Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan periton boşluğuna bir Organotipik Kültür Yumurtalık Kanseri Yaygınlaştırılması Erken Adımlar Modelleme

26.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/53541

⸱

31 Aralık 2015

 ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Section of Gynecologic Oncology, University of Chicago

Bu makalede

Özet

Burada, yumurtalık kanseri hücresi adezyonunu, invazyonunu ve proliferasyonunu araştırmak için bir araç olarak, birincil insan mezotelyal hücreleri ve hücre dışı matris ile katmanlanmış fibroblastlardan oluşan periton boşluğunun astarının üç boyutlu bir in vitro modelini oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Yumurtalık kanseri metastazı paterni, nadiren hematojen olarak yayıldığı için diğer epitel tümörlerinin çoğundan belirgin şekilde farklıdır. Bunun yerine, primer tümörden pul pul dökülen yumurtalık kanseri hücreleri, periton sıvısı ile periton boşluğu içindeki metastatik bölgelere taşınır. Bu bölgeler, en önemlisi abdominal periton ve omentum, mezotelyum kaplı bir yüzeyle kaplı organlardır. Yumurtalık kanseri yayılma süreçlerini araştırmak için, in vitro periton boşluğunun astarını yeniden yapılandıran karmaşık bir üç boyutlu kültür sistemi oluşturduk. Primer insan fibroblastları ve mezotelyal hücreler insan omentumundan izole edildi. Fibroblastlar daha sonra hücre dışı matriks ile karıştırıldı ve metastaz yapan yumurtalık kanseri hücrelerinin karşılaştığı peritoneal ve omental yüzeyleri taklit etmek için birincil insan mezotelyal hücrelerinin bir tabakası ile kaplandı. Elde edilen organotipik model, gösterildiği gibi, kanser hücresi yapışması, invazyonu ve proliferasyonu dahil olmak üzere yumurtalık kanseri yayılımının erken aşamalarını incelemek için kullanılır. Bu model, erken yumurtalık kanseri yayılımında mikroçevrenin (hücresel ve hücresel) rolünü araştırmak için bir dizi çalışmada kullanılmıştır. Ayrıca yüksek verimli taramaya başarılı bir şekilde uyarlanmış ve yumurtalık kanseri metastazı inhibitörlerini tanımlamak ve test etmek için kullanılmıştır.

Giriş

Over kanseri en ölümcül jinekolojik malignitedir1. Hastaların çoğu, kanser periton boşluğu boyunca yayıldıktan sonra teşhis edilir. Kanser periton boşluğu boyunca yayıldıktan sonra, sitoredüktif cerrahi ve kemoterapi genellikle kanser nüksünü ve kemorezistansı önlemek için yeterli tedavi değildir ve bu da %30'dan daha az 5 yıllık sağkalım oranıyla sonuçlanır. Over kanseri metastazı ağırlıklı olarak periton boşluğu ile sınırlıdır ve mide, pankreas ve kolon kanserleri dahil olmak üzere diğer bazı kanser türleri periton boşluğundaki aynı anatomik bölgelere metastaz yapar. Genel olarak, yumurtalık kanseri hücreleri, fallop tüpündeki veya birincil yumurtalık tümöründeki in situ karsinomdan ayrılır, periton sıvısında tek hücreler veya sferoidler olarak hareket eder ve omentum, bağırsak ve karın duvarının mezotelyum kaplı yüzeylerine yapışır2.

Tümör mikroçevresi, birçok kanserde hastalık ilerlemesinde ve kemorezistansta önemli bir rol oynar3-6. Periton boşluğu, yüzeylerin çoğunu kaplayan mezotelyal hücre tek tabakası ile benzersiz bir mikro ortamdır (Şekil 1A)7. Mezotelyal astar, kanser hücresi yapışmasına karşı koruyucu olma eğiliminde olan düşük sürtünmeli bir yüzey oluşturan bir bariyer görevi görür8. Bu mezotelyal astarlı yüzeyin hemen altında, kanser hücresi yapışmasını ve istilasını teşvik eden, ağırlıklı olarak fibroblastlar ve hücre dışı matriksten (ECM) oluşan bir tabaka bulunur8. Yumurtalık kanseri hücreleri, yumurtalık kanseri hücresi yapışmasını, istilasını ve metastazı artıran mezotelyal hücre astarında değişikliklere neden olan faktörler salgılar9,10. Over kanseri hücreleri integrin ve CD44 aracılı mekanizmalarla mezotelyal yüzeye yapışırlar (Şekil 1B)11-16.

