Method Article

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Yaratılan Endoderm Hücrelerinin Saflaştırılması Hızlı ve Etkin Yöntem

DOI:

10.3791/53655

⸱

March 3rd, 2016

 ,  , 
1Institute of Clinical Biochemistry, Hannover Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, alt uygulamalar ve diğer farklılıklar iyileştirilmesi için kesin endoderm doğru kararlı farklılaştırılmış insan embriyonik kök hücrelerinin saflaştırılması için bir yöntem açıklanmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

embriyonik kök hücrelerin (ESCs) halinde pluripotent kök hücrelerin farklılaşması yetenekleri hücre yenileme terapisi için potansiyel bir terapötik uygulama sağlar. Terminal olarak farklılaşmış hücre türleri., Çeşitli dejeneratif hastalıkların tedavisinde kullanılan, akciğer, karaciğer ve pankreas dokularında karşı bu hücrelerin in vitro farklılaşma, bir birinci basamak olarak kesin endodermal hücrelerinin üretilmesini gerektirir edilebilir. Bu adım, oran-sınırlayıcı insülin üreten beta hücrelerinin hepatositlere ya da diğer endoderm türetilmiş hücre türleri terminal olgun hücre tipleri yönünde daha fazla türev içindir. endoderm soy doğru kararlıyız Hücreler çok böyle FOXA2, SOX17, HNF1B GATA aile üyeleri ve yüzey reseptörü CXCR4 olarak transkripsiyon faktörlerinin çok sayıda ifade eder. Ancak, farklılaşma protokolleri nadiren% 100 etkilidir. Burada, farklılaşma sonra CXCR4 + hücre popülasyonunun saflaştırılması için bir yöntem açıklanmaktadırManyetik mikroboncuklarm kullanarak DE içine. Bu saflaştırma ek istenmeyen soy hücreleri ortadan kaldırır. yumuşak bir saflaştırma yöntemi, hızlı ve güvenilir olduğu ve aşağı doğru uygulamalar ve farklılaşmaları geliştirmek için kullanılabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

embriyonik kök hücrelerin (ESCs) halinde pluripotent kök hücreleri, insan vücudunun hemen hemen herhangi bir hücre türü ayırt etmek yeteneğine sahiptir. Bu nedenle, in vitro farklılaşma protokolleri, kardiyomiyositlerde 1, hepatositler 2, beta hücreleri 3 akciğer epitelyal 4 ya da nöronal hücrelerin 5 gibi çok sayıda yetişkin hücre türleri oluşturmak için de kullanılabilir. Bu ESCS çeşitli dejeneratif hastalıkların 3 potansiyel tedavisi için değerli bir araç sağlar.

Akciğer, karaciğer ve pankreas yetişkin dokularda doğru EKH in vitro farklılaşma kesin endo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kesin endoderm doğru İnsan ESC 1. Farklılaşma

  1. 37 ° C'de bir kuluçka insan embriyonik kök hücreleri (ESCs) yetiştirmek ve% 5 CO2.
  2. Coat bazal membran matris 1 ml yeni 6 oyuklu hücre kültürü plakasının ve oda sıcaklığında en az 30 dakika süre ile kültür eşya inkübe edin. Belirli ayrıntılar için ilgili üreticinin talimatlarına çevirmek lütfen.
  3. Kültürlü insan EKH (örneğin, 4X) düşük büyütme kullanılarak mikroskop altında% 80 -90% confluency ulaşmış emin olun. steril cam Pasteur pipetiyle orta kapalı emerek boşluklardan gelen orta aspire. Fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi ile bir kez hücreler yıkanır. Bunun için, usu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

farklılaşma üzerine EKH gen ve protein ekspresyonu köklü değişim geçirirler. 1 başarılı endoderm farklılaşmasını kontrol etmek için kullanılabilecek tipik marker genleri tasvir etmektedir. Bir gen ekspresyon analizi için ana hedeflerdir GSC, FOXA2 ve SOX17 bulunmaktadır. Farklılaşmamış EKH karşılaştırıldığında göreceli gen ekspresyon analizi, özellikle FOXA2 ve SOX17> 2.000 kat artmıştır........

