FACS ile Murin Dermal fibroblast İzolasyonu

Özet

Fibroblast davranışı, bir klinik antite spektrumunun temelini oluşturur, ancak büyük ölçüde doğal heterojenlikleri nedeniyle zayıf karakterize edilirler. Geleneksel fibroblast araştırmaları, in vivo fibroblast davranışını maskeleyen in vitro manipülasyona dayanır. Hücre kültürü gerektirmeyen fare derisi fibroblastlarının izolasyonu için FACS tabanlı bir protokol tanımladık.

Özet

Fibroblastlar hücre dışı matriks salgılayan sorumlu ilke hücre tipi ve birçok organ ve dokuların kritik bir bileşenidir. Fibroblast fizyolojisi ve patolojisi birden organlarda fibrozların, hipertrofik skar aşağıdaki yanıklar, iskemi sonrası kardiyak fonksiyon kaybı ve kanser stroma oluşumu da dahil olmak üzere klinik kuruluşların, bir spektrum altında yatan. Ancak, fibroblastlar büyük ölçüde kendi içsel heterojenite, hücrenin kötü karakterize tip kalır. Fibroblastlar izolasyonu için mevcut yöntemler derinden hücre fenotipi ve davranışlarını etkileyen hücre kültüründe zaman gerektirir. Sonuç olarak, fibroblast biyoloji araştıran birçok çalışma, in vitro manipülasyon güvenmek ve doğru bir in vivo fibroblast davranışı yakalamak değil. Bu problemin üstesinden gelmek için, preservi böylece, hücre kültürü gerektirmez, yetişkin farelerin dorsal deri fibroblast izolasyonu için bir FACS tabanlı bir protokol geliştirilmiştirfizyolojik transkripsiyonel ve her hücrenin proteomik profili ng. Bizim stratejimiz soy negatif kapısı yoluyla olmayan mezenkimal soy dışlama sağlar (Lin ^-) oldukça spesifik yüzey belirteçleri ifade fibroblastlar bir alt ön seçim veya zenginleştirme önlemek ve bu heterojen genelinde mümkün olduğunca kapsayıcı olması için pozitif bir seçim stratejisi daha hücre tipi.

Giriş

Fibroblastlar sık ​​plastik yüzeylerde uygun iğ biçimli hücreler olarak morfolojik tanımlanır. Fibroblastlar sentezlenmesi ve embriyonik ve yetişkin organlarının ¹ hücre dışı matriks remodeling sorumlu ilke hücre tipi vardır. Fibroblastlar memeli gelişme dolayısıyla kritik ve her doku ve organda mevcut hücre tipleri komşu davranışını etkileyen hücre dışı ortamın önemli ölçüde katkıda bulunur.

Fibroblastlar de muazzam bir klinik yükünü neden tıbbi koşullar çeşitli bir kümesi arkasında asıl hücre tipi vardır. Patolojik fibroblast aktivitesinin normal doku işlevini bozar ve deri yara iyileşmesi, ateroskleroz, sistemik skleroz, ve damar yaralanması ^2-5 sonra aterom plaklarının oluşumuna aşağıdaki doku ve (örneğin akciğer ve karaciğer gibi), organ fibrozis, skar içerir. Özellikle yara iyileşmesi, hem akut ve kronik, d içerirnormal doku gibi ne benzeyen, ne de işlevleri çevreleyen ve çeşitli patolojik devletler arasında önemli morbidite neden skar dokusunun eposition. Travmalarından sonra, daha sonra, yapısal ECM bileşenleri salgılar hücre tiplerini komşu parakrin etkilere neden ve skar dokusu ⁶ yatırma mekanik istikrarı sağlamak miyofibroblastlar fibroblastların bir geçiş vardır.

