Çok renkli Floresan Reporter Fare kullanma Kornea Hücre Lineage İzleme Bir Yöntem

Özet

Bu makalede, R26R-Confetti fareleri kullanarak çok renkli bir soy izleme deneyi tasarlama ve gerçekleştirme ilkelerini açıklıyoruz. İlgilenilen diğer dokular için modifiye edilebilen kornea epitel hücrelerinin izlenmesi için özel bir protokol sunuyoruz.

Özet

Soy izleme deneyleri, belirli bir doku veya organizmadaki hücrelerin kökenini, kaderini ve davranışını tanımlar. Bu teknik, onlarca yıldır başarıyla uygulanmakta ve gelişim biyolojisinde ufuk açıcı bulguları ortaya koymaktadır. Daha yakın zamanlarda, kök hücre biyologları tarafından minimum deneysel müdahale ile farklı kök hücre popülasyonlarını tanımlamak ve izlemek için benimsendi. Fare genetiğindeki son gelişmeler, çok sayıda fare suşunun mevcudiyeti ve floresan mikroskobundaki gelişmeler, ticari olarak mevcut araçları kullanarak, temel uzmanlığa sahip çeşitli dokular için güçlü soy izleme sistemlerinin basit bir şekilde tasarlanmasına olanak tanır. Yakın zamanda, R26R-Confetti faresi kullanarak oküler yüzeydeki kök hücrelerin kökenini ve kaderini keşfetmek için bu güçlü metodolojiden yararlandık. Bu model, 4 floresan genin rastgele bir şekilde ekspresyonu için çok renkli bir genetik sistem sunar. Burada, bu metodolojinin ilkelerini açıklıyoruz ve soy izleme deneyleri tasarlamak için uyarlanabilir bir protokol sağlıyoruz; özellikle kornea epiteli ve diğer dokular için.

Giriş

Embriyo gelişimi sırasında, doku ve organ morfogenez hücre proliferasyonu, hücre göçü ve soy tarifnamede ^1-4 cinsinden tanımlanabilir kesin bir program sayesinde yer almaktadır. Bu biyolojik süreçler de hücre yenilenmesini kök gerektirir yetişkin doku homeostazını, muhafaza katılmaktadırlar. Lineage izleme, kimlik ve hücre popülasyonunun belirli bir tip soyu takibi, embriyojenezi okuyan ve hücre homeostazı kök için önemli bir araç sunmaktadır. Gerçekten de, giderek araştırmanın pek çok alanında kullanılmaktadır. Özellikle, soy izleme homeostasis ve kanser gelişiminde kökeni ve kök hücrelerin kaderini belirlemede önemli bir araç haline geldi. Hücre izolasyonu ve in vitro kültürü veya transplantati içinde aksine minimal deneysel müdahale ile hücre sağlam doku veya organizmanın bağlamında nasıl davranacağını hakkında önemli bilgiler sağlayabilir Bunun nedeniBu istenmeyen önyargı neden olabilir.

Geleneksel olarak, hücrelerin plazma zarına dahil, lipid çözünür karbosiyanin boya olarak, soy izleme için kullanıldı. Deneylerde bu tür başarılı gelişim biyolojisi ^5,6 önemli keşifler ve şekilli seminal kavramlara yol açmıştır rağmen, hedeflenen hücrelerin özgünlüğünü kontrol etmek için zorluk, hücre davranışı üzerindeki boyanın istenmeyen etkisi ve seyreltme dahil bazı sınırlamalar var zaman etiketi. Nükleotid analog etiketleme yaklaşımları muhtemelen kök hücreleri ^7,8 sakin koşullarda uygun "etiket istinat hücreler" yavaş bisiklet varlığını belgeleyen sağlamıştır. Bu tekniğin sınırlı bir süre boyunca çoğalma kinetiği dayalı yavaş bisiklet hücrelerinin varlığını göstermek olabilir Bununla birlikte, bu kök hücrelerin işlevselliğini ilgili önemli anlayışlar temin edemedik. Optimal soy izleme metduğu işaretli hücrenin kendi döl veya komşularının özelliklerine etiketleme etkisini en aza indirmek gerekir. Ayrıca, bir sahne ve zamana bağlı bir şekilde de yanı sıra tek bir hücre (klonal) şekilde ilgi hücre popülasyonu etiketlemek yeteneğine sahip, yani etiketleme indüksiyon kontrole sahip yararlı olacaktır. Etiket zamanla muhafaza ve komşu hücrelere transfer değil olacağını, böylece kurucu hücrenin tüm soyu aktarılır İstikrarlı ve geri dönüşümsüz etiketleme yöntemi çok önemlidir.