Tarihsel olarak, yumurtalık kanserinin mikro çevre ile etkileşimlerini araştırmak için birkaç 3D model geliştirilmiştir. İncelenen ilk modellerden bazıları yumurtalık kanseri-ECM arayüzü17-21, yumurtalık kanseri-mezotelyal hücre iletişimi13,14,21-24 veya her ikiside 25 (tarafımızca gözden geçirildi 26). Niedbala ve ark. yumurtalık kanseri hücrelerinin ECM'ye mezotelyal hücrelere veya tek başına plastiğe göre daha hızlı ve daha sıkı bir yapışma gösterdiğini keşfetti25. Bununla birlikte, bu modeller histolojik olarak peritoneal mikroçevreye benzemiyordu. Bu nedenle, yumurtalık kanseri mikro çevresini daha kapsamlı bir şekilde çoğaltmak için 3D organotipik bir model oluşturduk. Yumurtalık kanserinin peritoneal yayılımında mikroçevrenin rolünü ve kanser ile peritoneal hücreler arasındaki etkileşimi daha iyi anlamak için, periton boşluğu astarının 3 boyutlu organotipik bir in vitro kültür modeli geliştirdik (Şekil 1C'de şematik). Önerilen model, birincil insan mezotelyal hücrelerinin bir tabakası ile kaplanmış birincil insan fibroblastları ve ECM'den oluşur - her hücre tipi insan omentumundan izole edilir. Histolojik olarak, bu model normal peritoneal veya omental astara benzer ve tümör mikro çevresini, kanser hücreleri ile normal doku arasındaki etkileşimi ve kanser hücresi yapışması, istilası ve proliferasyonusüreçlerini inceleyebileceğimiz bir yüzey sağlar 8.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tarif edilen tüm araştırma protokolleri Chicago Kurumsal Değerlendirme Kurulu Üniversitesi'nde (KİK) tarafından incelenmiştir. Aydınlatılmış onam ameliyattan önce her hastadan alındı ​​ve çalışma Chicago IRB Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Korunması için insan dokusu taşıma ve hücrelerin kontamine riskini azaltmak için ne zaman bir biyolojik güvenlik kabini tip 2 ve eldiven kullanılmalıdır.

