mm çıkıntı gerekiyordu. (Şekil 3e bakınız)
  5. Siyanoakrilat yapıştırıcı ile ponksiyon yerinde yerde erimiş silis Tutkal ve gece boyunca sertleşmeye bırakın. (Şekil 3e bakınız)

4. Hazırlama Epoksi Yapıştırıcı (İki Bileşenli Tutkal)

  1. Ince bir iğne yardımıyla siyah epoksi yapıştırıcı 70 parça sarı sertleştirici 30 parça ekleyin ve hafifçe karıştırın. Bu, doğrudan kullanıma hazırdır.

5. Membran (Tüm Ek Adımlar Mikroskop altında yapılmalıdır ve bir Ölçek Kağıt Fiziksel Boyutlar tahmin etmek Kullanılıyor) uygulanması

  1. Daha sonra PTFE tüp içine membran çekin, dikkatle erimiş silis üzerinde polisülfon zarını çekin ve keskin bir neşter kullanılarak 5.5 mm membran ayarlayın. (Şekil 3f bakınız)
  2. 2 mm değişimi uzunluğunu tanımlamak için ince kalem ile membran üzerinde işaretleme noktasını ayarlamazarın ucundan.
  3. Ince bir iğne yardımı ile membranın uç kapak epoksi yapıştırıcı bir miktar uygulanır. (Şekil 3g bakınız)
  4. Epoksi yapıştırıcı ile adım 5.3 kullanılan aynı ince iğne) yardımıyla diyaliz membran ve PTFE fiber arasındaki eklem dışı kapatın. (Şekil 3g bakınız)
  5. 2 mm'lik bir değişim uzunluğunu sağlamak için işaretleme noktasına kadar zar üzerinde yeterince epoksi tutkal ekleyin. O gece boyunca sertleşmesini bekleyiniz. Değişim uzunluğunun belirlenmesi öncesinde (Şekil 3g bakınız), membran 5.5 mm'dir. Zar üzerinde epoksi yapıştırıcı uygulandıktan sonra, zarın yalnızca 2 mm difüzyonu için kullanılabilir.

6. Metal Kol Uygulanması

  1. Bir eğme pense yardımı ile 1 cm bir metal manşon parçalar halinde 25 G iğne kesin.
  2. Erimiş silis kalan kısmına 1 cm'lik metal bileziği (25 G) çekin. Metal kol, daha sonra MICRODIA ile giriş boru bağlantı sağlayanlizis probu. (Şekil 3 h bakınız)
  3. Kalan epoksi yapıştırıcı ile metal kovan ve PTFE tüp arasındaki eki saklamak. En az 24 saat süreyle sertleşmesine izin verin. (Şekil 3i bakınız)
  4. Ek fiksasyon ve stabilizasyon için prob çatallanma etrafında sıcak tutkal uygulanması.
    NOT: prob girişi iç hacim 0.045 ul ve çıkış iç hacim 2.5 ul olmasıdır. Bu nedenle, 1 ul bir akış oranında / dk, bu diyalizat toplanmasını başlamak için emme tüpünü bağlandıktan sonra yaklaşık 2.5 dakika sürer. Mevcut protokol ile, prob montaj işlemi% 95 güvenilir mikrodiyaliz probları verir.

In Vitro Kurtarma Deney 7. Performans

  1. 100 ihtiva eden bir CSF halinde, 30 kDa'lık bir kesme ve CSF Ayrı bir deneyde 1 mM glükoz ve 1 mM laktat ve ihtiva oluşan bir stok çözeltisi içine 2 mm kadar bir kuru uzunluğu prob DipnM ATP ve 100 nM asetilkolin.
  2. ACSF ile probları serpmek. 1 ul / dak akış hızı ayarlama ve oda sıcaklığında (22 ° C) deneyleri yürütmek. Problar hazır çözelti içinde 1 saat süreyle dengelenmeye ve ölçüm kadar -80 ° C 'de numuneleri her 30 daha sonra minimum ve mağaza toplamak için izin verir.
  3. In vitro kurtarma hesaplanması için, hazır çözelti içinde, bilinen bir analit konsantrasyonları ile konsantrasyonu, analit konsantrasyonlarının karşılaştırın. Stok solüsyonu vs diyalizat madde konsantrasyonunun yüzde olarak sonuçlarını ifade eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

eş ölçüye mikrodiyaliz sondası 30 kDa'lık bir moleküler kesme sahip bir polisülfon zar oluşur. prob takımı, Şekil 3 'de gösterilmiştir.