Daha yakın zamanlarda, hücre etiketleme genetik yaklaşımlar geliştirilmiştir. Bu sistemlerde, hücre spesifik promotörler, yeşil fluoresan protein ya da Β-galaktosidaz raportör genler gibi muhabir ^9-13 genlerinin ifadesinin loxP-çevrili barikat çıkarın ve izin vermek için, Cre rekombinazın ifadesinin tetiklemek için kullanılabilir. Bu yaklaşım, sadece hücreler ve onların döl takibini mümkün kılan, aynı zamanda hücre izinolation ve moleküler karakterizasyonu. Tek hücre düzeyinde hücre takibi, tek bir floresan haberci genin ifadesinin indüksiyonu yoluyla mümkün hale geldi. Bu sistemin önemli bir sınırlama hücrelerinin çok düşük bir yüzde, ayrı ve tek tek klonlar izlemek mümkündür etiketli tek bir gerçektir. Renkli gazetecilere kullanılabilecek bu sınırlamayı aşmak için. Renkli etiketleme kullanırken, aynı niş komşu hücrelerin diferansiyel kaderin izleme verimli ^14-17 elde edilebilir. Son zamanlarda, Brainbow (Br) alel çeşitli Cre / lox sistemi kullanılarak birden çok flüoresan raportör genlerin stokastik ifadesine imkan tanır, soy izleme deneyleri için geliştirilmiştir. Cre / lox sistemi algılar ve loxP sitelerinin gibi özel DNA dizilerine bağlanan Cre rekombinaz enzimin oluşur. Aşağıdaki Cre rekombinazın bağlanması site spesifik rekombinasyon oluşur loxP çıkarılması çevrili dizileri yolaçan neden olanFarklı floresan proteinleri rastgele ifadedeki g (mekanizması, aşağıda tarif edilmiştir) hazırlandı. Br hatlarının çeşitli (Değerlendirmeler ^16,18,19 bakınız) kullanım için mevcuttur. Br suşları arasında büyük farklar 2 (Br 2,0), 3 (Br1.0) 4 (Br1.1, Br2.1) flüoresan genler arasında değişen, kaset dahil flüoresan genlerin sayısı (i) farklılıklar, , (ii) karşılıklı yönlendirilmiş lox mevkisi varlığı kullanılan lox mevkisi (iii) tipi, ve (iv) sentezleme veya floresan gen ekspresyonunun sessizlik önce Cre aktivasyonuna gen inversiyon (Br2.0-2.1) izin vermek. Yeni kurulan Br3 nöronların renkli görüntüleme için geliştirilmiş bir yöntem sunmaktadır. Bu transkript ana özelliklerinden biri en iyi nöronal eşit bir boyama ²⁰ süreçleri sağlayan ışığa farnesillenmiş floresan proteinleri, bir dizi yeni içermesidir.

Önemlisi, Br kasetlerinin farklı sürümleri Thy1 pr nöronal özgü içerebiliromoter veya ubiquitously CAG (CMV) promoteri dile getirdi. Br transgenik farelerin bazıları tek Br transgen içerebilirken Son olarak, diğerleri, böylece, her hücrede eksprese edilecek renk kombinasyonları olasılıklarının muazzam sayıda üretilmesini sağlayan, birden fazla transgen kopya içerebilir (örneğin ^16).