Deri dokularda gelişimsel süre boyunca yara onarım kalitesi ve anatomik siteler arasında önemli varyasyon mevcuttur. Yaşamın ilk iki trimesterde fetüs iz bırakmadan iyileşir; Ancak, üzerinde ve yetişkinlik boyunca üçüncü trimesterde, bir yara ile iyileşir insanlarda. Mevkiye-özgü yaşa özgü ek olarak, yara iyileşmesi farklılıklar vardır. Deri yaraların içinde skar dokusu biriktirme ⁹ önemli ise ağız boşluğunda yaralar, minimal skar oluşumu ^7,8 ile pişmanlık. Münakaşa c devamyaş ve konum ^10,11 hem açısından yara iyileşmesi sonucu yerel fibroblast içsel özelliklerinin karşı çevrenin göreceli etkisini oncerning. Deri dermis ve önceki embriyonik (E15) karşı sözlü fare iyileşmesinde önemli farklılıklar göz önüne alındığında vs sonra embriyonik (E18) dermiş, bazı gelişimsel yaşta ve çeşitli anatomik siteler arasında fibroblastların popülasyonlarında içsel farklılıklar var olasıdır .

1986 yılında, Harold F. Dvorak tümörler ¹² iyileşmeyen yaralar vardır oturtulması. Dvorak tümörler vücutta yaralar gibi davranırlar ve konağın yanıtını yaranın iyileşme aktive ederek stroma neden olduğu sonucuna varıldı. Çeşitli çalışmalar beri karsinom ^13-15 ilerlemesine fibroblastların katkısını araştırdık, ama yara iyileşmesi, kimlik ve deri ca stromal bölmesine katkıda fibroblast embriyonik kökenli olduğu gibircinomas yeterince tanımlanmamıştır. Bu sorunun cevabı, anti-kanser terapisi ¹⁶ için potansiyel olarak etkin hedef olarak tümörle ilişkili fibroblast açığa son çalışmalar verilen tıbbi alaka taşımaktadır.

Belirlenmesi ve ileriye dönük in vivo fibrojenik potansiyeli sahip fibroblast soy izole etkin bir akut ve kronik hastalık durumları geniş bir yelpazesinde yaralanma kendi tepkisini manipüle yönelik önemli bir adımdır. 1987 yılında, Cormack papiller ve retiküler dermis ^17,18 içinde biri içinde ikamet eden fibroblast iki alt popülasyonlarını bir gösterdi. Üçüncü ICSI'nin follikül ^19,20 Dermal papilla bölgedeki saç köklerinin ile ilişkili bulunmuştur. Ne zaman kültür, büyüme potansiyeli, morfoloji ve büyüme faktörü / sitokin bu fibroblast alt tiplerinin sergi farkları ^21-24 profilleri.

Bugüne kadar, fibroblast inceleyen çalışmaların oterogeneity ölçüde yeterli in vivo fibroblastlar arasında gelişimsel ve fonksiyonel çeşitlilik karakterize etmek başarısız oldu. Bu, kısmen, kültürlenmiş fibroblast popülasyonları bir güven ve tüm fibroblastlar ²⁵ ile ifade edilen bir kendi kendine yüzey reseptörüne göre hücre kültüründen ya da pozitif bir seçim homojenize etkisinin bir sonucu olduğu. Laboratuarımızda yapılan yeni bir çalışma, derin bir yüzey işaretleyici ve bu yazıda ²⁶ sunulan FACS-bazlı izolasyon metodolojisi ile izole vs kültürlü kültürsüz fibroblast transkripsiyonel vardiya gösterdi.

Daha sonra, kemirgen dorsal dermiş içinde belirli bir fibroblast soy tanımlanmış ve Engrailed-1 embriyonik ekspresyonu ile tanımlanan, bu soy, dorsal, derideki bağ dokusu birikimi için temel olarak sorumlu olduğu tespit edilmiştir. Yara iyileşmesi, kanser stroma oluşumu da dahil olmak üzere fibrozis, akut ve kronik biçimleri boyunca da soy fonksiyonlarıRadyasyon fibrozis ²⁷ uyarılan. Farklı fibroblast soy karakterizasyonu fibrojenik davranışlarını modüle amaçlayan tedaviler için kritik etkileri vardır.

Aksine, hücre izolasyonu ^28,29 ulaşmak için in vitro manipülasyon güvenmek mevcut protokolleri kullanarak daha burada ayrıntılı hasat protokolü (Şekil 1) daha doğru in vivo fenotip ve davranışlarını yakalamak fibroblast verimi bilgilendirici analizlerini yardımcı olacaktır.

Protokol

Bu protokol Laboratuar Hayvanları Bakım Stanford Üniversitesi İdari Heyeti tarafından onaylanan yöntemler izler.

