Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bir Gelişimi

12.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53974

⸱

10 Haziran 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Laboratory, The University of Tokyo Hospital, 2Department of Respiratory Medicine, The University of Tokyo Hospital

Bu makalede

Özet

Burada, epitelyal-mezenkimal geçiş geçiren mezenkimal hücrelerde kasılma fonksiyonunu değerlendirmek için bir jel kasılma testinin geliştirilmesini ve uygulanmasını açıklıyoruz.

Özet

Fibrozis sıklıkla interstisyel akciğer hastalığı gibi çeşitli kronik ilerleyici hastalıkların patogenezinde rol oynar. Patolojik ayırt edici özellik, hastalık şiddeti ile ilişkili olan fibroblastik odakların oluşumudur. Fibroblastik odaklardan oluşan mezenkimal hücrelerin, başlangıçta yerleşik intrapulmoner fibroblastlar ve kemik iliğinden dolaşımdaki fibrositler dahil olmak üzere çeşitli hücre kaynaklarından türetildiği öne sürülmektedir. Son zamanlarda, epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) geçiren mezenkimal hücrelerin de fibrozis patogenezine katkıda bulunduğu düşünülmektedir. Ek olarak, EMT, büyüme faktörü β dönüştürülerek indüklenebilir ve EMT, tümör nekroz faktörü α gibi pro-inflamatuar sitokinler tarafından arttırılabilir. Jel kasılma testi, fibroblastların karakteristik fonksiyonlarından biri olan ve yara onarımı ve fibrozise katkıda bulunan kontraktilitenin değerlendirilmesi için ideal bir in vitro modeldir. Burada, EMT uygulanan mezenkimal hücrelerin kasılma yeteneğini değerlendirmek için bir jel kasılma testinin geliştirilmesi gösterilmiştir.

Giriş

Fibroz, interstisyel akciğer hastalığı, kardiyak fibroz, karaciğer sirozu, böbrek yetmezliği, terminal, sistemik skleroz, otoimmün hastalık 1 gibi çeşitli kronik progresif hastalıkların patogenezinde rol oynamaktadır. interstisyel akciğer hastalıkları arasında, idiyopatik pulmoner fibrozis (IPF) kronik ilerleyici bir hastalıktır ve kötü prognozu gösterir. IPF patolojik bulgusudur prognoz ile ilişkili olduğu aktive fibroblast ve miyofibroblastlar oluşan fibroblastik odaklar geliştirilmesidir. Bu tür akciğer fibroblast kökenleri aslen ikamet akciğer fibroblastlar dahil olmak üzere ve kemik iliği fibrositlerden dolaşan birkaç mezenkimal hücrelerden, elde edilecek önerilmektedir. Son zamanlarda, epitelyal mezenkimal geçişi (EMT) mezenkimal hücreler 2 oluşumu ile ilişkili olduğu öne sürülmüştür ve fibrotik hastalıkların patogenezine katkıda bulunmak.

Bu düşünülmektedir EMT tümör invazyonu ve metastaz 3 olmak üzere fetal gelişim sürecinde önemli roller, yara iyileşmesi ve kanserin ilerlemesini, oynar. EMT süreci takiben, epitel hücreler, E-kadherin gibi epitelyal belirteçleri kaybıyla mezenkimal hücrelerin yeteneği elde etmek ve örneğin vimentin gibi mezenşimal belirteçleri ve α-düz kas aktini (SMA) 4,5 ekspresyonuyla. Önceki çalışmalar EMT süreç böbrek 6 ve akciğer 7 doku fibrozis gelişimi ile ilişkili olduğunu kanıt gösterdi. Ayrıca, kronik inflamasyon fibrotik hastalığı 8 teşvik; Bundan başka, tümör nekroz faktörü üst aile üyesini 14 (TNFSF14; LIGHT) gibi enflamatuar sitokinler, tümör nekroz faktörü (TNF) -a ve interlökin-1, EMT 9-12 geliştirmek için gösterilmiştir.