Çalışmamızda, biz Br 2.1 kaset ²¹ içeren R26R-Konfeti fare kullanıldı. Br2.1 benzersiz Cre-aracılı DNA inversiyon nedeniyle loxP sitelerinin (Şekil 1) karşılıklı doğrultuda değil, sadece eksizyon izin verecek şekilde tasarlanmıştır. Böylece, renk değişikliğine yol bu inversiyon / eksizyon olayları sürece Cre ¹⁶ mevcut olduğu gibi devam edebilirsiniz. Bu nedenle, bir indüklenebilir zamansal Cre sentezleme sistemi güvenilir hücre izleme Br2.1 kullanmak için gereklidir. Şekilde gösterildiği gibi,. 1, Br2.1 loxP-çevrili Neo ^R -casse ardından her yerde bulunan bir CAG promotörünü içerirbir transkripsiyon birlikte gösterim olarak hareket tte, iki tandem konumlandırılmış san bir yeşil için 4 flüoresan raportör genlerin kodlama (GFP), (YFP), kırmızı (RFP) ve mavi (CFP) floresan proteinleri takip eder. Resim floresans Cre aktivasyonu öncesinde ifade edilir. Cre rekombinazın indüksiyonu, belirli bir hücre içinde 4 floresan proteinleri bir rastgele ekspresyonunu sağlayan Neo-R kasetinin giderilmesini de sağlar. İkinci bölüm loxP-çevrili RFP ve ters CFP içerirken ilk parça, loxP-çevrili GFP ve ters YFP içerir. Bu DNA segmentleri sürekli sürece, Cre rekombinaz mevcut olduğu, (ters yönlenmede olduğunda loxP kullanılarak) ters veya çıkarılabilir. Bu nedenle, geçici ve kontrollü Cre transgen kullanılmalıdır. YFP ekspresyonunu ve RFP sitoplazmiktir, GFP, nükleer ve CFP hücre membranına bağlanır: Br2.1 kaseti sinyal konumuna bağlı örtüşen emisyonlar arasında ayırt etmeye yönelik mükemmel bir sistem sağlar. GFPve RFP emisyon kolayca geleneksel fluoresan mikroskobu ile ayrılır. YFP / GFP / CFP emisyon ayırmak amacıyla, bir spektral konfokal görüntüleme sistemi gereklidir. Toplamda, Br2.1 kaset hedeflenen her hücrede dört takım farklı floresan genlerin rastgele indüklenebilir ve doku spesifik ifadesini verir. Renk kombinasyonları daha büyük bir sayı gerektiğinde Aslında, bir bu şekilde her hücre için 2 renkli etiketleri sentezlenmesi ve 10 olası renk kombinasyonların sayısını artırmak sonuçlanan Br2.1 2 alellerini içeren homozigot fareler üretebilir Kasetin birden çok kopyası genomları ¹⁶ entegre çünkü ^22. Br fare suşlarının bazı olası renk kombinasyonları çok daha büyük bir sayısının ifadesini mümkün kılar. Bununla birlikte, çoğu durumda, tek bir Br2.1 alel tarafından temin edilen, dört renk kombinasyonları yeterlidir. Burada sağlanan protokol izlenerek, tek bir spectr nispeten basit bir düzeneği kullanılarak, bu yöntem kurabilirKalibrasyon için çok az, eğer herhangi bir ihtiyacı ile al mikroskopi.

Burada korneal epitelyumun soyu takip deneyler için, tek bir Br2.1 alel ihtiva R26R-Konfeti farelerin kullanım için uyarlanabilir bir protokol sağlar. Bu transgenik fare suşu kolon ^21,23 ve kornea epitel kök hücrelerin ^22,24 kökeni ve kaderi çalışmak için kullanılır olmuştur, ve fokal segmental glomerüloskleroz böbrek Podosit vasıflandırılması için bağırsak kanserine ²⁵ kök hücre aktivitesinin varlığı (FSGS) ^17.

Protokol

Etik Beyanı: Bu çalışmada hayvan bakımı ve kullanımında Oftalmik ve Vizyon Araştırma Hayvanların Kullanım ARVO tablosuna conformed bulundu. Tüm deneyler, yerel etik kurul tarafından onaylanmıştır.

Fare ve Strain ifade bir Uygun Cre-recombinase seçin 1.

