Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

qPCR sayesinde küçük hücre dışı akciğer kanseri (KHDAK) Hasta Plazma içinde Exosomal miRNA Analizi: Bir Uygulanabilir Sıvı Biyopsi Aracı

10.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/53900

⸱

27 Mayıs 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biopathology and Medical Biotechnology, Section of Biology and Genetics, University of Palermo, 2Phase I-Early Clinical Trials Unit, Oncology Department, Antwerp University Hospital (UZA), 3Center for Oncological Research (CORE), Antwerp University, 4Department of Surgical, Oncological and Oral Sciences, Section of Medical Oncology, University of Palermo, 5Flemish Institute for Technological Research (VITO), 6CORE, Campus Groenenborger, Antwerp University, 7Molecular Pathology, Pathology Department, Antwerp University Hospital (UZA), 8Oncology Department, Antwerp University Hospital (UZA)

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, dolaşımdaki miRNA'ların kontaminasyonunu önlemek ve NSCLC'deki biyobelirteç özelliklerini değerlendirmek için NSCLC hastalarının plazmasında salınan eksozomlarda miRNA profillemesinin Proteinaz K ve RNAse tedavileri ile ticari bir eksozom izolasyon kiti aracılığıyla gerçekleştirilmesinin fizibilitesini açıklar.

Özet

NSCLC'de diğerlerinin yanı sıra EGFR ve ALK genlerindeki değişikliklerin keşfi, seçici tirozin kinaz inhibitörleri (TKI'ler) kullanılarak hedefe yönelik ilaç tedavisinin geliştirilmesine yol açmıştır. Bu TKI'lerin kullanımını optimize etmek için, erken teşhis ve hastalığın ilerlemesi için yeni biyobelirteçlerin keşfi zorunludur. Bu plazma izole eksozomlar, bu biyobelirteçlerin tespiti ve takibi için non-invaziv ve tekrarlanabilir bir yol olarak kullanılabilir. Farklı mutasyonlara ve tedavilere sahip 12 KHDAK hastasından (ve kontrol olarak 6 sağlıklı donörden) bir ml plazma eksozom kaynağı olarak kullanıldı. RNAse işleminden sonra, dolaşımdaki miRNA'ları parçalamak için, eksozomlar ticari bir kit ile izole edildi ve daha fazla analiz için spesifik tamponlarda yeniden süspanse edildi. Eksozomlar, ALIX ve TSG101 için western blotlama ve bu nanoveziküllerin biyokimyasal ve boyutsal verilerini elde etmek için standart teknikler olan transmisyon elektron mikroskobu (TEM) analizi ile karakterize edildi. Total RNA ekstraksiyonu, yüksek verimli bir ticari kit ile gerçekleştirildi. Eksozomlardaki sınırlı miRNA içeriği nedeniyle, seçilen her miRNA için ayrı bir test kullanarak retro-transkripsiyon PCR yapmaya karar verdik. Tümü NSCLC hastalığı ile ilişkili olan bir miRNA paneli (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), Gerçek Zamanlı PCR analizinin dikkate değer duyarlılığı ve özgüllüğünden yararlanılarak analiz edildi; Endojen kontrol olarak mir-1228-3P kullanıldı ve veriler 2-ΔΔct 13 formülüne göre işlendi. Kontrol değerleri referans değer olarak kullanılmış ve sonuçlar logaritmik ölçekte gösterilmiştir.

Giriş

KHDAK (küçük hücre dışı akciğer kanseri) hastalarında düşük sağkalım oranı ilerlemiş hastalık ve kötü erken teşhis 1 tedavilerin sınırlı etkinliği kaynaklanmaktadır. NSCLC hasta alt grubunda keşfedilmiştir EGFR gen aktive eden mutasyonu, kinaz inhibitörleri (TKİ) tirozin hassasiyet kazandırdığı bilinmektedir. Ne yazık ki, EGFR mutasyona uğramış KHDAK hastalarının çoğunluğu TKİ direncini 2 gelişir. Özellikle, bu bağlamda, bir doğru tanı zorunludur. nedeniyle tümörlerin lokalizasyonu, için, genel olarak KHDAK biyopsi dokusu elde her zaman mümkün değildir. Bu nedenle, çeşitli çalışmalar bu biyolojik veriler elde etmek non-invaziv yöntemler kullanan devam etmektedir. Eksozomlar non-invaziv tekniklerin 3 ile tanısal ve prognostik değerlerini elde etmek için incelenmiştir olabilir sıvı biyopsi bileşenler olarak tarif edilmiştir.