Birincil dönüştürülmemiş Stromal Hücreleri 1. İzolasyon ve Kültür

  1. İnsan doku toplama ve hazırlama.
    1. Abdominal operasyon esnasında alınan insan omentum, 2 cm3, örneklerini elde edilir ve hemen RT fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) (Şekil 2A), dokuyu bırakın. X 2 cm omentum 3 cm'lik bir parçası, tipik olarak 1.000.000 birincil insan mezoteliyal hücreleri (HPMC) ve 200,000 primer insan fibroblastları ve normal omental fibroblastlar (NOF) verir.
    2. Doku 3 için 0.5 xg'de dalmış PBS aşağı Spindak kısa sürede sonra toplanması (<2 PBS içinde saat) ve 50 ml konik bir tüp içinde 20 ml taze PBS doku aktarın. 15 cm çapında, steril kültür çanak (Şekil 2B) neşter ile kıyma ile 5mm 3 parçaya doku yukarı kesti.
  2. Birincil insan mezotel hücre izolasyonu 8
    1. HPMC izole etmek için, 50 ml konik tüpler içine kıyılmış doku transferi ve katı parçaları üst (Şekil 2C-D) float için 1 dakika bekleyin. HPMC ve kırmızı kan hücrelerinin (RBC) alt kısmında sıvı içinde mevcut olacaktır. Borunun alt ve yeni bir konik tüp içine sıvının çıkması için bir pipet kullanın. 3 dakika boyunca 0.5 xg sıvıyı aşağı Spin ve HPMC / RBC pelet süpernatant aspire.
      1. , Kıyılmış dokuya 20 ml PBS eklemek doku, aşağı spin, yükselmeye bir pipet ile ve HPMC / RBC tüpüne alttan sıvıyı çıkarmak için izin ve kaldırın: işlemini üç kez tekrarlayınsüpernatant. Tüm spin tamamlanır ve süpernatan aspire edildikten sonra, pelet HPMC ve RBC'yi içerecektir.
    2. Plaka% 10 cenin sığır serumu [FBS],% 1 MEM vitamin [93 mg / L],% 1 MEM esansiyel olmayan amino asitler [81,4 tam büyüme ortamı, 15 ml DMEM (75 cm 2 şişe içine pelet tüm hücrelerin mg / L],% 1 penisilin streptomisin [Pen-strep, 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin]).
    3. Ek HPMCs izole etmek için ikinci bir PBS yıkama yapın.
      1. Doku üstüne yüzen ikincil PBS yıkama için, 200 rpm'de, 20 ml PBS içinde 10 dakika süreyle 37 ° C 'de geri kalan katı doku sallayın, daha sonra 1 dakika bekleyin. 3 dakika boyunca 0,5 x g'de santrifüj, yeni bir tüp içine tüpün altındaki sıvıyı çıkarın ve süpernatan aspire.
      2. Tam büyüme ortamı 15 ml ayrı 75 cm 2 şişe yıkama, ikincil PBS tüm HPMC / RBC Plate.
    4. Herhangi r izole etmek içinhacimce PBS solüsyonu: 1,% 0.25 tripsin, 25 mM EDTA: HPMC emaining, 1, 20 ml, 10 dakika boyunca, 200 rpm'de 37 ° C derece kıyılmış doku sallayın. Doku yükselmeye tüpün alt kısmında sıvı toplamak, yeni bir 50 ml tüp içine ve 0.5 gx 3 dakika aşağı dönmesine izin verin.
      1. Süpernatant aspire tam büyüme ortamında 15 ml ayrı 75 cm 2 şişe tüm HPMC / RBC plaka.
    5. Kültür nemlendirilmiş bir ortamda 37 ° C'de ve% 5 CO2 plakalandı hücreleri. Harcanan medya çıkarmadan günlerde 3 ve 5 tam büyüme ortamı 15 ml ekleyerek Yem kaplı hücreler. HPMC bölme önce 5-7 gün süre ile kültüre edilebilir.
      1. Orijinal fenotip dediferansiyonunu ve modifikasyonu en aza indirmek için tüm deneylerde (geçit 2 kadar) düşük geçit HPMC'ye kullanın. Faz kontrast capabilitie plastik diferansiyel girişim kontrast yetenekleri veya 4-20x amacı ile 20x objektif ile tercihen geniş alan mikroskobu kullanıns hücrelerinin tüm görüntüleri çekmek için (mikroskop faz kontrast filtreleri) ve 3,3'-diaminobenzidin (DAB) boyama immunohistokimyasal analiz parlak alanında 10x objektif ().
    6. HPMC cuboidal olduğunu onaylayın ve immunohistokimyasal 8 (Şekil 3A, C, E) gerçekleştirerek sitokeratinin 8 ve vimentinin ifade eder.
  3. NOF izolasyonu 8
    1. 1: 100 x Pen-Strep 1 karışımı bir 1: birleştirerek kollajenaz tip III çözeltisi (10 x) 'in bir stokunun 10 ml hazırlayın kollajenaz tip III 1500 ünite aktivite / ml PBS içinde hyaluronidaz 714 ünite aktivite / ml olmuştur.
    2. % 1 MEM vitamin [93 mg / L] ile serumsuz ortam içinde seyreltilmiş 10 kat kollajenaz tip III çözeltisi, 10 ml (DMEM 6 saat süre ile 200 rpm'de HPMC izolasyon sonra kalan kıyılmış omentum doku 37 ° C sallayın, % 1 MEM esansiyel olmayan amino asitler [81,4 mg / L],% 1 penisilin streptomisin [Pen-strep, 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin]). Sindirilmiş doku opak bakacağız ve bazı lifli enkaz (Şekil 2E) olabilir.
    3. Çözelti içeren NOF hücreleri Santrifüj oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 0,5 x g 'de süspansiyon halinde, süpernatan aspire tam büyüme ortamında 13 ml bir 75 cm'lik 2 şişeye pelet plaka.
    4. Eski ortamı çıkarın ve 24 saat sonra taze tam büyüme ortamı 15 ml ile değiştirin. NOF bölme önce 1-3 gün süre ile kültive edilebilir. Hücreler konfluense ulaştığınızda NOF notu çoğalması sona erecek.
    5. Birincil insan fibroblastlar, düz, uzun hücreler olduğunu onaylayın ve vimentinin ifade ama immünohistokimyasal 8 gerçekleştirerek 8 sitokeratin değil (Şekil 3B, D, F). Dediferansiyonunu en aza indirmek için (ideal geçit 3 öncesi) deneyler için düşük geçit NOF kullanın ve orijinal fenotip modifikasyonu. Hücrelerin her aşaması fotoğraf çekmek için plastik DIC yetenekleri ile 20x amacı ile geniş alan mikroskobu kullanınve parlak alanında 10x objektif immunohistokimyasal DAB boyama analiz etmek.