1. Araştırılması için satın alma ²⁶ ve hedeflenen dokuya bağlı olarak kullanılabilir Cre transgenik hatların çok çeşitli dışında, Cre rekombinaz gen, ilgi konusu doku için spesifik olan bir promoter tarafından kontrol edildiği bir transjenik fare suşu Cre seçin. Olgu zamansal kontrol gereklidir ise, indüklenebilir Cre satırını seçin.
   Not: Biz özellikle limbal ve kornea epitel kök / progenitör hücreler ²⁴ etiket tamoksifen indüklenebilir K14-Cre ^ERT transgen seçti. Di Girolamo ve arkadaşları onların K1 için kornea ifade ile limbal özgüllük bildirdiği gibi, suşları arasında farklılıklar olabileceğini unutmayın4-Cre ^{ERT 22.} Indüklenebilir transgenik fareler Cre kullanarak bir avantajı çok yönlü zaman dilimlerinde de izleme soy uyarılmasını izin vermesidir.

2. Uygun Br Fare Gerinim seçin

1. Araştırma sorusu ve mevcut Cre hat ^16,18,20 bağlı olarak uygun Br kasetini seçin.
   1. Olmayan bir uyarılabilir Cre fare suşu kullanıldığında, sürekli bir DNA inversiyon / eksizyon izin ve böylece ¹⁶ (örneğin Br1.0 ya Br1.1 için) kör uçlu ürünlere neden olmayan bir Br kaseti seçin.

3. İlgi Transgenik Hatları Çapraz

1. Burada gösterilen protokolü için, hemizigot Yavrularda elde etmek için homozigot Cre ^ERT suşu (Cre ^ERT / Cre ^ERT) ile homozigot R26R-Konfeti zorlanma (Br2.1 / Br2.1) çapraz (Br2.1 / +; Cre / +) mono-allelik hepsi tek bir Br2.1 alel ihtiva olarak izleme soy ve hazır olduklarınıTek Cre alel.
   Not: bir iki Cre allel (Br2.1 / +; Cre / Cre) içerebilir fareler yaratacaktır etiketleme verimliliğini artırmak için, süre iki Br2.1 aleli (Br2.1 / Br2.1; Cre / +) olur ⁽²² ayrıntılı olarak) renk kombinasyonları artar.

4. kre-rekombinazı İndüksiyon

Not: Bu deneylerde Tamoksifen uygulanması limbal ve korneal bazal K14 pozitif kök / progenitor çekirdeği içine Cre rekombinazın ^ERT translokasyonunu teşvik etmek için, 3-4 günlük bir süre için, günlük intraperitoneal enjeksiyon ile gerçekleştirilmiştir epitel hücreleri. Aşağıdaki protokol dört fareden enjeksiyonu için kullanılabilir. Alternatif olarak, oküler yüzeye Tamoksifen topikal uygulama daha yüksek verim verir. Tamoksifen Çözelti bir haftaya kadar 4 ° C'de karanlıkta muhafaza edilebilir. Kullanmadan önce çözüm ısıtın.

1. Tamoksifen 100 mg tartılır ve mısır yağı, 5 ml kadar içeri çözülür20 mg / ml tamoksifen çözelti oluşturmak.
2. Intraperitonal 3-4 ardışık gün boyunca 8 haftalık farelere Tamoksifen (4 mg) çözeltisi 200 ul enjekte edilir.
   Not: Tamoksifen çözeltisi bir haftaya kadar 4 ° C'de karanlıkta muhafaza edilebilir. Kullanmadan önce çözüm ısıtın.
3. Topikal uygulama için: Tamoksifen 60 mg ağırlığında ve 60 mg / ml tamoksifen çözelti oluşturmak için mısır yağı, 1 ml içinde çözülür. Vorteks ve 65 ° C'de muhafaza edilen bir sallanan sulu banyo içindeki çözümü ayarlamak ° C kullanımda kadar banyosunda açık bırakın onu oluncaya kadar.
   1. Dikkatle fare her göz yüzeyine Tamoksifen çözeltisi 100 ul uygulayın.