e - (100 nm çapında 40) eksozomlar nanovesicles vardırFizyolojik ve patolojik koşullar 4 hem de farklı hücre tipleri tarafından yayımlanan ndocytic kökenli. Onlar, protein, lipidler, mRNA ve microRNA taşıyabilir. Ayrıca, çeşitli çalışmalarda tümör hücreleri, anjiyogenez, stromal ve hücre dışı matriks yeniden ve ilaç direncinin 5 büyüme ve hayatta kalma etkileyebilir tümör kaynaklı Eksozomlann, bir pleiotropik rol oynadığını düşündürmektedir.

MikroRNA'lar (miRNA'ların) hedef mRNA 3'-UTR bağlanması ve bozunmaya karşı ya da olmayan bir çeviri 6 mRNA lider, transkripsiyon sonrası düzenleme katılan kısa kodlayıcı olmayan RNA bulunmaktadır. Eksozomlann içine miRNA'ların seçici sıralama tarif edilmiştir. Bu bağlamda, son zamanlarda, in vitro ve in vivo olarak, kurkumin tedavisi 7 sonrası kronik miyelojen lösemi hücre hatları tarafından yayımlanan eksozom Mir-21 (onkogenik etkiler ile iyi bilinen bir miRNA'nın) seçici bir ambalaj gösterilmiştir.

exosomal miRNA profil primer tümörün miRNA profiline benzer ve bu özellik erken tanı ve prognoz 3 yararlanılabilir. Spesifik olarak, gerçek zamanlı PCR ile, karakterize etmek için bir olasılık, hastalığın moleküler profili ile ilişkili seçilen miRNA'lar örn., Diğerlerinin 8 arasında EGFR mutasyonları.

Burada, NSCLC dekorele miRNA'ların 8-9 seçilmiş bir panelin analizi NSCLC hastaların kanında serbest eksozom izole edildi açıklanmaktadır. hastalardan onam raporu bilgilendirmek alındıktan sonra, 12 KHDAK hastalarında ve 6 sağlıklı kontrollerin plazma, analiz edildi. eksozom yalıtım üreticinin protokolüne göre, ticari kiti ile gerçekleştirildi. eksozom izolasyon önce plazma numuneleri kirletici dolaşım miRNA'lar indirgeme amacıyla, RNase ile muamele edilmiştir. Biz nedeniyle diğer Techni sınırlı standardizasyona ticari kit ile bu analizi gerçekleştirmek için kararklinik örneklerden çalışırken özellikle önemlidir ques (örn., Ultrasantrifügasyon). Bu kit RNAse aşağılamak ve böylece exosome Parçalama işleminden sonra exosomal miRNA'lar düşmeye riskini azaltır bir Proteinaz K tedavisi içerir. MikroRNA analizi duyarlı ve spesifik Real-Time PCR analizi ile yapıldı; mir 1228-3p, formül 2'ye uygun bir endojen bir kontrol olarak kullanıldı ve veri normalleştirildi - ΔΔct. Kontrol değerleri temel olarak kullanılır ve Sonuçlar bir logaritmik skalada gösterilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Exosome İzolasyonu

Not: Plazma örneklerinden eksozomlann izole, üreticinin protokolüne uygun olarak ve ekleme RNAse işlenerek, ticari bir kit ile gerçekleştirildi: (bu adım biyolojik numunelerin manipülasyonu için özel yasal prosedür takip kişisel ve çevre koruma ekipmanları ile gerçekleştirilmelidir ).

