Yüzey Yayma ve Maya Kromozomlar immün

Özet

Tomurcuklanan mayadan yüzeye yayılan kromozomlar için bir yöntem sunulmuştur. Bu yöntem, daha önce Loidl ve Klein tarafından açıklanan bir yöntemden türetilmiştir. Ek olarak, yayılmış kromozomların immün boyaması için bir prosedür gösteriyoruz.

Özet

Tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae'nin çekirdek boyutunun küçük olması, kromatine bağlı proteinlerin çekirdek altı dağılımının analizi için ışık mikroskobunun kullanımını sınırlar. Maya çekirdeklerinin yüzeye yayılması, bağlı protein kaybı olmadan kromatinin genişlemesine neden olur. Yüzeye yayma yöntemi, DNA'ya bağlı proteinlerin deterjan muamelesi ile fiksasyonunu dengeler. Gösterilen yöntem, Josef Loidl ve Franz Klein^1,2 tarafından tarif edilenden biraz değiştirilmiştir. Yöntem, mitotik hücre döngüsünün çeşitli aşamalarında birçok kromatine bağlı proteinin lokalizasyonunu karakterize etmek için kullanılmıştır, ancak özellikle mayotik rekombinozomlar ve sinaptonemal kompleks gibi mayotik kromozom yapılarının incelenmesi için yararlıdır. Ayrıca, orijinal prosedürde talep edilen, ancak artık ticari olarak mevcut olmayan tescilli bir deterjan olan Lipsol'ün kullanılmasını gerektirmeyen bir modifikasyonu da açıklıyoruz. Kromozom yayma yöntemi ile uyumlu bir immün boyama protokolü de açıklanmaktadır.

Giriş

tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae kromozom fonksiyonunu kontrol eden proteinlerin çalışmaya dahil olmak üzere biyolojik süreçlerin moleküler mekanizmaları, çalışmaları için birçok avantaj sunuyor. , Moleküler genetik ve biyokimyasal çalışmalar için maya tomurcuklanan iyi bilinen avantajları olmasına rağmen, hücre çekirdeğinde bulunan protein dağılımının sitolojik çalışmalar küçük boyutu karmaşıktır. Tipik bir maya çekirdeği görünür ışığın sadece yaklaşık 5 katı çözünürlük sınırı olan en az bir mikron bir çapa sahiptir. Bu nedenle, geleneksel bir immün ya da, yeşil flüoresan protein (GFP) gibi floresan proteini etiketleri kullanılarak elde edilebilir, nükleer proteinlerin dağılımı hakkında bilgi miktarı sınırlıdır. Proteinlerin çekirdek içi dağılımı karakterize için yararlı bir yaklaşım, yayılma kromozom yüzeyidir. Bu yaklaşım, hücre duvarını kaldırarak hücre ve nükleer membranlar ve a kesintiye içerirllowing çekirdeğin çözünmeyen içeriğinin bir mikroskop lamı yüzeyi üzerine yerleştirmek. Çözünmeyen bileşenler, nükleer matris ve kromozom bulunmaktadır. Kromatin bağlı proteinleri tespit etmek için yeteneğini geliştirir çözülebilen çekirdek içindeki uzaklaştırılmasını sağlayan ek olarak, bu tür yayılmış çekirdek yaklaşık 3 um ila 5 arasında çaplara sahip (diploid mayoz çekirdekleri) kromozom önemli dekompresyonu yöntem sonucu yayılan kromozom ve 2 diploid mitotik çekirdekleri ila 3 um. Bu dekompresyon sağlam çekirdekleri gidermek için nispeten zor veya imkansız nükleer alt algılanmasını sağlar.