Görüntüleme için 5. Doku Hazırlanması

1. Izofluran kullanarak Kurban hayvanlar Tamoksifen enjeksiyonu ve col aşağıdaki uygun zaman noktalarında CO ₂ inhalasyon ardından anestezi (refleksleri eksikliği tarafından uygun anesthetization onaylayın) (% 2 oksijen buharlaşmış)İlgili doku Öğr.
   1. Bu deneyler için, aşağıdaki zaman noktalarında, gözler enükleasyonu: 1, 4, 8, 12 ve 16 hafta sonra Tamoksifen enjeksiyon. Kavisli bir forseps kullanarak enükleasyon ulaşmak. Göz küresi, göz soket dışına pop neden göz kapaklarını basın. Optik siniri tutan göz küresi arkasında forseps yerleştirin. Yavaşça göz küresi çekin ve çıkartın.
      Not: Aşağıda tarif edildiği gibi, bu aşamada, dokular işaretli hücrelerin wholemount analiz için hazırlanabilir. Normal dondurulmuş doku bölümleri de PFA sabit ve aşağıda tarif edildiği gibi (bakınız bölüm 6 ve ²²⁾ görüntülü hazırlanabilir.
2. PBS ile doldurulmuş bir 60 mm çanak her göze yerleştirin.
3. Stereo-mikroskop altında kullanarak forseps aşağı bakacak kornea ile optik sinir yakınında göz tutun ve optik sinir, kas ve bağ dokusu kaldırmak ve gözün arka kısmında küçük bir kesi yapmak için bir neşter kullanabilirsiniz.
4. Yaylı makas kullanma dikkatle büyütmekObjektif dışarı pop ve forseps kullanarak iris kaldırmak icar kesti.
5. Bir neşter kullanılarak çevreye doğru merkezden başlayarak 4-5 radyal kesiler yaparak kornea düzleştirin.
6. Limbusun ötesinde aşırı periferik dokuyu kesmek için bir neşter kullanın.
7. Daha sonra kısa bir süre PBS ile yıkayın, 10 dakika boyunca% 4 PFA korneaları sabitleyin.
8. 10 dakika boyunca DAPI ile inkübe örnekleri ve kısaca PBS ile yıkayın.
9. Epitel tarafı yukarı bakacak şekilde cam slaytlar Dağı kornealar. Bir kapak camı ile kornea ve kapağın üstüne montaj medya bir damla yerleştirin. Slaytlar RT O / N kurumasını bekleyin. 4 ° C 'de slaytlar tutun.

6. Konfokal Mikroskopi ve Görüntüleme Analizi

1. YFP / GFP / OBP emisyonlarının ayrılmasını sağlayan bir spektral konfokal sistemi kullanın. Set flüoresan uyarma ve Br'dir kasetinin floresan proteinleri bağlı olarak emisyon dalga boylarında. Minimize haç amaçlayan her protein için en uygun dalgaboyu seçinuyarım. Farklı protein gelen sinyallerin sızıntısı en aza indirmek için, dar emisyon aralıkları seçin.
   1. Br2.1 kaset için bir başlangıç ​​noktası olarak floresan uyarma (eski) ve emisyon (em) arasında kurulan aşağıdaki kullanın: - CFP ex 405 nm / em 420-480 nm - DAPI ex 458 nm / em 470-500 nm, GFP - ex 488 nm / em 497-508 nm, YFP - ex 514 nm / em 529-540 nm ve RFP - ex 561 nm / em 575-615 nm.
2. Yüksek çözünürlüklü geniş doku alanları görselleştirmek için, kiremit görüntüleme kazanır. Yani Şekil 2A-B, görüntünün 12 x 12 görüntülerin bir dizi alarak tüm kornea, gösterilen sonuçlar için, her alanda 4 floresan kanalları kullanarak 144 alanları (512 x 512) kazanır. Toplamda 576 görüntüleri toplamak ve daha sonra birleştirme.
3. Farklı derinliklerde ve doku yapılarına etiketlenmiş hücrelerin lokalizasyonu keşfetmek için, farklı ilgi bölgelerin Z-yığını görüntüler elde. Sipariş to görüntü korneanın tam derinliği, 3 mikron aralıklarla 8 optik bölümleri kazanır. Maksimum şiddeti göre resim çıkıntılar olarak da toplanmıştır bölümlerin Ortogonal incelemeler geleneksel görüntüleme yazılımları ²⁴ kullanılarak inşa edilebilir.