  1. -80 ° C'de saklandı Her örneğin plazma 1 ml, alın ve buz üzerine yerleştirin.
  2. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 2000 x g'de santrifüjleyin; Bu pasaj hücreleri ve enkaz kaldırmak için zorunludur.
  3. yeni bir 1.5 ml'lik tübe temiz plazma ihtiva eden üst sıvıyı aktarın.
  4. Oda sıcaklığında 20 dakika süre ile 10,000 x g 'de, yeni bir tüp santrifüjleyin.
  5. yeni bir 1.5 ml'lik tübe temiz plazma ihtiva eden üst sıvıyı aktarın.
  6. 10 dakika içinde 37 ° C 'de tüp süpernatana RNAse 100 ng / ml ilave edilir ve kuluçkayaSipariş RNA'ların dolaşan aşağılamak için.
  7. Yeni 2 ml tüp tüm tedavi plazma aktarın ve 1x PBS 0.5 hacim kazandırmak.
  8. çözümler karıştırmak için örnek vorteksleyin.
  9. Örnek Proteinaz K çözeltisi (kit içine) 0,05 hacimleri ekleyin.
  10. Girdap numune ve daha sonra 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  11. örnek exosome yağış tamponu 0.2 hacim kazandırmak ve tersine çevirerek çözüm karıştırın.
  12. 30 dakika boyunca 8 ° C, 2 ° C 'de örnek inkübe ve daha sonra oda sıcaklığında 5 dakika için 10,000 x g'de santrifüjleyin.
  13. Aspire ve supernatant atın. Pelet izole eksozomlar içerir.
  14. eksozomlar tekrar süspansiyon için, eksozom pelet seçili geçici bellek ekleyin. Tampon seçimi, bu durumda, planlanan alt analiz bağlıdır:
    1. TEM analizi gerçekleştirmek için 1x PBS 100 ul ekle.
    2. Spesifik liziz BUF 346.5 ul ekle(Ticari kit) RNA ekstraksiyonu (: kimyasal tehlike DİKKAT) için fer.
    3. ekstraksiyon için lizis tamponu 100 ul ekle (Tris-HCI 50 mM, pH 7.6 - NaCl 300 mM - Triton X-100% 0.5 - PMSF 1 mM - Löpeptin / Aprotinin 10 ug / ml) Western Blot analizi gerçekleştirmek için. (DİKKAT: kimyasal tehlikeler).
  15. -20 ° C'de yeniden süspansiyon haline eksozomlar saklayın.

Western Blot analizi ile 2. Exosome Karakterizasyonu

Not: İzole nanovesicles karakterize etmek için, Alix ve TSG101 (iyi bilinen exosomal işaretleri) karşı antikorlar ile Western blot önerilir.

  1. Liziz tamponu eksozom pelet yeniden süspansiyon işleminden sonra, exosomal membran çözünmesi için 1 saat boyunca buz üzerine yerleştirin.
  2. 10 dakika için 12,000 g'da lizat santrifüj ile pelet bozmadan yeni bir tüpe süpernatantı aktarın.
  3. toplam exosomal protein conten ölçmekBradford tahlili ya da başka yöntemler ile T ve yük Tris / glisin SDS içinde oyuk başına proteinlerin 50 ug -% 8 poliakrilamid jeli. (DİKKAT: kimyasal tehlikeler).
  4. kimyasal: (25 mM Tris, 192 mM glisin,% 0.1 SDS), 1 saat boyunca 120 V'de 30 dakika (DİKKAT tamponu ile çalışan,% 8 SDS-PAGE jel elektroforezi proteinleri (ve uygun moleküler ağırlıklı işaretleyici) Ayrı ).
  5. (: Kimyasal tehlikeler DİKKAT) sabit bir 50 V de 1 saat boyunca 4 ° C soğuk transfer tampon maddesi (25 mM Tris, 192 mM glisin,% 20 metanol) ile yapılan elektro bir nitroselüloz membran proteini aktarın.
  6. 1x TBS -Tween% 0.1 içinde% 5 yağsız kuru süt ile yavaş ajitasyon 1 st için membran engeller.
  7. Tween,% 0.1 - 1 x TBS ile hızlı bir çalkalama, 5 dakika boyunca zarın 4 kez yıkayın.
  8. Alix ve uygun tampon içinde TSG101 (membranı başına bir) karşı birincil antikor ekleyin (buna göre üreticiden antikor veri sayfasına) ve membran O / N inkübe; Yavaş ajitasyon.
  9. Aşırı antikorları ayıklamak için Tween,% 0.1 - 1 x membrana TBS ile hızlı bir çalkalama içinde 5 dakika için 5 kez yıkayın.
  10. Uygun tampon maddesi içinde (dolayısıyla bir üreticiden antikor veri sayfasına) uygun bir ikincil antikor ilave edin ve yavaş ajitasyon 1 st için membran inkübe edin.
  11. Aşırı antikorları ayıklamak için Tween,% 0.1 - 1 x membrana TBS ile hızlı bir çalkalama içinde 5 dakika için 5 kez yıkayın.
  12. Kemiluminesan analizi 11 tarafından seçilen protein algılar.