Yayılma kromozoma bariz bir eksiklik yayma işlemi ilgi yapısını bozan kısmen veya tamamen ihtimalidir. Özellikle endişe, belirli bir kromozom bağlı protein yayılan prosedürünün bir sonucu olarak kaybedilebilir olmasıdır. Bu potansiyel komplikasyon shouveri yorumlanırken ld akılda tutulmalıdır. Yayılma prosedüre karşı duyarlı olan bir proteinin bir örneği, beta-tubulin olup. Bazı koşullar altında, esas olarak tübülin oluşan mili, ³ yayılması sırasında korunur. Milin Görselleştirme genellikle ilgi çekirdeklerini sahne yararlıdır. Bununla birlikte, tubulin görselleştirme yüksek bir konsantrasyon sabitleyici tedavi gerektiren; iğ, aşağıda tarif edilen standart koşullar altında kaybolur. Bu örnek, daha önce uncharacterized proteinin dağılımını analiz ederken, bu proteinin böyle varyasyon ne kadar duyarlı belirlemek için sabitleştirici konsantrasyonunu değişir önemli olduğunu göstermektedir. Kromozom yapısına yayılan koşulların etkilerine ilişkin endişe rağmen, yayılma yöntemi yarar ve güç pek çok bağlamda gösterdiler ve mitoz karakterizasyonu ve özellikle mayotik hücreleri ^4-7 geniş yarar sahiptir.

Two yayma yöntemleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Dresser ve Giroux'nun ⁸ tarafından geliştirilen bu yöntem, ilk olarak, deterjan kullanımını önler ve DNA spesifik boya DAPI lekeli göreceli olarak iyi korunmuş morfolojisinin sahip gibi görünmektedir yayılmış preparatları elde edilebilir. Bununla birlikte, bu yöntem, mükemmel nispeten zordur ve bir sürgünün bir bölge, diğer bölgelere kıyasla zaman yayılmış çekirdeğin kalitesi, önemli ölçüde değişir. Bu sorun veri toplama önyargı önlemek için, bir slayt birçok seçilmemiş çekirdekleri görüntüleme içeren kantitatif yaklaşımların karmaşık hale getirebilir. Loidl ve Klein ¹ tarafından geliştirilen yöntem yayılan ikinci kromozom, lizis ve deterjan çözeltisi tarafından teşvik kromatin dekompresyon ile, paraformaldehid ile fiksasyon dengeleme içerir. Düzgün yapıldığında, bu yöntem Dresser ve Giroux yöntemine göre daha az bölge için bölge varyasyon ile çok tekrarlanabilir sonuçlar verir. Bu sunum, bir tadil odaklanırnedeniyle güvenilirliğe ve sadeliğe sahip Loidl ve Klein yöntemine d versiyonu.

Kromozom yayma karmaşık ya da zaman alıcı değildir; 100'e kadar slaytlar tek bir gün içinde immün için hazırlanmış olabilir. Ayrıca, yayılma hazırlıkları öncesinde immün yıllarda dondurucuda saklanabilir ve böylece laboratuarları yeni biyolojik sorular ortaya ya da yeni boyama reaktifleri kullanılabilir hale kullanılabilen donmuş kromozom yayılır bir depo gelişebilir.

kromozom yayma yöntemi en sık immün ve widefield floresan mikroskobu ile birlikte kullanılır, ancak bu tür uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskopi olarak süper çözünürlüklü ışık mikroskobu yöntemleri için slaytlar hazırlamak da mümkündür olduğunu.

Protokol

NOT: Protokol bazı adımlar aşağıda temiz bir davlumbaz çalışma gerektirir. Buna ek olarak, yöntem spheroplasting izlemek için bir 10X uzun çalışma mesafesi hedefi ile donatılmış bir maya tetrad diseksiyon mikroskobu gerektirir. mikroskop vaktinden kaputu kurulmalıdır. Kapsamından mikromanipülatör kol ve plaka tutucu çıkarın ve çalışma alanından uzakta güvenli bir yerde bu öğeleri koyun.

Spheroplastlar hazırlanması 1.