2. Organotipik Kültür 8 Kaplama

  1. En fazla 5 dakika boyunca 3 ml% 0.25 tripsin / EDTA 25 mM, ardından 10 ml PBS ile çalkalayın 75 cm kültür şişesi Yayın NOF. Tam büyüme ortamının en az 3 kez hacmi ile nötralize tripsin.
  2. 50 ml konik tüp içine tripsinize hücreleri aktarın ve 0.5 gx 3 dk aşağı doğru döndürün. Süpernatantı ve tam büyüme ortamı 5 ml kadar geri hücreleri getirmek. Kültür şişesi kurtarıldı hücreleri saymak için bir hücre sayacı kullanın.
  3. Bir 96-yuvalı, berrak tabanlı siyah plaka üzerine 100 ul başına 2000-4000 NOF plaka tam büyüme ortamı, uygun hacimde hücreleri ile seyreltilir. Kaplama önce hücre karışıma sıçan kuyruğu kollajen I 0.5 ug / 100 ul ekleyin. Let Hücrelerin en az 4 saat boyunca nemlendirilmiş bir ortamda% 5 CO2 içinde 37 ° C 'de oturup, ya da hücrelerin kadarplaka yüzeyine yapışır için.
  4. Adımlar 2.1 ve 2.2 açıklanan aynı yöntemleri kullanarak kültür şişesi HPMC bırakın. Tam büyüme ortamının uygun miktarda hücrelerin önceden 96 oyuklu plakalar içinde kollajen I kaplama NOF üstünde 50 ul başına 10,000-20,000 HPMC plaka seyreltin. Hücreler deney başlamadan önce en az 18 saat boyunca nemlendirilmiş bir ortamda% 5 CO2 içinde 37 ° C 'de bekletin.
  5. Tam büyüme ortamı HeyA8 yumurtalık kanser hücreleri -expressing Kültür yeşil flüoresan proteini (GFP). HeyA8 yumurtalık kanseri hücreleri, floresan kopepod cGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1) eksprese eden bir lentiviral vektör ekspresyonu ile etiketlenir. HeyA8 yumurtalık kanseri hücreleri, kullanım gününde (logaritmik büyüme fazı) üzerine% 80-90 ortak akışlı olmalıdır. Kültür hücreleri plakadan bırakın ve birincil hücreler için adımlar 2,1-2,2 açıklanan aynı yöntemleri kullanarak saymak.
  6. Yumurtalık kanseri hücreleri, 37 ° C'de 15-20 dakika boyunca tam bir büyüme ortamı içinde kurtarmak için izin verinkapaklı konik tüp gevşek kapatılmış.