TEM Analizi ile 3. Exosome Karakterizasyonu

Not: İzole eksozomlar görselleştirmek için, TEM (Transmisyon Elektron Mikroskobu) analizi yapılmıştır.

  1. Talep ~ 10 ug, bir Parafilm 1x PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirildi sağlam eksozomlann numunenin (daha önce Bradford tahlili ile nicelleştirilmiştir) ve örnek alınır, 1 saat boyunca bir formvar karbon kaplı nikel ızgara bırakın.
  2. PBS damla 1x üç 40 ul üzerine konumlandırarak grid 3 kere yıkayın.
  3. Beş 30 ul ultra saf su damlaları üzerine konumlandırarak ızgara 5 kez yıkayın.
  4. 10 dakika:% 2.5 gluteraldehit (kimyasal tehlike DİKKAT) bir damla ekleyerek örnek sabitleyin.
  5. PBS damla 1x üç 40 ul üzerine konumlandırarak grid 3 kere yıkayın.
  6. % 2 uranil asetat bir damla ekleyin (DİKKAT: kimyasal tehlikeler) ve örnek kontrast için 15 dakika süreyle bunun üstüne ızgara koydu.
  7. % 0.13 metilselüloz damla örnek yerleştirme (DİKKAT: Kimyasal tehlikeleri) ve% 0.4 uranil asetat ve 10 dakika boyunca damla üstüne ızgara inkübe edilir.
  8. Yavaşça bir emici kağıt sıvı aşırı kaldırmak ve kaplamalı yüzü yukarı bakacak şekilde 5 dakika süreyle ızgara kurutun.
  9. Transmisyon elektron mikroskobu 12 tarafından ızgara inceleyin.

4. Exosomal RNA Ekstraksiyon ve miktarının belirlenmesi

Not: yönlü kullan kararüreticinin protokolüne göre, bir ticari kit kullanılarak exosomal örneklerinden total RNA ekstraksiyonu kapatýnýz: (DİKKAT: kimyasal tehlikeler, üreticinin protokolü ve yönergeleri gözden).

  1. lizis tamponu 346,5 ul exosome pelet tabanda sonra β-mercaptoethanol 3.5 ul ekleyin: kuvvetlice (DİKKAT kimyasal tehlikeler) ve vorteks; Bu pasaj, lipid membranlar yok etmek için zorunludur.
  2. 1 dakika boyunca 11.000 x g'de bir toplama tüpüne ve santrifüj yıkama kolonuna lizat ekleyin. Santrifüj işleminden sonra, kolon atın ve yeni bir 1.5 mL RNaz içermeyen tüp filtrat aktarın.
  3. % 70 Etanol 350 ul ekleyin (DİKKAT: kimyasal tehlikeler) ve 5 saniye boyunca vorteks karıştırın.
  4. 8000 x g'de 30 saniye boyunca çözme sütun ve santrifüj lizat yükleyin. Santrifüj işleminden sonra flowthrough atmak ve yeni bir toplama tüpüne sütun aktarın.
  5. tuzsuzlaştırma Buffe 350 ul yükleyin1 dakika boyunca 11.000 x g'de r ve santrifüj. Santrifüj işleminden sonra flowthrough atmak ve aynı toplama tüpüne sütun döndürür.
  6. sütun silis membranı üzerinde DNaz I, reaksiyon karışımı 95 ul (yeniden DNase 10 ul I her bir örnek için, DNase tamponu 90 ul +) ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. (DİKKAT: kimyasal tehlike)
  7. 1 dakika boyunca 11.000 x g'de kolon ve santrifüj: (kimyasal tehlike DİKKAT) yıkama tamponu 200 ul ekleyin. Yeni bir toplama tüpüne sütun yerleştirin.
  8. 1 dakika süre ile 11,000 x g 'de kolon ve santrifüj yıkama tampon 600 ul ekle. Santrifüj işleminden sonra, flowthrough atmak ve aynı toplama tüpüne sütun yerleştirin.
  9. 2 dakika boyunca 11.000 x g'de kolon ve santrifüj yıkama tamponu 250 ul ekleyin. 1.5 ml RNAse ücretsiz tüp içine sütun yerleştirin.
  10. 11.000 RNaz içermeyen su 40 ul RNA ve santrifüj Zehir 5; için 1 dakika için G, bu küçük bir hacim içinde, yüksek bir RNA konsantrasyonu elde etmek için.
  11. Hemen -80 ° C 'de potansiyel degradasyonu veya mağaza önlemek için buz üzerinde elüt RNA yerleştirin.
  12. RNA içeriği ölçmek. Not: Burada, RNA nicemleme spektrofotometre ile numunenin 1 ul kullanılarak yapıldı.