1. İstenen şartlar altında mayayı büyütün. OD600 1.4 = 5 x 10 ⁷ hücre / ml'de her bir örnek için yaklaşık 2 x 10 ⁸ hücreleri, örneğin, bir kültürün 4 ml kullanın. Numunelerin anında işlem, bazı durumlarda tercih edilebilir olsa da, bir çok uygulama için, hücre alikotları işlemden önce en fazla 8 saat süre ile buz üzerinde saklanabilir.
2. Pelet hücreleri 3 dakika boyunca 5 (2345 rpm / 857,5 xg) ayarlayarak bir klinik santrifüj cihazında bir 15 ml santrifüj tüpüne ve spin hücre süspansiyonu aktarın.
3. Pelet hücreleri kaybetmek değil orta alarak dikkat Durusu. Yavaşça 1 mi ZK tampon içinde tekrar süspansiyon hücreleri ve daha sonra 40 ul 1 M ditiyotreitol (DTT) ilave edin. Yumuşak bir karıştırma ile 2 dakika kuluçkalayın. Pelet hücreleri daha önce olduğu gibi (adım 1.2).
4. 1 mi ZK tamponu içinde yeniden süspanse peletler. İyice karıştırıldıktan zymolyase 100T taze hazırlanmış bir çözeltisine 5 ul ekle. Hücre duvarı çıkarın ve sferoplastlar üretilmesi için 30 ° C sıcaklıkta 20-30 dakika boyunca inkübe edin.
5. Spheroplasting tam olup olmadığını belirlemek için bir mikroskop lamı üzerine hücre süspansiyonu, 10 ul damlacık testi. Bir lamel olmadan diseksiyon mikroskobu altında incelendi hücreler. Hücreler, şişirilmiş ve yuvarlak yerine hafif dikdörtgen görünür ve su 20 ul ilave edildikten sonra lize gerekir. Hücreler lize başarısız olursa, su kaynaklı lizis kolaylıkla gözlenene kadar her 10 dakikada bir, 30 ° C örnek dönmek ve yeniden deney. Pelet hücreleri daha önce olduğu gibi (adım 1.2).
6. Yavaşça tekrar süspansiyon ve hücre pelet i yıkayınn, 2.5 ml soğuk MES / sorbit tamponu. Pelet hücreleri daha önce olduğu gibi (adım 1.2). Yavaşça 300-400 ul soğuk MES / sorbitol tampon içinde hücre pelletini. Hücreler, bir kaç saat için bu aşamada buz üzerinde tutulmalıdır.

Yayılma 2. Kromozom

NOT: kromozomlar-yayılmış ya slayt veya edilecek bunun üzerine cam yüzeyler lamelleri-gerekir vaktinden önce hazırlanacak. Her slayt veya lamel suya edilmelidir ardından EtOH, sonra kurumaya bırakılır ve objektif kağıdı ile parlatılır. Kromozomlar lamelleri üzerine yayılır edilecek ise, lamel Scotch bant veya kauçuk çimento ile slayt yapıştırılmış olmalıdır. Aksi belirtilmedikçe, protokolün geri kalanı ya bir slayt veya lamel yayılmasını anlatacağız