Fare Dermisinde 1. Sindirim

1. Ketamin 100 mg / kg + ksilazin 20 mg / kg asepromazin + 3 mg / kg karın içinden enjeksiyonu ile anestezi sonra servikal dislokasyon ile fareler öldürülür.
   Not: Çeşitli yaş ve arka kullanılabilir.
2. Tıraş ve dorsal cilt atmaktadır. Yaklaşık olarak 100,000 hücre sırt derisine bir parça x 100 mm, 60 mm izole edilebilir.
3. Kuruması için temiz, steril bir yüzey üzerinde% 70 etanol ve yerinde fareyi Batmak.
4. Hemen steril diseksiyon makas kullanarak dorsal fare cilt hasat. Dişi fareler içinde, meme dokusu da dahil olmak üzere kaçının.
5. Kuyruk tabanı başlayan çadır kadar cilt için forseps kullanabilir ve üstü fasiyal düzlemi boyunca diseksiyon önce enine kesim yapmak.
6. Dikkatle hasat sırasında herhangi deri altı yağ içeren kaçınmakcilt. Herhangi bir deri altı yağ için hasat cildi inceleyin ve dikkatli bir neşter künt kenarını kullanarak kazıyın.
7. Buz üzerinde PBS yıkar 5x ardından Betadin hasat cildi durulayın.
   Not: kirlenmesini önlemek için mümkün olduğunca steril yakın olarak cildi korumak önemlidir.
8. Jilet kullanarak ve örnek 2-3 mm'lik parçalar ile düzgün bir tutarlılık kadar steril bir tabak içinde makas diseksiyon cilt kıyma.
9. DMEM içindeki 1 mg / ml 'lik bir konsantrasyonda, 50 ml, 20 ml kolajenaz IV ihtiva eden konik tüpler hazırlayın. Tüp başına beş farenin bazında tüplere dermis bölün.
10. Bir su banyosu ya da fırın ya 1 saat süreyle 37 ° C'de inkübe kuvvetli şekilde örnekleri çalkalayın.
11. Inkübatör örnekleri çıkarın ve steril bir muhafaza içinde bir iğne 3-5x olmayan bir 10 ml şırınga geçer.
12. 37 ° C'de inkübatör içinde numuneler ve 30 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır.
13. Steril bir başlık olarakBir 10 ml pipet kullanarak ve 3-5x aşağı örnekleri pipetle. Yeni 50 ml konik tüp içine 100 mikron filtre örneği pipetle.
14. Hücre verimi maksimize etmek ve 40 ml toplam hacmi getirmek için, aynı filtre boyunca% 10 FBS DMEM 20 ml geçirin. 4 ° C 'de 8 dakika boyunca 300 g'de santrifüjleyin.
15. İlk süpernatant kalan öncesinde üst yağ tabakasını kaldırmak için büyük bir özen, bir steril cam pipet kullanarak süpernatantı.
    Not: Bu adım adiposit kirlenmeyi azaltmak için çok önemlidir.
16. 20 ml% 10 FBS DMEM pelet yeniden süspanse edin.
17. 70 mikron filtreden geçirilerek hücre / DMEM süspansiyonu geçirin.
18. 4 ° C 'de 8 dakika boyunca 300 g'de 10 mi,% 10 FBS DMEM ile filtre ve santrifüj filtre süspansiyonu çalkalayınız.
19. Yine ilk kalan yağ tabakası kaldırmak için özen, steril bir cam pipet kullanarak süpernatantı.
20. Önemli RBC kirlenme varsa (pelet gözle görülür kırmızı), pelet yeniden askıyave 20 ml ACK lizis tamponu içinde, oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. Aksi halde 24 adıma atlayın.
21. FACS tamponu (PBS,% 10 FBS,% 0.1 sodyum azid) içinde eşit bir hacmi (20 mi) ilave edilir, daha sonra karıştırılır ve bir boyanmamış bir kontrol olarak bir kenara 5 ml'lik bir şişe tutun. 4 ° C 'de 8 dakika boyunca 300 g'da kalan santrifüjleyin.
22. Süpernatantı ve buz üzerinde pelet koydu. FACS zamanı mevcut değilse, bu noktada hücreler, aşağı dondurulabilir.

