Burada, yumurtalık kanseri hücresi adezyonunu, invazyonunu ve proliferasyonunu araştırmak için bir araç olarak, birincil insan mezotelyal hücreleri ve hücre dışı matris ile katmanlanmış fibroblastlardan oluşan periton boşluğunun astarının üç boyutlu bir in vitro modelini oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnsan periton boşluğuna bir Organotipik Kültür Yumurtalık Kanseri Yaygınlaştırılması Erken Adımlar Modelleme
Bu makalede
Özet
Özet
Yumurtalık kanseri metastazı paterni, nadiren hematojen olarak yayıldığı için diğer epitel tümörlerinin çoğundan belirgin şekilde farklıdır. Bunun yerine, primer tümörden pul pul dökülen yumurtalık kanseri hücreleri, periton sıvısı ile periton boşluğu içindeki metastatik bölgelere taşınır. Bu bölgeler, en önemlisi abdominal periton ve omentum, mezotelyum kaplı bir yüzeyle kaplı organlardır. Yumurtalık kanseri yayılma süreçlerini araştırmak için, in vitro periton boşluğunun astarını yeniden yapılandıran karmaşık bir üç boyutlu kültür sistemi oluşturduk. Primer insan fibroblastları ve mezotelyal hücreler insan omentumundan izole edildi. Fibroblastlar daha sonra hücre dışı matriks ile karıştırıldı ve metastaz yapan yumurtalık kanseri hücrelerinin karşılaştığı peritoneal ve omental yüzeyleri taklit etmek için birincil insan mezotelyal hücrelerinin bir tabakası ile kaplandı. Elde edilen organotipik model, gösterildiği gibi, kanser hücresi yapışması, invazyonu ve proliferasyonu dahil olmak üzere yumurtalık kanseri yayılımının erken aşamalarını incelemek için kullanılır. Bu model, erken yumurtalık kanseri yayılımında mikroçevrenin (hücresel ve hücresel) rolünü araştırmak için bir dizi çalışmada kullanılmıştır. Ayrıca yüksek verimli taramaya başarılı bir şekilde uyarlanmış ve yumurtalık kanseri metastazı inhibitörlerini tanımlamak ve test etmek için kullanılmıştır.
Giriş
Over kanseri en ölümcül jinekolojik malignitedir1. Hastaların çoğu, kanser periton boşluğu boyunca yayıldıktan sonra teşhis edilir. Kanser periton boşluğu boyunca yayıldıktan sonra, sitoredüktif cerrahi ve kemoterapi genellikle kanser nüksünü ve kemorezistansı önlemek için yeterli tedavi değildir ve bu da %30'dan daha az 5 yıllık sağkalım oranıyla sonuçlanır. Over kanseri metastazı ağırlıklı olarak periton boşluğu ile sınırlıdır ve mide, pankreas ve kolon kanserleri dahil olmak üzere diğer bazı kanser türleri periton boşluğundaki aynı anatomik bölgelere metastaz yapar. Genel olarak, yumurtalık kanseri hücreleri, fallop tüpündeki veya birincil yumurtalık tüm....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tarif edilen tüm araştırma protokolleri Chicago Kurumsal Değerlendirme Kurulu Üniversitesi'nde (KİK) tarafından incelenmiştir. Aydınlatılmış onam ameliyattan önce her hastadan alındı ve çalışma Chicago IRB Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Korunması için insan dokusu taşıma ve hücrelerin kontamine riskini azaltmak için ne zaman bir biyolojik güvenlik kabini tip 2 ve eldiven kullanılmalıdır.
Birincil dönüştürülmemiş Stromal Hücreleri 1. İzolasyon ve Kültür
- İnsan doku toplama ve hazırlama.