1. Temiz bir slayt yüzeyi üzerine bir P20 pipet, pipet hücre süspansiyonu 20 ul kullanılması.
2. P200 pipet kullanarak,% 3 PFA / sukroz çözeltisi 40 ul ve hafifçe Solutio karıştırınSchlieren hatları kayboluncaya kadar elle slayt "dönen" ile n. Mikroskop altında slayt yerleştirin ve hücreler odakta olduğunu onaylayın. PFA çözeltisi kullanım gününde davlumbaz taze hazırlanmış olmalıdır.
   NOT: İlgili protein önceden yöntemiyle incelenmiş değilse, bu proteinin tutma sabitleme koşullarına duyarlı olup olmadığını belirlemek için 2 ve% 4 PFA içeren solüsyonlar kullanarak ek slaytlar hazırlamak için tavsiye edilir. % 4 PFA / sukroz çözümü ilişkili tübülin mikrotübül görselleştirmek için arzulanır olduğu durumlarda kullanılmaktadır. yüksek sabitleyici konsantrasyon dezavantajı kromozom olacağıdır "underspread,"% 2 PFA aynı zamanda "underspread" kromozom elde etmek eğilimindedir.
3. P200 pipet kullanarak, tamamen mümkün olduğunca çözüm karıştırmak için önce girdap, bir zamanlayıcı başlatmak,% 1 Lipsol 80 ul ekleyin. Lipsol mevcut değilse, 80 ul% 1 NP40 ve 80 ul dH ₂ O olabilir(Şekil 2 Temsilcisi Sonuçlar bakınız) ikame.
4. Kayıcı her 15 saniyede girdap dikkatlice ve yavaşça hücrelerin izleyin. Hücrelerin kabaca% 80'i parçalanmış zaman, hemen mikroskop slaytı kaldırmak, Sayacı durdurmak PFA / sakaroz çözeltisi 80 ul ekleyin ve girdap karıştırmak için (kayboldu). Lizis zamanlayıcı başladıktan sonra 30 ila 90 sn gerçekleşmelidir.
   NOT: Birkaç slaytlar yaklaşık aynı zamanda lizizini göstermek ise, bir sonuçta slaytlar kalanı için mikroskobik izleme ihmal ve sadece dikkatle lipsol ve fiksatif son kısım ilave eklenmesi arasındaki süreyi zaman olabilir. Aynı örnekten birden slayt hazırlarken Ancak, bu kısa yol, sadece güvenilir. Farklı slaytlar farklı zamanlarda alınmış örneklerden veya farklı kültürlerden hazırlanır zaman mikroskobik her numunenin lizizine izlemek için en iyisidir.
5. Temiz, düz bir yüzey üzerine slayt yerleştirin ve tüm çözülmesi sağlandığında Surfac boyunca sıvı yaymak"su birikintisi" menisküs altında ama yani slayt kendisi yüzeyi üzerinde düzenlenen bir temiz, tek Mera pipet tarafı kullanarak slayt e. pipetle slayt yüzeyini "komisyon" yoktur. Numunelerin kirlenmesini önlemek için farklı slaytlar üzerinde pipetlemeyin tekrar kullanmayın.
6. Davlumbaz gece kurumaya bırakın slaytlar. Çözülmeyen nükleer bileşenler slayt yüzeyine yerleşmek ve ona bağlanacaktır. Büyük deneyler için, kurutma aşaması için alanı kullanımını planlama çok önemlidir.
7. Bir kez kurutulduktan sonra, en iyi sonuçlar aynı gün immün aşamasına ilerlemektedir ile elde edilir. Ancak, kurutulmuş sakaroz çözüm örneklerinin donmasını sağlayan bir "bal" in yayılması kromozomları gömer: slaytlar plastik slayt kutusuna aktarılır ve yıllarca -20 ° C'de saklanabilir.