3. Yapışma Deneyi 8

  1. İyileştikten sonra 0,5 xg'de 3 dakika boyunca iplik ile yumurtalık kanseri hücrelerini pellet haline getirmek ve daha sonra süpernatant kaldırmak ve 50.000 hücre / 100 ul bir konsantrasyona ulaşmak için serum içermeyen ortam, uygun hacimde hücreleri seyreltin.
  2. Harcanan ortam kaldırmak için HPMC / NOF Organotipik kültürler ile 96 oyuklu plakalar ters çevirin, ve her bir serumsuz ortam içinde kanser hücre süspansiyonu 100 ul ilave edin. 4 saat 30 dakika boyunca nemlendirilmiş bir ortamda% 5 CO2 içinde 37 ° C 'de plaka inkübe edin.
  3. Ortam ve yapışmayan hücreleri çıkarmak için 96 oyuklu plaka ters çevirin. Dikkatle ve yavaşça her kuyuya PBS 100 ul pipetlemeyin ve tekrar plaka ters düşük güçte bir çok kanallı pipet kullanın. PBS bir kez daha yıkayın tekrarlayın.
  4. PBS çıkarın ve her bir oyuğa 100 ul% 4 paraformaldehid eklemek için ters çevirin. Plaka 20 mil için bekletinn hücreleri gidermek için. 20 dakika sonra, plaka ters çevirin ve 100 ul PBS ilave edin.
  5. Toplam kuyu flüoresan kaydedilmemiştir veya hücre sayısı belirlenebilir unutmayın. Ölçümü için, 1.000.000 hücre / ml'lik bir konsantrasyonda HeyA8 hücreleri kullanılarak, iki kopya halinde birinci plaka standart eğrisi.
    1. Aşağı 1 milyon hücre iplik medya kaldırarak, ve onları 20 dakika boyunca 1 ml% 4 paraformaldehid oturup izin vererek standart eğri olun.
    2. Spin hücreleri tekrar PBS (anlattıklarında hücreleri 1000000 / ml konsantrasyon onaylamak için) ml 1'de getirmek. Levha 50.000, 40.000, 30.000, 20.000, 10.000, 5.000, 1.000, ve de her biri çifte biçimde içine 0 hücreleri, ve her çukur 50 ul'lik bir nihai toplam hacim PBS ilave edin.
  6. Alt yüksek kuyu (standart eğri üzerinde 50.000) ölçekleme, bir flüoresan plaka okuyucusu (uyarım = 488 nm, emisyon = 528 nm) ile kültür plakasına okuyun. Organotyp yapıştırılır kaç yumurtalık kanseri hücrelerini hesaplamak için standart eğri kullanınHer bir oyuğa (Şekil 4A-C) 'ic kültürü.

4. Proliferasyon Deneyi 10

  1. Yumurtalık kanseri hücreleri, geri sonra% 1 FBS (DMEM,% 1 FBS ortamı uygun hacimde hücreleri sulandırmak sonra 0.5 x g'de 3 dakika boyunca iplik hücreleri pelet,% 1 MEM (adım 2.5 ve yukarıda belirtilen 2,6 bakınız) vitaminler [93 mg / L],% 1 MEM esansiyel olmayan amino asitler [81,4 mg / L],% 1 penisilin streptomisin [Pen-Strep, 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin]) 4.000 hücre konsantrasyonu elde etmek için / 150 ul.
  2. Her bir oyuğa FBS ortamı harcanan ortamını çıkarın ve 1% kanser hücre süspansiyonu 150 ul eklemek için HPMC / NOF Organotipik kültürler ile 96 oyuklu plaka ters çevirin. 72 saat boyunca nemlendirilmiş bir ortamda% 5 CO2 içinde 37 ° C 'de plaka inkübe edin.
  3. Alt görece proliferasyonunu değerlendirmek için bir kez bir flüoresan plaka okuyucusu günde (uyarım = 488 nm, emisyon = 528 nm) kültür plaka okumahücre. 48 saat (Şekil 5A-C) 'de ortamının değiştirilmesi, 96 saat boyunca deney devam edin. (Plaka tercih edilir tersini) ortam değiştirirken kültürünü rahatsız etmemek için dikkatli olun.