Tamoksifen İndüksiyon 7. Kornea Yaralanma Kombine

1. Izofluran ile fareler (oksijen buharlaşmış% 2) anestezisi ve yönetimi analjezikler (10 mg / kg Carpofen, deri altından enjekte). Ayak tutam yanıtsızlık tarafından uygun anesthetization onaylayın.
2. Tamoksifen tozu, 1 g tartılır ve 200 mg / ml konsantrasyon solüsyonu elde etmek için, steril DMSO, 5 ml içinde çözülür.
3. Çözelti berrak hale gelinceye kadar bir su banyosu içinde 65 ° C'ye kadar Tamoksifen çözeltisi ısıtın. Kullanılıncaya kadar banyosunda çözüm tutun.
4. Anestezi sırasında su kaybını önlemek için tedavi edilmeyen kontralateral göze göz merhemi sürün. Yeterli con kazanmış olan gözetimsiz kadar bir hayvan bırakmayınsternal yatma korumak için bilinç. Tamamen iyileşene kadar diğer farelerin şirkete yaralama göz geçirmiş fareler iade etmeyin. Fareler yakın yaralanmadan sonra izlenmelidir. Onların vücut ağırlığının% 10'undan fazlasını kaybetmek durumda, kornea erozyonu veya rahatsızlık muzdarip, deney durdurulmalıdır. Tekrarlama analjezikler idaresi bütün deney boyunca her 24 saatte.
5. Buna bağlı bir iğne olmadan Steril bir şırıngayı kullanarak, topikal her fare tek gözün tüm kornea yüzeyinde 200 ul Tamoksifen çözümü uygulayın.
   Not: Sıvı çözelti, oda sıcaklığında göz yüzeyine hızlı bir şekilde katılaşır. Kornea hasarı etkisi yara şiddetine bağlıdır. Tamoksifen / DMSO çözeltisi bir uygulamasında sonra hiçbir yan etki farelerde gözlenmiştir. Tekrarlı uygulamalar durumunda kornea opasitesi gözlenebilir.
6. Mezhep (bkz doku hazırlama ve görüntüleme ile devamiyonlar 5 ve ilgili zaman noktalarında 6). Bir hafta sonrası yaralama (Şekil 2 ve ^{24) (evre} 5.1 ayrıntılı olarak) Burada gösterilen sonuçlar, fareler kurban için.

Sonuçlar

Son zamanlarda, biz kök hücre ve kornea epitelinin ²⁴ progenitör hücrelerin köken, hayatta kalma ve göç belirlenmesi amaçlanmıştır. Biriken deliller kornea epitel limbal niş, kornea periferinde bir halka şeklinde bölgede münhasıran bulunan kök hücreler tarafından yenilenir dogma destekler. Bu teori, in vitro ve in vivo verilerin ve başarılı öncü limbal kök hücre tedavisi ^27-29 temelini sağlanan klinik kanıtlarla desteklenmektedir. Ancak, bu konu son derece bağlı fare limbus korneal yenileme ³⁰ katılmaz önerdi limbal aşılama deneyleri dayalı bir çalışmaya son yıllarda tartışılan kaldı. Bu ilginç hipotezi test etmek için, R26R-Konfeti fareler yapıldı kullanarak soy izleme deneyleri 120 gün ²⁴ için kararlı hal koşulları altında limbal ve kornea epitel kök / progenitör hücrelerin kaderini takip etmek.Gözler enüklee ve düz monte kornealar 10 ve 120 gün Tamoksifen enjeksiyon sonrası spektral konfokal lazer tarama floresan mikroskop ile analiz edilmiştir. Beklendiği gibi kornea merkezine doğru limbus uzanan 1-4 ay sonra (Şekil 2B ve ^24), uzunlamasına çizgiler yavaş geliştirilmiş olup, küçük flöresanlı hücre kümeleri ara sıra, 10 gün sonra aynı oküler yüzey boyunca gözlenmiştir. Bu sonuç kornea kornea merkezine doğru limbustan göç hücreleri tarafından yeniden düşündürmektedir. Sonra, yaralama koşullarda kornea rejenerasyon incelenmiştir. Etkin hücre izleme indüklerken koşullar altında yaralama K14 pozitif limbal / kornea hücrelerin kaderini test etmek için, biz, topikal uygulamaya bağlı kornea yaralanması neden dimetil sülfoksitte Tamoksifen (DMSO), eritilir. Tek bir topikal uygulaması (Şekil 2C), mo uygulandı Bu şekilde biz hafif yaralama ikna etmek için başardı Ek DMSO yalnız tedavi Tamoxifen indüksiyon veya DMSO yalnız topikal Tamoksifen indüksiyon öncesinde 2 ardışık günlerde uygulanan ağır yara gün önce uygulandı ise yaralama yükünü azaltır.