3. immün

1. 30 sn% 0.2 Fotoğraf-Flo Dip slaytlar. bal kaldırmak için. Yalın slaytlarBir kenar, kenar bir kağıt havlu üzerine dayayarak, rezidüel Foto-Flo kaldırın.
2. 5 dakika boyunca 1x TBS Dip slaytlar yıkayın. Bir kenarda slaytlar yaslanarak fazla sıvıyı çıkarın, ama onları kurumaya izin vermeyin.
3. Yan yukarı, pipet 300 ul TBS / BSA slayt çözülmesi sağlandığında kısmı boyunca slayt üzerine buzlu slaytlar yatırın.
4. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında bir nem odasında inkübe edilir. (Doymuş kağıt havlu ile bir delikli metal plaka veya plastik slayt kutusunun altında suya doygun kağıt havlu ile kaplı büyük plastik kap).
5. Bir kağıt havlu üzerine slayt bir kısa kenarı dinlenme ve (örneğin bir test tüpü raf gibi) uygun bir destek karşısında slayt eğilerek slaytlar boşaltın. Yüzey kurumasına izin vermeyin.
6. Hemen birincil antikor, uygun bir seyreltme içeren TBS / BSA tamponu 80 ul uygulanır. Antikor sınırlayıcı ise, 40 ul ve 22 x 22 mm'lik bir örtücü cam kullanılır. Ham tavşan serumu için, bu tipik olarak, bir 1/50 ve 1/500 seyreltme arasındadır.
   NOT:Yeni antikor hazırlıkları için titrasyonları gerçekleştirin. arka plan üzerinde yüksek sinyal verir en inceltilmiş hazırlık seçilir. Bağışıklık-öncesi serumu ile boyanmış olmalıdır arka plan boyama düzeyi kontrol etmek için, çekirdekler, uygun silme mutant ve / veya çift slaytlar hazırlanmalıdır.
7. Kabarcıklar kaçınarak slayt üzerinde cilalı 22 x 50 mm lamel yerleştirin. Kısa bir kenarına yakın pozisyonlarda uzun kenarından başparmak ve işaret parmağı arasında lamel tutarak bunu yapın. 30 ° açıyla lamel Holding sadece "su birikintisi" slayt buzlu bölgeye yakın kenarına iç slayt üzerinde oturana kadar parmakları kısa kenar uzak düşer, slayt. Sonra yavaş yavaş slayt dokunmatik tezgah tutan parmakları kadar pürüzsüz bir hareket lamel düşürmek ve sonra bırakın. O topraklarda bir zamanlar lamel konumunu ayarlamak için çalışmayın.
   NOT: kromozom yayılır hazırlanmış olsaydıyapıştırılmış lamelleri (ziyade direkt olarak slaytlar yüzey), bu örnek lamel boyama ve yıkama aşamaları boyunca slayt yapıştırılmış kalır. Ek bir lamel boyama ve daha sonra atılır boyunca eşit bir şekilde antikor çözüm dağıtmak için örnek lamel üzerine yerleştirilecektir.
8. Sızdırmaz şekilde kapalı bir nemli oda içinde yer slaytlar ve 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.
9. Bir cam slayt boyama rafa buzlu kenar aktarım işlemlerinin slaytları Holding ve TBS içeren bir boyama kavanoz daldırın.
10. Yavaşça lamel kaldırmak için yukarı ve aşağı slayt batırın. Bunu yapmak için çok fazla kuvvet kullanmaya çalışıyorum. TBS daldırarak 10 dakika 2x slaytlar yıkayın. Raftan slaytları çıkarın ve kağıt havlu kenarı dokunarak fazla sıvıyı boşaltın. Yüzey kuru izin vermeyin.
11. Işık altında altında çalışan hemen 80 ul TBS / BSA florokrom konjuge sekonder antikor (ya da 22 x 22 mm'lik bir örtücü cam, 40 ul) içindeki bir 1 / 1,000 kat seyreltme içeren ekleyin. Ilanve daha önce olduğu gibi D lamel karanlıkta nemli oda içinde 2 saat süre ile 4 ° C'de inkübe edin.
12. , Daha önce olduğu gibi lamelleri çıkarın slaytlar drenaj ve karanlıkta 1 ila 2 saat boyunca havada kurumaya yüzey sağlar. Daha önce olduğu gibi kağıt havlu üzerinde Yalın kayar.
    NOT: yayılan monte lamel gerçekleştirildi ise, kurumadan slayt lamel ayırın. Önceki adımda slaytlar için tarif edildiği gibi lameller daha sonra kurutulur.
13. Bastırılmış ışık altında çalışan, DAPI (üç 10 ul damlacıkları) içeren orta montaj yaklaşık 30 ul ekleyin ve sonra dikkatli bir şekilde lamel indirin. Formalar lamelleri üzerinde ise, temiz bir slayt üzerinde montaj orta damlacıkları yerleştirin ve slayt üzerine aşağı lamel, kromozom tarafını indirin.
14. Hala bastırılmış ışık altında, yerleşmek ve net oje ile lamel kenarları mühür için lamel için 2 dakika bekleyin. Düz slayt kutusunda slaytlar yerleştirin.
    NOT: STED mikroskopi için, uzatmak Gold ile monte edilir. Uzatmak Altın 30 ul kullanınve DAPI olmadan gecede tedavi için izin verir. Oje ile sızdırmazlık gereksizdir.
15. 40 veya 100X amacı DAPI odaklanmak için uygun ayarlanmış bir filtre kullanarak widefield Epifloresans mikroskobu ile Görünüm slaytlar. İsteğe bağlı olarak, birkaç hafta boyunca 4 ° C'de karanlıkta slayt saklayın. Donma yok.