5. Invasion Testi 8

  1. 3D kültür kaplama önce, 24 oyuklu bir kültür plakasına parçası (8 um gözenek boyutu) 200 ul PBS içinde 7.5 ug fare kuyruk kolajeni eklemek. Plaka inkübe O / N, daha sonra dikkatlice hemen kollajen kaplı ekler (yukarıdaki adım 2) üzerine HPMC / NOF organotipik kültürünü kaplama önce bir pipet ile PBS kaldırmak edelim.
  2. Adım 3.1 olarak yumurtalık kanseri hücrelerini hazırlayın. Ekler üzerinde organotipik kültürlerinin üzerine yumurtalık kanseri hücrelerini plaka dikkatle ekler üst fazla olan ortamı çıkarmak için bir pipet kullanın. Her bir oyuğa, serumsuz ortam içinde yumurtalık kanseri hücre süspansiyonu 100 ul ekle.
  3. Kanser hücresini ikna etmek için iyi bir ekin altındaki içine tam büyüme ortamı 750 ul ekleyinorganotipik kültürlerinin içine vasion. 24 saat boyunca nemlendirilmiş bir ortamda% 5 CO2 içinde 37 ° C 'de plaka inkübe edin.
    Not: Organotipik kültür ekleme çapraz ve ekin alt tarafında kalacaktır istila Yumurtalık kanseri hücrelerini.
  4. Boş kuyuya insert taşıyın, 24 saat sonra, maşa ile ekleme kavramak ve kısaca PBS beher durulayın. 1 dakikalık bir toplam pamuklu çubuk her iki yanına, her bir ek üst fýrçalayýn. Hızlı bir şekilde her bir 750 ul% 4 paraformaldehid içeren bir plaka içine ekleme yerleştirin. Her insert 750 ul PBS ile dolu kuyu içine ekler aktarmadan önce 10 dakika boyunca paraformaldehid oturup bekleyin.
  5. 2.5x büyütme mikroskop ile işgal hücreler (ekler dibine yapıştırılır ve sabit) görüntüleyin. Tüm kuyu görüş alanı içinde olduğu zaman, kaçınarak, 10x büyütme ayarlayın ve 5 resim, kuyunun her kadranda merkezine yakın bir ve 1 almakkenarlarına çok yakın görüntüler alarak. Her iyi için aynı desen izleyin.
  6. Onların protokole göre her bir kuyu (Şekil 6A-C) 'de alan başına işgal hücrelerin ortalama sayısını elde etmek için her görüntüdeki hücre sayısını saymak için üreticinin programı kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Organotipik kültürü ilk olarak kollajen tip I primer insan fibroblastları karıştırılması ve sonra mezotelyal hücrelerin 5 kez sayı ile bu kültürü overlaying tarafından toplandı. Yumurtalık kanseri hücreleri, yapışma, istilası veya proliferasyonunu çalışma ilave edilmeden önce, kültür en az 18 saat süreyle inkübe edildi. Her bir deney, çoklu tekrarlanmıştır (n = 5) ve istila deneyler (n = 3) (n = 3-5), farklı hastalara ve çok sayıda kuyu elde edilen 3D kültürleri yapışma her durumda test edildi (n = 5), proliferasyon . 4...