Kollajen jel daralma tahlili, fibroblastlar tip I gömülü olduğu bir kollajen bazlı hücre kasılması deneyikolajen jeli üç boyutlu, kontraktilite değerlendirilmesi için in vitro model bir idealdir. Kontraktilite fibroblast karakteristik işlevlerinden biridir ve normal yara onarımı ve fibrozis 13 katkıda bulunur. Bu deneyde, fibroblast ek bazı koşullar altında, mekanik gerilim üretilmesi için gereken I integrin bağlantılı mekanizmalar vasıtasıyla kolajen tip, ve bunun sonucu olarak doku daralmaya yol düşünülmektedir.

Burada, jel daralma deneyinin geliştirilmesi EMT yapılan hücrelerde kontraktil fonksiyonun satın değerlendirmek üzere uyarlanmış olduğu bildirilmektedir. Bu raporda, bu modifiye edilmiş deney EMT uygulanan mezenkimal hücreler kontraktiliteııin değerlendirilmesi için uygun olduğunu göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Hazırlıklar ve Kültür Akciğer Epitel Hücreleri

  1. Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) içinde kültür A549 insan akciğer epitel hücreleri (yapışık hücre çizgisi), 100 ug / ml streptomisin ve% 10 fetal sığır serumu (FBS), 100 lU / ml penisilin, ve.
  2. Çıkarın ve Kültür bir tabaktan alınan hücre kültürü ortamı atmak ve 5 ile bir kez yıkayın - fosfat tamponlu tuzlu su, 10 ml (PBS). Yıkandıktan sonra, hemen PBS aspire.
  3. 3 dakika boyunca CO2 2 ml tripsin / etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (% 0.05) ilave edin ve 37 ° C'de inkübe ve% 5.
  4. Hücre kültürü ortamı, santrifüj 150 x g'de 4 dakika boyunca oda sıcaklığında tüpler ihtiva eden santrifüj tüplerine müstakil hücreleri toplamak.
  5. hücreler, hücre kültür ortamının 2 ml pelet ve hücre sayımı için bir örnek çıkarın. hücre canlılığı kontrol etmek için Tripan mavi leke hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısını.
  6. Tohum A549 hücreleri0.5 bir yoğunlukta en az 10 cm polistiren plakaları - jel daralma deneyi için ortam, 10 ml 1.0 x 10 6 hücre / çanak. 0.5 yoğunluğunda 6 oyuklu polistiren plâkalar üzerine hücreleri Tohum - 1.0 x 10 5 hücre / göz ile EMT onay orta 2 mi. 24 saat boyunca CO2 37 ° C'de inkübe hücreleri ve% 5.

2. EMT Prosedürü

  1. Aşama 1.6 tohumlandı jel daralma deneyi için plakaya TGF-ß1 (5 ug / ml) 10 ul ve TNF-a, 10 ul (10 ug / ml) eklenir. Aşama 1.6 tohumlandı EMT onay plakasına TGF-ß1 (5 ug / ml) 2 ul ve TNF-a 2 ul (10 ug / ml) eklenir. 48 saat boyunca CO2 37 ° C'de inkübe edilir ve% 5.

PCR ve Western Blot ile EMT Usul 3. Onay

  1. Faz kontrast mikroskopi kullanılarak tedavi hücrelerin (şekil mili için çakıl taşı gibi itibaren) morfoloji değişikliği onaylayın.
    Not: Normark A549 hücreleri, epitel hücreleri bir özelliğidir çakıl taşı gibi ve üçgen şekilli bir görünüşe sahip, ancak, TGF-ß1 ve TNF-a ile uyarılmasından sonra hücreler uzun görünür ve mil bu mezenkimal hücreler 14,15 benzer şekilli.
  2. Bu E-kadherin gibi bir epitel işaretleyici ekspresyonunu değerlendirmek ve PCR ve Batı lekeleme ile örneğin N-kaderin, vimentin ve α-düz kas aktin gibi mezenşimal belirteçleri.
    1. RNA özütleme kiti 16 ile hücrelerden toplam RNA ekstrakte edin ve üreticinin protokolüne uygun olarak, ters transkriptaz 17 kullanarak cDNA sentezlemek.
    2. Gerçek zamanlı PCR sistemi 18 ve üreticilerin talimatlarına göre monomerik siyanin boyası PCR kiti kullanılarak mRNA seviyelerinin ifadesini ölçün. GAPDH için spesifik primerler (gliseraldehid 3-fosfat dehidrojenaz), ACTA2 (alfa-aktin-2), CDH1 (kaderin-1; E-kadherin) ve VIM (vimentin), Tablo 1 'de gösterilmiştir Rong.
    3. Lyse bir parçalama tamponu (Tablo 2)% 1 proteaz önleyici kokteyl içeren çözelti ile hücreleri. Bir protein tahlil kiti 19,20 kullanarak tüm numune protein konsantrasyonlarını ölçmek ve bir poliakrilamid jel protein aynı miktarda uygulanır.
      1. SDS jel-elektroforez ve PVDF membranı 21 proteinlerin yarı-kuru transferi gerçekleştirin. 2 saat 1 - blokaj tamponunda primer antikorlar ile membran inkübe edin. İnkübasyondan sonra yıkama tamponu ile iki defa zarın yıkanması ve ikinci antikor ile membran 1 saat inkübe edilir.
        Not: Bu çalışmalarda kullanılan antikorlar ve seyreltileri malzemeleri / donatım tabloya bakınız. Bloke edici tampon bileşenleri için Tablo 2'ye bakınız.
      2. iki kez yıkama tamponu ile membran yıkayın. Soğuk CCD kamera 11,23 kullanarak Western lekeleme tespit kiti 22 ile membran fotoğraf çekmek.