Sonuçlar

yayılmış çekirdeklerinin görünümü eleştirel kromozom tespit ve de-sıkıştırma arasındaki dengeye bağlıdır. Reaktifler düzgün dengeli bile, kromozom de-sıkıştırma derecesi değişim ve / veya farklı slaytlar arasında aynı slayt değişik bölgelerinde meydana gelebilir. Görüntüleri yorumlanır önce Böylece, bir slayt belirli bir bölgedeki formaların kalitesi değerlendirilmelidir.

"overspreading" ve "underspreading" etkileri öz değişmesine ait rekombinasyon proteinlerine karşı ant...

Tartışma

Yayılmış çekirdeklerin görünümü kritik olarak fiksasyon ve lizis/deterjan işlemi arasındaki dengeye bağlıdır. Yukarıda tartışıldığı gibi, değişen hücresel yapıların korunması, farklı PFA konsantrasyonlarının kullanılmasını gerektirir. Çoğu protein için %3 PFA optimaldir. Bununla birlikte, iğlerin korunması %4 PFA kullanımını gerektirir. Tek bir reaktif seti ile bile, fiksasyona göre lizis zamanlaması da yayılan çekirdeklerin kalitesini etkileyebilir. En tutarlı sonuçlar için, lizisin bir ışık mikroskobu ile doğrudan g...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Zymolyase	US Biyolojik	Z1004	% 2 glikoz ile desteklenmiş 50 mM Tris pH 7.5'te 20 mg / mL çözelti hazırlayın. Her deneyi taze hazırlayın ve 4 ° C'de saklayın; Kullanıma hazır olana kadar C.
Lipsol	L.I.P. Ltd	artık ticari olarak mevcut değil	Suda %1 (h/h) çözelti hazırlayın. Buz üzerinde saklayın.
NP-40	USB	19628	Suda %1 (h/h) çözelti hazırlayın. Buz üzerinde saklayın.
Tween 20	Sigma	P2287
Slaytlar	Corning	2948-75x25
Standart lamel	Fisher	12-544-E veya 12-540-B
Yüksek çözünürlüklü lameller	Fisher	12-542-B
Photo-Flo 200 solüsyonu	Kodak	P-7417	Suda %0,2 (h/h) solüsyon hazırlayın.
TBS			137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8
BSA	Sigma	A2153	TBS'de% 1 (a/h) çözelti hazırlayın. 4 derecede saklayın; Bir aya kadar C.
Birincil antikor
Alexa Fluor 488 Eşek Anti-Tavşan	Invitrogen	A-21206
IgG (H + L) DAPI
Vectashield montaj ortamı	Laboratuvarlar	H-1200
ProLong Gold	Invitrogen	P36930
Plastik kayar kutu	Fisher	03-448-1	Kurutulmuş sürülebilir ürünler içeren slaytları -20 ° C'de yuvalarda saklayın. Ayrıca, ıslak bir oda olarak kullanın.
Karton kayar kutu	Fisher	12-587-10	Lekeli/mühürlü slaytları rahatça taşımak veya 4 ° C'de saklamak için kullanın.
Coplin kavanoz	Fisher	08-816	Kaydıraklar için lavabo olarak kullanın.

Vector ile Antikor