Yavaş geliştirilen ve durağan hal koşulları altında 4 ay içinde kornea merkezine ulaştığı ince limbal çizgili aksine, yaralanmadan sonra hücre göçü hızlıydı. Dikkate değer, uzun ve kalın çizgili limbal zaten 7 gün içinde bu koşullar altında geliştirilmiştir. İlginç bir şekilde, renk çeşitliliği, bazen çok az (Şekil 2B) idi. Bizim ellerde, bazen, özellikle kırmızı kan hücrelerinin spesifik fluorophores karşı önyargılı olabilir renk çeşitliliği gösteren tüm kornea tespit edilmiştir. Br1.0L ³¹ ve Br2.1 ^21'de daha önce bildirildiği gibi, istenmeyen bu eğilim doz tepki deneyleri ile kalibre edilebilir.

les / ftp_upload / 53370 / 53370fig1.jpg "/>
R26R-Konfeti yapısının Şekil 1. şematik gösterimi. (A) R26R-konfeti yapı yüksek ekspresyon düzeyleri için bir CAG destekçisi içeren bir loxP (siyah üçgen) Neo ^R -roadblock ve Rosa26 lokus ^16,21 at Brainbow2.1 kaseti -flanked. Brainbow2.1 kaset, iki baş-kuyruk loxP-flanked dimerlerini içerir. Bir dimer nükleer lokalize yeşil floresan proteini (GFP) ve bir geri odaklı sitoplazmik sarı floresan proteini (- olması yoluna götürdü ters çevrilmiş yönlenme belirlenmiş YFP) oluşur. ¹⁶ - İkinci dimer sitoplazmik RFP ve bir ters dönük, zara bağlı mavi floresan proteinin (PFC ters çevrilmiş yönlenme belirlenmiş CFP) içerir. (B - E) Cre-rekombinaz aktivasyonu üzerine, farklı eksizyon ve inversiyon olaylar meydana gelebilir; Olası sonuçlar exemplifi vardırB ed - E. Cre aktivite ve böylece gen taşınma ve / veya inversiyon ve dört floresan proteinleri birinin rastgele ifadesi sonuçlar giden kasetin stokastik yeniden düzenlenmesine neden olur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2. Homeostaz ve yaralanma altında izleme Kornea soyu. R26R-confetti / protokol ayrıntılı olarak K14-Cre farenin 4 mg Tamoksifen enjekte edilmiştir. (- B A) puan sonrası belirtilen süre içinde endüksiyon kornealar görüntülenmiştir basık. Cre indüksiyonu ile birleştiğinde Kornea yaralama DMSO içinde çözülmüş Tamoksifen topik uygulama ile elde edilmiştir (Cı - D). Mozaik görüntüler eldespektral konfokal mikroskopi fayans kanallı gösterilmektedir (A - D). Homeostazındaki yavaş göç hücrelerin radyal limbal çizgili limbus ve kornea merkezi arasında uzanıyordu. Bu şeritler 4-5 ay (B) içinde kornea merkezine ulaşan yavaş gelişti. Kornea hücre kümeleri de (beyaz oklar, B) belirgindi. Buna karşılık, büyük limbal çizgiler yaralama koşullarında (C) altında, tek bir hafta içinde ortaya çıktı. Kırmızı hücrelerin (D) doğru renk çeşitliliğinin önyargı bir örnek. Limbal-kornea sınır kesik çizgi ile açıklamalı. Ölçek çubuğu 500 mikron olduğunu. Kısaltmalar: CFP, mavi floresan proteini; GFP, yeşil flüoresan proteini; RFP, kırmızı floresan proteini; YFP, sarı floresan protein. Bu rakam ²⁴ modifiye edilmiştir. Büyük halini görmek için tıklayınızBu rakam.

Tartışma

Köken izleme deneyler yıllardır gerçekleştirilmiştir. Son teknolojik gelişmeler ve Confetti fare suşlarının ortaya çıkması araştırma için yeni yollar açtı. Günümüzde, ticari olarak temin edilebilen araştırmacılar dokuya-özgü Cre hatları nakavt fareler ve transjenik farelerin çok sayıda yararlanabilir. Bu sağlam ve güvenilir veri sağlarken, zahmetli uygulama kaçınarak, temel uzmanlık bilimsel sorulara yanıt için çok yönlü deneysel sistemler tasarlamak için bir fırsat sağlar.