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Periton mikroçevresinin bir Organotipik modeli yumurtalık kanseri yayılmasına mikroçevresinin hücresel ve doğuştan bileşenlerin hem bireysel ve kolektif işlev (ler) değerlendirmek için kurulmuştur. Yumurtalık kanseri hücre yapışması, proliferasyon ve istila araştırmak için 3D Organotipik kültürü kaplama ve uyarlama için özel protokolleri temin edilmektedir. Primer insan omental mezotel hücreleri ve fibroblastlar hastalardan izole edilen ve normal morfoloji ve hasta varyasyonu korumak için erken bir pasajda kullanılmıştı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Tüm asistanlara ve katılan doktorlara, özellikle de Dr. A.F. Haney'e (Chicago Üniversitesi, Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı) omental biyopsileri topladıkları için teşekkür ederiz. Ayrıca, bu el yazmasını dikkatli bir şekilde düzenledikleri için Stacey Tobin ve Gail Isenberg'e teşekkür ederiz. Bu çalışma, Chicago Bears Futbol Kulübü'nün hayırsever yararlanıcısı Bears Care, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (NINDS) R21 NS075702 ve Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından R01 CA111882 E.L. tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1. Birincil hücrelerin izolasyonu ve kültürü
PBSFisher ScientificSH3001304
Tek kenarlı tıraş bıçağıFisher Scientific12-640
15 cm kültürkapları BD Biosciences353025
Cam şişe??
Fetal Sığır Serumu (FBS)Yaşam Teknolojileri16000044_3616914956
L-Glutamin ile DMEMCorning10-013-CV
MEM VitaminleriCorning25-020-Cl
MEM Esansiyel olmayan amino asitlerCorning25-025-CI
Penisilin-StreptomisinCorning30-002-CI
Çalkalayıcı Thermo-FisherMaxQ 4450
SantrifüjEppendorf5702
İnkübatörThermo-FisherForma Seri II Su Ceketli CO2 İnkübatör Modeli 3100
Tripsin EDTA, 1x (% 0.25)Corning25-053-CI
HyaluronidazWorthington BiyokimyasalLS002592
T-75 ŞişeleriBD Biosciences
T-175 ŞişelerBD Biosciences353112
Pipet uçlarıRaininP2, P10, P20, P200 ve P1000
Pipet uçlarıCorningFiltreli uçlar P2, P10, P20, P200 ve P1000
Reaktifin / Ekipmanın AdıCompanyKatalog NumarasıYorumlar / Açıklama< / güçlü>
2. Kaplama 3D kültür< / güçlü >
Hücre SayacıInvitrogenKontes
Kontes Hücre Sayma Odası SlaytlarıInvitrogenC10313
Tripan Mavi Leke (% 0.4)Gibco15250-061
Kollajen Tip I (Sıçan Kuyruğu)BD Biosciences354236
96 kuyulu plaka, şeffaf alt, siyahBD Biosciences353219
Reaktifin / Ekipmanın Adı< / strong>Company< / strong>Katalog Numarası< / strong> Yorumlar / Açıklama< / strong>
3. Yapışma testi
Çok kanallı pipetEppendorfXplorer 300
Paraformaldehit çözeltisi PBSSanta Cruz Biyoteknolojisc-281692'de
Plaka okuyucuMoleküler CihazlarMinimax
Reaktifin / Ekipmanın AdıCompanyKatalog NumarasıYorumlar/Açıklama
5. İstila testi< / güçlü >
Hücre Kültürü Ekleri (8um, 24 kuyulu)BD Biosciences353097
Pamuklu çubuklarQ-uçlupamuklu çubuklar
MikroskopZeissAxiovert 200m
Hücre Profilleyicikamu malı
24 kuyulu plakaBD Biosciences353047
Reaktifin / Ekipmanın Adı< / strong><strong>Company< ><strong> Katalog Numarası< / strong><strong> Yorumlar / Açıklama< / strong>
6. Antikorlar< / güçlü >
Anti-Integrin ve alfa; V ve beta; 3 Antikor, klon LM609EMD Millipore MAB1976
Beta 1 OncosynergyOS2966
Alpha 5 [CD49e]ID Pharmingen555615
Beta 4 [CD104]EMD MilliporeMAB 2058
353136%4