- Abdominal operasyon esnasında alınan insan omentum, 2 cm3, örneklerini elde edilir ve hemen RT fosfat tamponlu ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Organotipik kültürü ilk olarak kollajen tip I primer insan fibroblastları karıştırılması ve sonra mezotelyal hücrelerin 5 kez sayı ile bu kültürü overlaying tarafından toplandı. Yumurtalık kanseri hücreleri, yapışma, istilası veya proliferasyonunu çalışma ilave edilmeden önce, kültür en az 18 saat süreyle inkübe edildi. Her bir deney, çoklu tekrarlanmıştır (n = 5) ve istila deneyler (n = 3) (n = 3-5), farklı hastalara ve çok sayıda kuyu elde edilen 3D kültürleri yapışma her durumda test edildi (n = 5), proliferasyon . 4.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Periton mikroçevresinin bir Organotipik modeli yumurtalık kanseri yayılmasına mikroçevresinin hücresel ve doğuştan bileşenlerin hem bireysel ve kolektif işlev (ler) değerlendirmek için kurulmuştur. Yumurtalık kanseri hücre yapışması, proliferasyon ve istila araştırmak için 3D Organotipik kültürü kaplama ve uyarlama için özel protokolleri temin edilmektedir. Primer insan omental mezotel hücreleri ve fibroblastlar hastalardan izole edilen ve normal morfoloji ve hasta varyasyonu korumak için erken bir pasajda kullanılmıştı.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Tüm asistanlara ve katılan doktorlara, özellikle de Dr. A.F. Haney'e (Chicago Üniversitesi, Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı) omental biyopsileri topladıkları için teşekkür ederiz. Ayrıca, bu el yazmasını dikkatli bir şekilde düzenledikleri için Stacey Tobin ve Gail Isenberg'e teşekkür ederiz. Bu çalışma, Chicago Bears Futbol Kulübü'nün hayırsever yararlanıcısı Bears Care, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (NINDS) R21 NS075702 ve Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından R01 CA111882 E.L. tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1. Birincil hücrelerin izolasyonu ve kültürü | |||
| PBS | Fisher Scientific | SH3001304 | |
| Tek kenarlı tıraş bıçağı | Fisher Scientific | 12-640 | |
| 15 cm kültür | kapları BD Biosciences | 353025 | |
| Cam şişe | ? | ? | |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | Yaşam Teknolojileri | 16000044_3616914956 | |
| L-Glutamin ile DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| MEM Vitaminleri | Corning | 25-020-Cl | |
| MEM Esansiyel olmayan amino asitler | Corning | 25-025-CI | |
| Penisilin-Streptomisin | Corning | 30-002-CI | |
| Çalkalayıcı | Thermo-Fisher | MaxQ 4450 | |
| Santrifüj | Eppendorf | 5702 | |
| İnkübatör | Thermo-Fisher | Forma Seri II Su Ceketli CO2 İnkübatör Modeli 3100 | |
| Tripsin EDTA, 1x (% 0.25) | Corning | 25-053-CI | |
| Hyaluronidaz | Worthington Biyokimyasal | LS002592 | |
| T-75 Şişeleri | BD Biosciences | ||
| T-175 Şişeler | BD Biosciences | 353112 | |
| Pipet uçları | Rainin | P2, P10, P20, P200 ve P1000 | |
| Pipet uçları | Corning | Filtreli uçlar P2, P10, P20, P200 ve P1000 | |
| Reaktifin / Ekipmanın Adı | Company | Katalog Numarası | Yorumlar / Açıklama< / güçlü> |
| 2. Kaplama 3D kültür< / güçlü > | |||
| Hücre Sayacı | Invitrogen | Kontes | |
| Kontes Hücre Sayma Odası Slaytları | Invitrogen | C10313 | |
| Tripan Mavi Leke (% 0.4) | Gibco | 15250-061 | |
| Kollajen Tip I (Sıçan Kuyruğu) | BD Biosciences | 354236 | |
| 96 kuyulu plaka, şeffaf alt, siyah | BD Biosciences | 353219 | |
| Reaktifin / Ekipmanın Adı< / strong> | Company< / strong> | Katalog Numarası< / strong> | Yorumlar / Açıklama< / strong> |
| 3. Yapışma testi | |||
| Çok kanallı pipet | Eppendorf | Xplorer 300 | |
| Paraformaldehit çözeltisi PBS | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-281692'de | |
| Plaka okuyucu | Moleküler Cihazlar | Minimax | |
| Reaktifin / Ekipmanın Adı | Company | Katalog Numarası | Yorumlar/Açıklama |
| 5. İstila testi< / güçlü > | |||
| Hücre Kültürü Ekleri (8um, 24 kuyulu) | BD Biosciences | 353097 | |
| Pamuklu çubuklar | Q-uçlu | pamuklu çubuklar | |
| Mikroskop | Zeiss | Axiovert 200m | |
| Hücre Profilleyici | kamu malı | ||
| 24 kuyulu plaka | BD Biosciences | 353047 | |
| Reaktifin / Ekipmanın Adı< / strong>< | strong>Company< >< | strong> Katalog Numarası< / strong>< | strong> Yorumlar / Açıklama< / strong> |
| 6. Antikorlar< / güçlü > | |||
| Anti-Integrin ve alfa; V ve beta; 3 Antikor, klon LM609 | EMD Millipore MAB1976 | ||
| Beta 1 | Oncosynergy | OS2966 | |
| Alpha 5 [CD49e] | ID Pharmingen | 555615 | |
| Beta 4 [CD104] | EMD Millipore | MAB 2058 |
Kaynaklar
- Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am. J. Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
- Quail, D. F., Joyce, J. A.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