R26R-Konfeti fareler verimli izleme ve canlı bir organizmada hücrelerin yapısını ve davranışlarını incelemek için şık bir araçtır. Sistem kurmak kolaydır ve, embriyogenez sırasında tek hücre non-invaziv soy izleme izin verir kök hücre yenilenmesini homeostazında altında, ya da yaralanma, enflamasyon ve kanser gibi farklı koşullarda. Elde veriler sağlam descript sağlarölçülebilir bir şekilde hedeflenen hücrelerin konumunun, klonal hücre genişlemesi ve hücre göçü hayatta kalma, iyonu. Bir kritik bir adım güvenilir bir kesin gelişim aşamasında etkin doku spesifik etiketleme izin verebilir uygun genetik fare zorlanma seçmek olacaktır. Bu sistemin bir sınırlama canlı bir organizmaya izlenmesi için, doku erişilebilir ve şeffaf olmasıdır. Benzer şekilde, bir canlı hayvan içinde kalın bir doku izlemenin yalnızca iki foton veya çoklu foton mikroskobu ile kolaylaştırılabilir. Ancak, hücre izleme postmortem doku bölümleri mevcuttur ve CLARITY yöntemiyle ^32,33 ile şeffaf olmak dönüştürülmüştür sonra belki sağlam doku incelenebilir. Dikkate alınması gereken bir başka sınırlama, aynı fluorofor ifade komşu hücreler, büyük olasılıkla aynı klonal soy ait olsa da, bu rastgele kişi aynı flüoresan gen ifade bağımsız hücre kökenli türetilebilir da mümkündür olmasıdır. Bu possibiliÇok sayıda renk kombinasyonları izin birden Br allelleri kullanırken ty çok olası hale gelir.

Gelecekte, genlerin ve sağlık ve patoloji kendi mutasyonların çalışma izin verecektir mevcut genetik araçlar (yani, nakavt, knockin ve transgenik fare modelleri) ile Confetti sistemini birleştirerek. Aynı şekilde, soy hücre kaderinin kararları sinyal yolları katılımı üzerine yeni anlayışlar getirecektir farklı sistem pertürbasyonlar (yani, hücre yıkımını niş, lazer aracılı hücre ablasyon, ilaç tedavisi kök) kapsamında izleme. Sonuçta, floresan ve biyoışıldama etiketleme kombinasyon kullanımı, kenar mikroskopi sinyal yollarının ve kesme genetik gazetecilere araştırmacılara onların kendi doğal ortamında çevredeki nasıl tepki tek hücre öğrenmek için sağlam bir sistem sağlayacaktır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Brainbow 2.1 kaseti için R26R-Konfeti transgenik fareler	Jackson	suşu #013731
K14-CreERT	fareler Jackson	suşu #005107
tamoksifen	Sigma	T5648
izofluran USP Terrell	Piramal Yoğun Bakım
Carprieve 30	b.wt
DMSO	Sigma	D2650
DAPI	Sigma	D9542	4 & # 160 konsantrasyonda kullanılır; &mikro; g/ml
Immu Mount	Thermo Scientific	9990402
LSM 510 Motorlu bir sahne Zeiss ile donatılmış ters motorlu bir mikroskoba (Axiovert 200M) bağlı meta lazer tarama konfokal sistemi			Burada Zeiss LSM 510 Meta spektral konfokal mikroskobu kullanıyoruz. Bu sistemde yer alan Meta dedektör, her biri 10 nanometrelik bir dalga bandından emisyon toplayan 32 dedektör elemanına sahiptir. "Spektral parmak izi" olarak adlandırılan bu teknik, kullanıcının dalga bandı filtrelemesi için en uygun limitleri belirlemesini sağlar. Leica SP5 (ref # 21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref # 22) dahil olmak üzere kullanılabilecek çeşitli spektral konfokal sistemler vardır.
Zen 2009 Görüntüleme Yazılımı	Zeiss
Duratears-göz merhemi	Alcon