4. Değerlendirilmesi EMT için Jel Daralma Deneyi

  1. Hücre kültürü kabından koşullu ortam aspire ve 5 ile iyice yıkayın - ölü hücreleri çıkarmak için 10 ml PBS. Yıkandıktan sonra, hemen PBS aspire.
  2. 3 dakika boyunca CO2,% 0.05 tripsin / EDTA 2 ml ilave edilir ve 37 ° C'de inkübe ve% 5.
  3. DMEM 150 x g'de 4 dakika boyunca oda sıcaklığında tripsin inhibitörü (1 mg / ml), santrifüj tüpleri ile takviye içeren santrifüj tüplerine müstakil hücreleri toplamak.
  4. damıtılmış su olan tip 1 kollajen jel karıştırın ve DMEM konsantre edildi 4 x 1.75 mg / ml'lik bir konsantrasyon elde etmek için kolajen seviyesini ayarlamak için ve 1 x DMEM konsantrasyonu. Bu adımı sırasında buz üzerinde jel ortamı tutmak için emin olun.
    Not: Jel ortamı 6 mi yapmak için, iyi 3.5 mi tip 1 kollajen jel (3 mg / ml) 1.5 ila 4 x konsantre edildi mL DMEM ve 1 ml damıtılmış su karıştırılır.
  5. 500 ul PBS hücre pelletini ve hücre sayımı için bir örnek çıkarın. OrtakTripan mavi boyası ile bir hemositometre kullanılarak hücre sayısı, hücre canlılığı ile kontrol edin.
  6. Yavaşça, bir hücre 3.0 x 10 5 hücre yoğunluğu / oyuk (6.0 x 10 5 hücre / ml) ve elde ancak hızla jelleşme olmadan pipetleme ile karıştırarak seviyesini ayarlamak için jel orta ekleyin.
  7. düzgün silindir biçiminde yapmak için hızlı ve dikkatli bir şekilde 24 oyuklu işlenmemiş plakanın her oyuğuna 0.5 ml koyun. Herhangi bir hava kabarcıkları jeller (Şekil 1A) kirletmesine izin vermemek için dikkatli olun.
    hücreleri içeren jel orta viskoz ve kolayca kuyuda jel ve form hilal şekli olabilir: Not.
  8. 37 ° C'de bir hücre kuluçka makinesi içinde, 15 dakika boyunca inkübasyona bırakılır,% 5 CO2 ve% 95 nem, tamamen jel.
  9. Bir yönde bir çevresi çekmek için bir şekilde sterilize edilmiş bir spatula taşıyarak bozmadan plaka jeller ayırın. Bir spatula kullanarak, yavaşça 60 mm doku kültürü yemekleri jeller aktarmakya da TGF-ß1 (5 ng / ml) ve TNF-a (10 ng / ml) olmadan DMEM /% 1 FBS, 5 ml ihtiva etmektedir.
  10. Yavaşça jeller ortamda yüzen sağlamak için yemekler sallayın. 37 ° C'de,% 5 CO2 ve% 95 nemde bir hücre kuluçka makinesi içinde inkübe edin.