Exosomal miRNA'lar 5. Retrotrascription

Not: eksozom bölgesindeki miRNA'ların içeriği açıklanan sınırlı miktarına, her miRNA için ayrı bir deney kullanılarak ticari bir kit ile seçilen miRNA'ların ters transkripsiyon yapılmasına karar edildi nedeniyle, imalatçının protokolüne göre yöntem. Her bir örnek için, NSCLC durumuna ilişkili 8 miRNA'ların (miR-30b seçilmiştir; miR-103;, miR-122; miR-195; miR-203; miR-221; miR-222 ve miR-1228- miR-30 3p), endojen kontrol olarak.

  1. Ters transkripsiyon ana karışımı (RT mix) hazırlayın. de tarif edildiği gibi, her bir reaksiyon için, RT karışımı 7 ul hazırlanmasıhttps://www.jove.com/files/ftp_upload/53900/Table1.xlsx">Table 1 (indirmek için tıklayınız) (DİKKAT: kimyasal tehlike).
    Not: Bu deneyde, 9 farklı RT karışımı, her bir numune için hazırlanmıştır.
  2. İyice karıştırın ve buz üzerinde RT karışımı saklayın. Reaksiyon tüp başına RT karışımı 7 ul ekleyin.
  3. Reaksiyon tüp başına numune RNA (toplam RNA 10 ug) 5 ul ekleyin ve hafifçe karıştırın.
  4. İlgili reaksiyon tüpüne set her testte: (kimyasal tehlike DİKKAT) 5x ters transkripsiyon primerlerin 3 ul ekleyin.
  5. Yavaş karıştırın tüpü kapatmak ve 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
  6. termal döngü halinde, reaksiyon tüpü yük ve 30 dakika boyunca 16 ° C 'de, aşağıdaki parametre değerleri (TUT ters transkripsiyon reaksiyonu başlatmak, 30 dakika boyunca 42 ° C'de tutuldu; 5 dakika için 85 ° C de sabit; TUT ∞ 4 ° C).

Exosomal miRNA'lar 6. Real Time PCR Analizi

Not: Bu analiz olduNumune başına üç biyolojik ve teknik çoğaltır ile Real Time PCR (qPCR) için bir ticari kit kullanılarak yapıldı.

  1. Her reaksiyon için, Real Time PCR karışımı 17.67 ul (PCR Master Mix + Nükleazlar içermeyen su 7.67 ul 10 ul) hazırlamak, karıştırın ve buz koymak. (DİKKAT: kimyasal tehlike)
  2. (: Kimyasal tehlike DİKKAT) 20x qPCR primerlerin, her PCR tüpü için, 1 ul ekleyin.
  3. Her iyi plakada qPCR karışımı 18.67 ul yerleştirin.
  4. muhabir iyi plaka içine ters transkripsiyon ürünü 1.33 ul ekleyin.
  5. plaka kapatın ve (300 gx 5 sn) dönerler.
  6. Gerçek Zamanlı PCR sisteminin plaka yerleştirin ve Aşağıdaki PCR koşulları kullanılarak Çalışan: 10 dakika boyunca 95 ° C 'de sabit; 95 ° C'de 15 saniye ve 60 ° C'de 60 saniye 40 döngü. ΔΔct 13 - işlem, formül 2'ye göre veri normalleştirmek ve.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

KHDAK hastalarının 12 plazma ve 6 sağlıklı kontrol olmak üzere toplam plazmadan exosome izolasyonu için ticari kit ile işlendi. Her bir numune, exosomal belirteçleri alix (96 kDa) ve TSG101 (43 kDa) değerlendirmek için Western Blot analizi ile işlenmiştir. Bu sonuçların bir örneği, plazma örneklerinden eksozom izolasyonu bu protokol ile mümkün olduğunu gösteren, Şekil 1 'de 3 örnek için gösterilmiştir.

biy...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu kombine protokolü sayesinde KHDAK hastalarının plazmadan bir exosomal miRNA analizi gerçekleştirmek mümkün olmuştur. Bu veriler, bir hastalık durumu göstermektedir, ancak bu daha fazla çalışma ile teyit edilmesi gerekmektedir.

