Method Article

Kolon Kök Hücre Mutasyonların Kantitasyonu

DOI:

10.3791/53240

⸱

September 25th, 2015

 , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Pittsburgh

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farelerin potansiyel DNA zarar verici ajanlara maruz kalmasından sonra somatik kolonik kök hücre mutasyonlarının tekrarlanabilir ölçümü için önemli gelişmeler bildiriyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kök hücre mutasyonları ölçmek için yeteneği, kimyasal potansiyel kansere yol mutasyonlar neden olabilir eğer ve ne ölçüde eleştirel bir hücre popülasyonu ölçmek için güçlü bir araçtır. X-bağlantılı glikoz-6-fosfat dehidrojenaz geni kök hücre mutasyonlan ölçmek için bir enzim testi kullanımı daha önce bildirilmiştir. 1 Bu yöntem, bir veren bir reaksiyon karışımı ile kesitli doku dondurulmuş bölümleri ve inkübasyon hazırlık gerektirir Hücreler fonksiyonel glikoz-6-fosfat dehidrogenaz (G6PD) enzim üreten eğer mavi renk. Eğer değilse, hücreler beyaz görünür. Bu polivinil alkol yerine optimal kesme sıcaklık Bileşik (Ekim) ortamı kullanılarak reaksiyon karışımı olarak var. Bu pH ölçme kolaylaştırır G6PD boyama bileşenlerin çözünürlüğünü arttırır ve G6PD enzimin yayılmasını engellemektedir. Bir mutasyonun kök hücre meydana geldiğini göstermek için, tüm kript G6PD enzimatik yoksun olmalıdırfaaliyet. Bir kök hücre barındıran Sadece eğer bir fenotipik G6PD mutasyon crypt döl tüm G6PD enzimatik aktivitesini yoksun olacak. Kök hücre mutasyonu olan crypts belirlemek için, arka arkaya dört bitişik dondurulmuş kesitler (seviye) 7 um kalınlığında kesildi. Bitişik kesim yapma Bu yaklaşım, aynı mutasyona uğramış crypt bitişik bölümlerde görüleceği beri crypt tam mutasyona edildi uymasını sağlar. 50'den fazla um ayrı olan doku örnekleri ile slaytlar fare başına> 10 4 crypts toplam değerlendirmek için hazırlanmıştır. Mutasyon sıklığı tedavi grubunda yabani tip (mavi) kript sayısına göre ÷ gözlemlenen mutasyona uğramış (beyaz) kript sayısıdır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolon kanseri DNA zarar verebilir çevresel ajanlar ve diyet bileşenlerin etkilenmemesi içerir ve (örneğin, APC), tümör baskılayıcı genler mutasyonları onkojenler somatik mutasyonlar aktive (örneğin, ß-katenin) ya da inaktive üretmek düşünülmektedir. Bu kritik mutasyonlar kolon kök hücrelerinde meydana geldiği kabul edilir. Çünkü kolon epitel eşsiz kript mimarisi, bu kolon kanserinin ilişkili kimyasallara maruz hayvanların sonra kolonda kök hücre mutasyonları ölçmek mümkündür. Mutasyonlar, bir kript içinde tüm hücrelerde mevcut olacak şekilde çeşitli X-bağlantılı enzimler, kök hücrelerin meydana mutasyon için gösterge olarak görev yapabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deney prosedürleri ve hayvanların etik tedavi Pittsburgh IACUC Üniversitesi (protokol # 1104674) tarafından onaylanmıştır.

G6PD Boyama karışımının hazırlanması 1.

NOT: Her birinin reaktiflerin nihai konsantrasyon olduğunu temin etmek; 5 mM glikoz-6-fosfat (G6P); 2 mM NADP, 5 mM MgCl2, 0.35 mM 1-metoksi-5-methylphenazinium metil sülfat (MMPMS) ve 0,8 mM NBT. Başlangıç ​​konsantrasyonu, 40 ml'lik bir nihai hacim için elde edilmiştir, her bir reaktif için 1,8,9. Çözümler, taze hazırlanmış ve her gün kullanıldı.

  1. 50 ml'lik bir tüp içinde Ekim ortamı 35 ml 200 mM pH 7.4 fosfat tampon maddesi (PB)....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvanlarda kolon kök hücre mutasyonlarını ölçmek için yeteneği kanser indüksiyon mutasyonlar ilişkilendirmek için özel bir yol sağlar. Normal olarak, bu karsinogenezde önemli bir adım onkojenlerde mutasyonlar aktive edilmesi ve / veya tümör süpresör genler mutasyon inaktive içerir varsayılmıştır. Biz 200 ul PBS ya da PBS 200 ul 10 mg / kg AOM ile C57BL / 6 fareler enjekte edildi. AOM bilinen kolon kanserojendir. Kolonlar kök hücre mutasyonları için analiz edildi 90 gün sonra 5-7. Bu kez kök hücreler tamamen .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genellikle bir bileşimin genotoksik etki DNA değiştirme kabiliyeti tarafından belirlenir. Bu, normal olarak doku izole DNA adduct küresel seviyesinin ölçülmesiyle yapılır. AOM için bu kolonda Ø 6 -methylguanine aduktlar miktarının içerecektir. Böyle kök hücre niş gibi özel hücre tipleri, içinde hasar bu yaklaşım bilgileri kullanarak, kaybolur. Adüktlerinin sadece küçük bir alt grubu sonunda sabit mutasyonlara dönüştürülür Ek olarak, bir DNA adükt mutasyon ile aynı değildir. Bu 12 tekrarlanabilir Gr.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir onayları vardır.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
reaktifler
nitromavi tetrazolyum
NADP
glikoz-6-fosfat
1-metoksi-5-metilfenazinyum metil sülfat
dimetil formamid
fosfat tamponu (pH 7.4
Optimum Kesme Sıcaklığı Bileşiği (OCT) 
ekipman
sıcak oda 
5 megapiksel kamera kriyostat ile donatılmış ışık mikroskobu

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry. Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).
  2. Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Colonic Stem CellsG6PD MutationMutation FrequencyFrozen SectionsEnzymatic AssayOCT MediumLight MicroscopyCrypt AnalysisSomatic MutationsStem Cell Quantification

Related Articles