Jel Boyutu 5. Ölçüm

  1. bir görüntü analiz sistemi kullanılarak, 0, 24, 48, ve 72 saat sonra kolajen jel boyutu ölçülür.
    1. Jel dokümantasyon sistemi (Şekil 2A) açın ve ışık geçirmeyen bir kabinin içine yemekler koymak. Sonra kabine yemeklerin kapağını çıkarmak.
    2. İlgili jel analiz yazılımı açın. kabine jellerin görüntü göstermek için menü çubuğunda "görüntü elde etme lütfen" tıklayın. Sonra, jeller (Şekil 2B) fotoğraf çekmek için menü çubuğunda "acquire" tıklayın.
    3. Ölçüm bölgesini menü çubuğunda (Şekil 2C) "algılama düğmesini" tıklayın ve ayarlamak (sarı daire ifareyi sürükleyerek n Şekil 2C). Ardından, menü çubuğunda "otomatik algılama düğmesi" (Şekil 2B düğmesini bakınız). Yazılım otomatik olarak bir ısı haritası (Şekil 2B) gösteren jeller algılar.
    4. Görüntü işleme ile jellerin taslağını çıkarmak ve anahat (Şekil 2E) ile çevrili alanlar hesaplamak için "Tamam" a tıklayın. Alan hesaplandıktan sonra, hesaplanan alan ayrı bir pop-up penceresi görüntülenir.
      Not: jeller görüntüleme sırasında birbirleriyle örtüşen, hafifçe steril bir pipet kullanarak jeller taşıyın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

EMT sırasında, epitel hücreleri E-kaderin gibi epitel belirteçleri, kaybetmek ve bu vimentin ve α-düz kas 4,5 aktin olarak mezenkimal belirteçler, ifadesini kazanır. TGF-ß1 ve TNF-a ile A549 insan akciğer epitel hücrelerine inkübasyonu EMT indükler. Normal A549 hücrelerinin görünümü epitel hücreleri (Şekil 3A) bir özelliğidir şekil ve üçgen şekli gibi çakıl taşı, ancak, TGF-ß1 ve TNF-a ile uyarılmış sonra görünümü mezenşimal benzer uzun bir mil bir biçime hücr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada geliştirilen protokol iki adımları içerir. İlk adım, ikinci bir basamaklı bir jel tahlili daralma ise, EMT indüklemek için gerçekleştirilir. hücrelerin EMT uygulanan onaylamak için önemli olduğundan, adım 2 morfolojik ve gen ekspresyon değişiklikleri için mükemmel bir tamamlayıcı sağlar. Daha önceki çalışmalar, A549 hücrelerinin EMT, TGF-ß1 sadece 24 tarafından indüklendiğini göstermiştir; Daha önce 10 rapor ettiği gibi, ancak, TNF-α tedavisi EMT ve mezenkimal hücre belirteçleri kazanı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa etmek herhangi bir çıkar çatışmaları var.