Bu yazıda kullanılan protokol, eksozom izolasyonu için ticari bir kit dayanıyordu. Sebebi bilinen diğer izolasyon prosedürleri (örneğin., Yoğunluk gradyan Ultrasantrifügasyon) sınırlı bir standardizasyona lider, daha fazla manuel prosedürleri gerektiren old...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Tüm yazarlar rekabet eden hiçbir finansal çıkar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma aynı zamanda MOCA (Multidisciplinair Oncologisch Centrum Antwerpen) hibesi 2014 tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Total eksozom izolasyon kiti (plazmadan)  İnvitrojen4484450Kullanımı Proteinaz K tedavisi
Ribonükleaz ASigma-AldrichR4875-100MG
ALIX Antikoru (3A9)Hücre Sinyalizasyonu2171S
TSG-101 Antikoru (C-2)SantaCruz BiyoteknolojiSC-7964 ve nbsp;
Anti-Mouse HRP 1 ml   Hücre Sinyalizasyonu7076P2
RNAspin Illustra mini kit 50GE HealthCare25-0500-71
Taqman MicroRNA Ters Transkripsiyon KitiLife Technologies4366596
has-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA testiYaşam Teknolojileri002919
has-miR-30b TaqMan MicroRNA testiYaşam Teknolojileri000602
has-miR-30c TaqMan MikroRNA testiYaşam Teknolojileri000419
has-miR-122 TaqMan MikroRNA testiYaşam Teknolojileri002245
has-miR-195 TaqMan MikroRNA testiYaşam Teknolojileri000494
has-miR-203 TaqMan MicroRNA testiYaşam Teknolojileri000507
has-miR-103 TaqMan MicroRNA testiYaşam Teknolojileri
has-miR-221 TaqMan MicroRNA testiYaşam Teknolojileri000524
has-miR-222 TaqMan MicroRNA testiYaşam Teknolojileri002276
TaqMan Universal Master Mix II, UNGLife Technologies4440043
000439 yok

Kaynaklar

  1. Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics. Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).
  2. Rolfo, C., et al. Novel therapeutic strategies for patients with NSCLC that do not respond to treatment with EGFR inhibitors. Cancer Treat Rev. 40, 990-1004 (2014).
  3. Rolfo, C., et al. Liquid biopsies in lung cancer: the new ambrosia of researchers. Biochim Biophys Acta. 1846, 539-546 (2014).
  4. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol. 2, 569-579 (2002).
  5. Fontana, S., Saieva, L., Taverna, S., Alessandro, R. Contribution of proteomics to understanding the role of tumor-derived exosomes in cancer progression: state of the art and new perspectives. Proteomics. 13 (10-11), 1581-1594 (2013).
  6. Taverna, S., et al. Exosomal shuttling of miR-126 in endothelial cells modulates adhesive and migratory abilities of chronic myelogenous leukemia cells. Mol Cancer. 11, (2014).
  7. Taverna, S., et al. Curcumin inhibits in vitro and in vivo chronic myelogenous leukemia cells growth: a possible role for exosomal disposal of miR-21. Oncotarget. , (2015).
  8. Garofalo, M., et al. MicroRNA signatures of TRAIL resistance in human non-small cell lung cancer. Oncogene. 27, 3845-3855 (2008).
  9. Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
  10. Hu, J., et al. Human miR-1228 as a stable endogenous control for the quantification of circulating microRNAs in cancer patients. Int J Cancer. 135 (5), 1187-1194 (2014).
  11. Alessandro, R., et al. Effects of carboxyamidotriazole on in vitro models of imatinib-resistant chronic myeloid leukemia. J Cell Physiol. 215, 111-121 (2008).
  12. Zhao, Y., et al. Exosomes Derived from Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Relieve Acute Myocardial Ischemic Injury. Stem Cells Int. 2015, (2015).
  13. Yoko, T., et al. Up-regulation of MDR'1and induction of doxorubicin resistance by histone deacetylase inhibitor depsipeptide (FK228) and ATRA in acute promyelocytic leukemia cells. Blood. 107 (4), 1546-1554 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Plazma EksozomlarıqPCR AnaliziEksozom İzolasyonuWestern BlotTEM AnaliziRT-PCRmiRNA Biyobelirteçleri
qPCR sayesinde küçük hücre dışı akciğer kanseri (KHDAK) Hasta Plazma içinde Exosomal miRNA Analizi: Bir Uygulanabilir Sıvı Biyopsi Aracı
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.