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şu anda kullanılan farklılaşma protokolleri nadiren% 100 farklılaşmış hücrelerin neden. hala ele alınması gereken nedenlerden dolayı bazı hücreler farklılaşma sürecini karşı. kullanılan farklılaşma protokolünün verimlilik ve ESC eğilimi bağlı kalan pluripotent hücrelerin belirli bir sayıda yaygın, hatta kesin endoderm içine farklılaşma sonra gözlenir hattı. Bunlar artık hücreler gibi transkriptomik, proteomik ve miRNA ifade analizi olarak aşağı farklılaşmaları veya daha fazla analiz bozabilir. Kalıntı pluripotent hücrel.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jasmin Kresse usta teknik yardım minnetle kabul edilmektedir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hues8 insan embriyonik kök hücre hattıHarvard Kök hücre ve rejeneratif biyolojiEndoderm üretimi için uygun hücre hattı
Hes3 insan embriyonik kök hücre hattıES Cell InternationalEndoderm üretimi için uygun ve sağlam hücre hattı
mTeSR1Kök Hücre Teknolojileri5850ESC kültür ortamı
FCSBiowestS1860
Gelişmiş RPMI 1640Yaşam Teknolojileri12633012
CD184 (CXCR4)-APC, insanMiltenyi Biotec130-098-357
anti-APC MicroBeadsMiltenyi Biotec130-090-855 
OctoMACS AyırıcıMiltenyi Biotec130-042-109manyetik alan
Y-27632Selleck ChemicalsS1049ROCK inhibitörü
CHIR-99021Tocris Bioscience4423
Activin APeprotech120-14
Nazik Hücre Ayrışması ReaktifiKök Hücre Teknolojileri7174Enzim içermez pasaj çözümü, alternatif: Tripsin/EDTA
Matrigel*Corning354277bazal membran matrisi
* -80 °C'de alikotlarda çözün ve saklayın; C, tedarikçi kılavuzunda belirtildiği gibi. Kullandıktan sonra buz üzerinde çözdürün, 25 ml buz gibi nakavt DMEM/F-12.
6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 1 ml ekleyin ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin.
Matrijeli çıkarın ve hemen kullanın.
MS SütunlarıMiltenyi Biotec30-042-201
MACS AyırıcıMiltenyi Biotec130-042-302
İnsan FOXA2 FW
gggagcggtgaagatgga		Yaşam TeknolojileriNA
İnsan FOXA2 REV
tcatgttgctcacggaggagta		Yaşam Teknolojileri
İnsan GSC FW
gaggagaaagtgggggtctggtt		Hayat Teknolojiler
İnsan GSC REV
ctctgatgaggaccgcttctg		Yaşam Teknolojileri
SOX17 TaqMan tahliliHs00751752_s1Uygulamalı Biyosistemler
SOX7 FW
gatgctgggaaagtcgtggaagg		Yaşam Teknolojileri
İnsan SOX7 REV7 REV
tgcgcggccggtacttgtag		Yaşam Teknolojileri
İnsan POU5F1 FW
cttgctgcagaagtgggtggagg		Yaşam Teknolojileri
İnsan POU5F1 REV
ctgcagtgtgggtttcgggca		Yaşam Teknolojileri
İnsan Nanog FW
ccgagggcagacatcatcc		Yaşam Teknolojileri
İnsan Nanog REV
ccatccactgccacatcttct		Yaşam Teknolojileri
İnsan TBP FW
caa cag cct gcc acc tta cgc tc		Yaşam Teknolojileri
İnsan TBP REV
agg ctg tgg ggt cag tcc agt g		Yaşam Teknolojileri
İnsan TUBA1A FW
ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c		Yaşam Teknolojileri
İnsan TUBA1A REV
tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g Yaşam		Teknolojileri
İnsan G6PD FW
agg ccg tca cca aga aca ttc a		Yaşam Teknolojileri
İnsan G6PD REV
cga tga tgc ggt tcc agc cta t 		Yaşam Teknolojileri
Anti-SOX2Santa Cruz Biyoteknolojisc-17320
Anti-FOXA2MerckMillipore07-633
Anti-SOX17R& D SistemleriAF1924
Bölümü İnsan

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J Vis Exp. (97), (2015).
  2. Sgodda, M., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Endoderm Cell PurificationHuman Embryonic Stem CellsCXCR4 Positive CellsMagnetic Bead SeparationDefinitive Endoderm DifferentiationFlow Cytometry AnalysisBasement Membrane CoatingROCK Inhibitor SupplementationCell Surface MarkerEndoderm Induction Medium

Related Articles