Teşekkürler

Teknik yardım için Dr. Tadashi Koyama'ya teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen JSPS KAKENHI Hibe Numaraları 23249045, 15K09211, 15K19172; Japonya Sağlık, Çalışma ve Refah Bakanlığı'ndan Solunum Yetmezliği Araştırma Grubu'na hibe; alerjik hastalık ve immünoloji araştırmaları için bir hibe, Japonya.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DMEMsigma aldrich11965-092A549 ortamı için
FBSGIBCO10437
Dönüştürücü Büyüme Faktörü-β 1, İnsan, rekombinantWako Laboratuvar kimyasalları209-16544
Rekombinant İnsan TNF -&alfa;Ar-Ge D sistemleri210-TA / CF
E-Cadherin (24E10) Tavşan mAbHücre Sinyalizasyon Teknolojisi# 31951: 3.000 seyreltme
Vimentin (D21H3) Tavşan mAbHücre Sinyal Teknolojisi# 57411: 3.000 seyreltme
Anti-&alfa; -Tubulin antikorusigma aldrichT90261: 10.000 seyreltme
Monoklonal Anti-Aktin, &alfa;-Düz Kas antikoru & nbsp;sigma aldrichA52281:10.000 seyreltme
Anti-N-kaderin antikoruBD İletim Laboratuvarları# 6109201: 1.000 seyreltme
Anti-Fare IgG, HRP'ye Bağlı Bütün Ab Koyunu (ikincil antikor)GE HealthcareNA931-100UL1: 20.000 seyreltme
Anti-Tavşan IgG, HRP'ye Bağlı Bütün Ab Eşek (ikincil antikor)GE HealthcareNA934-100UL1: 20.000 seyreltme
Engelleme reaktifiGE HealthcareRPN418TBS-T'de %2
6 Kuyu Temizle Düz Tabanlı TC ile Muamele Edilmiş Çok Kuyulu Hücre Kültürü Plakası, Kapaklıcorning# 353046
100 mm Hücre kültürü kabıTPP# 93100
DMEM, tozyaşam teknolojileri12100-0464 kez; DMEM
Tip 1 kollajen jelNitta jelatinCellmatrix tip IA
24 Kuyu hücre kültürü plakasıAGC TECHNO GLASS1820-024
Jel Dokümantasyon Sistemi ATTOAE-6911FXNJel görüntüleyici
Jel analiz yazılımıATTODensitograph, ver.AE-6911FXN
Tripsin-EDTA (%0,05), fenol kırmızıyaşam teknolojileriile
24 Kuyulu Plaka, İşlem GörmemişIWAKI1820-024
Tripan Mavisi Çözeltisi, %0,4Yaşam Teknolojileri15250-061
RNA ekstraksiyon kitiQiagen74106
Ters transkriptazyaşam teknolojileri18080044
Gerçek zamanlı PCR sistemiStratageneMx-3000P
SYBR yeşil PCR kitiQiagen204145
Proteaz İnhibitörü Kokteyli (100x)yaşam teknolojileri78429
PVDF membranıATTO2392390
Protein tahlil kitibio-rad5000006JA 
Poliakrilamid jelATTO2331810
Batı lekeleme tespit reaktifiGE HealthcareRPN2232
Soğuk CCD kameraATTOEz-Capture MG / ST
Tripsin inhibitörüsigma aldrichT9003-100MG
Polioksietilen (20) Sorbitan MonolauratWako Laboratuvar kimyasalları163-11512
Polioksietilen (9) oktifenil eterWako Laboratuvar kimyasalları141-08321
birlikte verilen analiz yazılımı 25300054