Bu, sırasıyla, 19.10 ± 1.2 ve% 21.2 ±% 1.6 arasında küçük enerji metabolitleri glikoz (180,16 Da) ve laktat (112,06 Da) için bir in vitro toparlanma sergilemiştir. 181,66 Da'lık bir moleküler ağırlığa sahip, pozitif yüklü asetilkolin için, 22.6 ±% 1.4 bir in vitro geri değeri gösterdi. 551,62 Da ve üç negatif yüklü fosfat a...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 3, bir örnek teşkil eden prob takımını göstermektedir. Doğru iç ve dış çap boyutları yakından boru için dikkat edilmesi var (OD 1.6 mm; Kimliği 350 mikron), erimiş silis (OD 105 mikron; um ID 40) ve diyaliz membranı (OD 245 mikron; ID 210 mikron). Bu membran ve (105 um) ve membran ve hem de boru (105 um) arasında kaynaşık silika arasında bir boşluk tutmak için de önemlidir. Değerler farklıysa, prob basınç yükselecek ve membran sızıntısına yol açabilir.

Burada fare beyi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, desteği ve epoksi yapıştırıcıyı sağladığı için G. Barka'ya (SunChrom GmbH, Friedrichsdorf, Almanya) minnettardır. Ayrıca yazarlar, Fresenius Medical Care'e (Bad Homburg, Almanya) Kapiller Hemodiafiltre FXCorDiax'ı tedarik ettiği için teşekkür eder. Finansman Frankfurt Goethe Üniversitesi'nden sağlandı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Epoksi yapıştırıcıSunChrom GmbH, Fiedrichsdorf, Almanya     
Erimiş silika ID 40 ve mikro; m OD 105 ve mikro; mZiemer-Chromatographie, Mannheim, AlmanyaSanat. No: 6.040105
Polisülfon membran (hemodiyaliz filtresi FX Cor Diax 600)Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA, Bad Homburg, AlmanyaREF: F00001593
Siyankrilat yapıştırıcı (Pattex® süper yapıştırıcı plastik)Henkel AG&Co. KGaA, Dü sseldorf, Almanya
TEFLON boru 1,6 x 0,35 mmSunChrom® GmbH, Friedberg, AlmanyaSanat. No: 969-195.219
Neşter (Kuş Tüyü® Cerrahi Bıçak No. 10)pfm medical ag, kolonya, AlmanyaArt. No: 07310
MikroskopMEIJI Techno EMZ-8TR
30 G x 11" (0.3 x 25 mm) kanül  Sterican® ZB.Braun Melsungen AG, Melsungen, AlmanyaREF: 9324500
25 G x 11/2" (0.5 x 40 mm) kanül 100 Sterican®B.Braun Melsungen AG, Melsungen, AlmanyaREF: 9186166
İnce kalem (Stabilo noktası 88 ince 0.4)Schwan-STABILO Schwanhä uß er GmbH & ve Tic. A.Ş. KGSanat. No: 88/36
Sıcak tutkal  (Tutkal çubukları ULTRA Power x 11 mm)Steinel® GmbH, Herzebrock-Clarholz, AlmanyaSanat. No: 4007841046910
Zımpara Kağıdı P60 230 x 280Robert Bosch GmbH, Gerlingen-Schillerhö he, AlmanyaKatalog Numarası: 2608605397

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Feldberg, W., Malcom, J. Experiments on the site of action of tubocurarine when applied via the cerebral ventricles. J Physiol. 149, 58-77 (1959).
  2. Gaddum, J. H. Push-pull cannulae. J Physiol. 155 (1 P), (1961).
  3. Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
  4. Delgado, J. M., Lerma, J., Martín del Río, R., Solís, J. M. Dialytrode technology and local profiles of amino acids in the awake cat brain. J Neurochem. 42 (5), 1218-1228 (1984).
  5. Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30 (1-3), 44-55 (1974).
  6. Ungerstedt, U. Microdialysis--principles and applications for studies in animals and man. J Intern Med. 230 (4), 365-373 (1991).
  7. Bourne, J. A. Intracerebral microdialys: 30 years as a tool for the neuroscientist. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30 (1-2), 16-24 (2003).
  8. Lietsche, J., Gorka, J., Hardt, S., Karas, M., Klein, J. Self-built microdialysis probes with improved recoveries of ATP and neuropeptides. J Neurosci Methods. 237, 1-8 (2014).
  9. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of Brain Microdialysis. Curr Protoc Neurosci. 7, Unit 7.1(2009).
  10. Neurochem, J. Brain Microdialysis. J. Neurochem. 52 (6), 1667-1679 (1989).
  11. Jolly, D., Vezina, P. In vivo microdialysis in the rat: low cost and low labor construction of a small diameter, removable, concentric-style microdialysis probe system. J Neurosci Methods. 68 (2), 259-267 (1996).
  12. Sumbria, R., Klein, J., Bickel, U. Acute depression of energy metabolism after microdialysis probe implantation is distinct from ischemia-induced changes in mouse brain. Neurochem Res. 36, 109-116 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Custom Microdialysis ProbePolysulfone MembranePTFE TubingFused SilicaEpoxy GlueMetal SleeveIn Vitro RecoveryMolecular Weight CutoffExchange LengthNeuropeptide Detection

İlgili makaleler