Kaynaklar

  1. Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
  2. Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am. J. Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
  3. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat. Med. 19, 1423-1437 (2013).
  4. Correia, A. L., Bissell, M. J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance. Drug Resist Updat. 15, 39-49 (2012).
  5. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: Functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
  6. Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nat. Med. 17, 1498-1503 (2011).
  7. Daya, D., McCaughy, W. T. Pathology of the peritoneum: A review of selected topics. Semin. Diagn. Pathol. 8, 277-289 (1991).
  8. Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells. Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
  9. Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J. Clin. Invest. 118, 1367-1379 (2008).
  10. Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).
  11. Strobel, T., Cannistra, S. A. β1-integrins partly mediate binding of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro. Gynecol. Oncol. 73, 362-367 (1999).
  12. Strobel, T., Swanson, L., Cannistra, S. A. In vivo inhibition of CD44 limits intra-abdominal spread of a human ovarian cancer xenograft in nude mice: A novel role for CD 44 in the process of peritoneal implantation. Cancer Res. 57, 1228-1232 (1997).
  13. Iwanicki, M., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).
  14. Lessan, K., Aguiar, D., Oegema, T. R., Siebenson, L., Skubitz, A. P. CD44 and β1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells. Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).
  15. Ahmed, N., Riley, C., Rice, G., Quinn, M. Role of integrin receptors for fibronectin, collagen and laminin in the regulation of ovarian carcinoma functions in response to a matrix microenvironment. Clin. Exp. Metastasis. 22, 391-402 (2005).
  16. Kaur, S., et al. β3-integrin expression on tumor cells inhibits tumor progression, reduces metastasis, and is associated with a favorable prognosis in patients with ovarian cancer. Am. J. Pathol. 175, 2184-2196 (2009).
  17. Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. In vitro degradation of extracellular matrix by human ovarian carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 5, 181-197 (1987).
  18. Kanemoto, T., Martin, G. R., Hamilton, T. C., Fridman, R. Effects of synthetic peptides and protease inhibitors on the interaction of a human ovarian cancer cell line (NIH:OVCAR-3) with a reconstituted basement membrane (matrigel). Invasion Metastasis. 11, 84-92 (1991).
  19. Rieppi, M., et al. Mesothelial cells induce the motility of human ovarian carcinoma cells. Int. J. Cancer. 80, 303-307 (1999).
  20. Barbolina, M. V., Adley, B. P., Ariztia, E. V., Liu, Y., Stack, M. S. Microenvironmental regulation of membrane type 1 matrix metalloproteinase activity in ovarian carcinoma cells via collagen-induced EGR1 expression. J. Biol. Chem. 282, 4924-4931 (2007).
  21. Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
  22. Suzuki, N., et al. HMOCC-1, a human monoclonal antibody that inhibits adhesion of ovarian cancer cells to human mesothelial cells. Gynecol. Oncol. 95, 290-298 (2004).
  23. Kishikawa, T., et al. Two distinct pattern of peritoneal involvement shown by in vitro and in vivo ovarian cancer dissemination models. Invas. Metast. 15, 11-21 (1995).
  24. Casey, R. C., et al. Establishment of an in vitro assay to measure the invasion of ovarian carcinoma cells through mesothelial cell monolayers. Clin. Exp. Metastasis. 20, 343-356 (2003).
  25. Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. Exp. Cell Res. 160, 499-513 (1985).
  26. White, E. A., Kenny, H. A., Lengyel, E. Three-Dimensional modeling of ovarian cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. 79-80, 184-192 (2014).
  27. Kenny, H. A., et al. Quantitative high throughput screening using a primary human three-dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy. Nature Comm. , (2015).
  28. Sawada, K., et al. c-Met overexpression is a prognostic factor in ovarian cancer and an effective target for inhibition of peritoneal dissemination and invasion. Cancer Res. 67, 1670-1680 (2007).
  29. Kenny, H. A., Lengyel, E. MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis. Cell cycle. 8, 683-688 (2009).
  30. Sawada, K., et al. Loss of E-cadherin promotes ovarian cancer metastasis via alpha 5-integrin, which is a therapeutic target. Cancer Res. 68, 2329-2339 (2008).
  31. Mitra, A. K., et al. Ligand-independent activation of c-Met by fibronectin and α(5)β(1)-integrin regulates ovarian cancer invasion and metastasis. Oncogene. 30, 1566-1576 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Periton Kavitesi ModeliPrimer İnsan Mezotelyal HücreleriNormal Omentum FibroblastlarıKanser Hücresi AdhezyonuKanser Hücresi İnvazyonuKanser Hücresi ProliferasyonuRGD Peptit İnhibisyonuİntegrin Bloklayan Antikorlar
İnsan periton boşluğuna bir Organotipik Kültür Yumurtalık Kanseri Yaygınlaştırılması Erken Adımlar Modelleme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.