Kaynaklar

  1. Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology. 214, 199-214 (2008).
  2. Hardie, W. D., Glasser, S. W., Hagood, J. S. Emerging concepts in the pathogenesis of lung fibrosis. The American journal of pathology. 175, 3-16 (2009).
  3. Kovacic, J. C., Mercader, N., Torres, M., Boehm, M., Fuster, V. Epithelial-to-mesenchymal and endothelial-to-mesenchymal transition: from cardiovascular development to disease. Circulation. 125, 1795-1808 (2012).
  4. Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-890 (2009).
  5. Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. The Journal of clinical investigation. 119, 1420-1428 (2009).
  6. Forino, M., et al. TGFbeta1 induces epithelial-mesenchymal transition, but not myofibroblast transdifferentiation of human kidney tubular epithelial cells in primary culture. International journal of experimental pathology. 87, 197-208 (2006).
  7. Yang, S., et al. Participation of miR-200 in pulmonary fibrosis. The American journal of pathology. 180, 484-493 (2012).
  8. Reynolds, H. Y. Lung inflammation and fibrosis: an alveolar macrophage-centered perspective from the 1970s to 1980s. American journal of respiratory and critical care medicine. 171, 98-102 (2005).
  9. Camara, J., Jarai, G. Epithelial-mesenchymal transition in primary human bronchial epithelial cells is Smad-dependent and enhanced by fibronectin and TNF-alpha. Fibrogenesis & tissue repair. 3, 2(2010).
  10. Kamitani, S., et al. Simultaneous stimulation with TGF-beta1 and TNF-alpha induces epithelial mesenchymal transition in bronchial epithelial cells. International archives of allergy and immunology. 155, 119-128 (2011).
  11. Mikami, Y., et al. Lymphotoxin beta receptor signaling induces IL-8 production in human bronchial epithelial cells. PloS one. 9, e114791(2014).
  12. Yamauchi, Y., et al. Tumor necrosis factor-alpha enhances both epithelial-mesenchymal transition and cell contraction induced in A549 human alveolar epithelial cells by transforming growth factor-beta1. Experimental lung research. 36, 12-24 (2010).
  13. Grinnell, F. Fibroblasts, myofibroblasts, and wound contraction. The Journal of cell biology. 124, 401-404 (1994).
  14. Ramos, C., et al. FGF-1 reverts epithelial-mesenchymal transition induced by TGF-{beta}1 through MAPK/ERK kinase pathway . American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 299, L222-L231 (2010).
  15. Ren, Z. X., Yu, H. B., Li, J. S., Shen, J. L., Du, W. S. Suitable parameter choice on quantitative morphology of A549 cell in epithelial-mesenchymal transition. Bioscience reports. 35, (2015).
  16. Brinkmann, V., Kinzel, B., Kristofic, C. TCR-independent activation of human CD4+ 45RO- T cells by anti-CD28 plus IL-2: Induction of clonal expansion and priming for a Th2 phenotype. Journal of immunology. 156, 4100-4106 (1996).
  17. Krug, M. S., Berger, S. L. First-strand cDNA synthesis primed with oligo(dT). Methods in enzymology. 152, 316-325 (1987).
  18. Morozumi, M., et al. Simultaneous detection of pathogens in clinical samples from patients with community-acquired pneumonia by real-time PCR with pathogen-specific molecular beacon probes. Journal of clinical microbiology. 44, 1440-1446 (2006).
  19. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  20. Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation. Analytical biochemistry. 175, 231-237 (1988).
  21. Ursitti, J. A., Mozdzanowski, J., Speicher, D. W., et al. Electroblotting from polyacrylamide gels. Current protocols in protein science. Chapter 10, Unit 10.7(2001).
  22. Kricka, L. J., Voyta, J. C., Bronstein, I. Chemiluminescent methods for detecting and quantitating enzyme activity. Methods in enzymology. 305, 370-390 (2000).
  23. Noguchi, S., et al. An integrative analysis of the tumorigenic role of TAZ in human non-small cell lung cancer. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 20, 4660-4672 (2014).
  24. Kasai, H., Allen, J. T., Mason, R. M., Kamimura, T., Zhang, Z. TGF-beta1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition (EMT). Respiratory research. 6, 56(2005).
  25. Chen, X., et al. Integrin-mediated type II TGF-beta receptor tyrosine dephosphorylation controls SMAD-dependent profibrotic signaling. The Journal of clinical investigation. 124, 3295-3310 (2014).
  26. Saito, A., et al. An integrated expression profiling reveals target genes of TGF-beta and TNF-alpha possibly mediated by microRNAs in lung cancer cells. PloS one. 8, e56587(2013).
  27. Dvashi, Z., et al. Protein phosphatase magnesium dependent 1A governs the wound healing-inflammation-angiogenesis cross talk on injury. The American journal of pathology. 184, 2936-2950 (2014).
  28. Hallgren, O., et al. Enhanced ROCK1 dependent contractility in fibroblast from chronic obstructive pulmonary disease patients. Journal of translational medicine. 10, 171(2012).
  29. Kobayashi, T., et al. Matrix metalloproteinase-9 activates TGF-beta and stimulates fibroblast contraction of collagen gels. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 306, L1006-L1015 (2014).
  30. Horie, M., et al. Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor. Experimental lung research. 40, 222-236 (2014).
  31. Kohyama, T., et al. PGD(2) modulates fibroblast-mediated native collagen gel contraction. American journal of respiratory cell and molecular biology. 27, 375-381 (2002).
  32. Muir, A. B., et al. Esophageal epithelial cells acquire functional characteristics of activated myofibroblasts after undergoing an epithelial to mesenchymal transition. Experimental cell research. 330, 102-110 (2015).
  33. Zhong, Q., et al. Role of endoplasmic reticulum stress in epithelial-mesenchymal transition of alveolar epithelial cells: effects of misfolded surfactant protein. American journal of respiratory cell and molecular biology. 45, 498-509 (2011).
  34. Liu, X. Inflammatory cytokines augments TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in A549 cells by up-regulating TbetaR-I. Cell motility and the cytoskeleton. 65, 935-944 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Jel Kontraksiyon AnaliziTGF Beta 1TNF AlfaA549 H creleriH cre KontraktilitesiWestern Blot Analizimm nofloresan BoyamaH cre K lt r nk bat r
Bir Gelişimi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.