FACS Fibroblast 2. izolasyonu

1. Her pelet için soy antikor inkübasyon karışımı 500 ul olun. CD45 (1: 200), Tie2 (01:50), Ter: İlk bir tübe DNaz (10 ug / ml) ihtiva eden FACS tampon 475 ul ekleyerek ve daha sonra fluorofor-konjuge CD31 (100 1) ilave edilerek, bu fazlası -119 (1: 200) ve EpCAM (1: 100) antikorları her bir antikor için, ilgili seyreltme elde etmek.
2. Nesilli antikor inkübasyon karışımı 500 ul her bir pelet yeniden askıya ve 20 dakika boyunca buz üzerinde, bu süspansiyon inkübe edilir.
3. 5 ekleyinörnek DNaz (10 ug / ml) ihtiva eden ve hafifçe karıştırın mi FACS tamponu. 4 ° C 'de 8 dakika boyunca 300 g'de santrifüjleyin.
4. Süpernatantı ve adım 26'daki gibi 5 ml FACS DNaz ihtiva eden tampon (10 ug / ml) ve aynı koşullar kullanılarak santrifüj ile hücre pelletini yıkayın.
5. DNase (10 ug / ml) ihtiva eden 500 ul FACS tampon maddesi içinde pelletini ve canlılığı boya kontrol olarak bir kenara 50 ul tablet koydu.
6. Seçilen boya için belirtilen konsantrasyonda kalan örnek seçim canlılığı boya ekleyin.
7. FACS analizi ³¹ gerçekleştirin ve Canlılık Dye- / CD31 / CD45- / Tie2- / Ter-119- / EpCAM- hücreleri (Şekil 2A) için sıralama. Sıralama doğrudan FACS tampon içine.

Sonuçlar

Bu yaklaşım (Şekil 1) geçerlilik son yayın ²⁷ ayrıntılı incelenebilir şekilde, bir dizi doğrulanmıştır. Bunlar sıralanmış hücreler ve kitle hücre ve taze sıralanmış hücrelerin tek bir hücre transkripsiyonel analizi immünsitokimya içerir. Fibroblastlar Sıralama doğrudan ziyade daha doğru kültürüne dayanarak in vivo fenotip yakalar. Yerine olumlu bir seçim yaklaşımı daha soy negatif tüketme yaklaşımı (Şekil 2A) kullanılarak belirli alt popülasyonlar için ön seçerek önler. Bu yaklaşımın değ...

Tartışma

Bu yazıda tarif edilen protokol, bir alt seçmek ya da daha sonraki analizler yapılmadan önce, hücre kültüründe bir zaman gerektiren ya mevcut yöntemlere kıyasla, FACS-bazlı sıralama ile fibroblastlar izole etmek için bir araç sunmaktadır. Fibroblast sıralama için cildin hasat gerekli süre yaklaşık 6 saattir; Bununla birlikte, hasat kullanılan farelerin sayısı, bu tahmin etkileyecektir.

Protokolde birkaç nokta özellikle dikkat gerektirir. İlk izolasyon prosesi esnasında sindirimi ve santrifüj...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Cerrahi Forseps	Kent Scientific	INS650916
Mikro makas	Kent Scientific	INS600127
Povidone İyot Hazırlama Solüsyonu	Dynarex	1415
Nair (tüy dökücü krem)	Church ve Dwight Co.
Kollajenaz IV	Gibco	17104-019
Elastaz	Abcam	ab95133
DMEM	Yaşam Teknolojileri	A14430-01
Fetal Sığır Serumu	Gibco	16000-044
Amonyum-Klorür-Potasyum (ACK) parçalama tamponu	Gibco	A10492-01
40 & mu; m filtreler	Fisher Scientific	08-771-1
70 μ m filtreler	Fisher Scientific	08-771-2
100 μ m filtreler	Fisher Scientific	08-771-19
CD31	BioLegend	102421
CD45	BioLegend	103125
Tie2	BioLegend	124005
Ter-119	BioLegend	116233
EpCAM (CD326)	eBioscience	48-5791
DAPI	Invitrogen	D3571
propidyum iyodür (PI canlılık lekesi)	BioLegend	421301

22600267058