Bir Gelişimi İn Vitro Deney Mezenkimal Hücreleri Uyguladığımız Epitel-Mezenkimal Geçiş kasılma Fonksiyonu değerlendirin

Summary

Burada, epitelyal-mezenkimal geçiş geçiren mezenkimal hücrelerde kasılma fonksiyonunu değerlendirmek için bir jel kasılma testinin geliştirilmesini ve uygulanmasını açıklıyoruz.

Abstract

Fibrozis sıklıkla interstisyel akciğer hastalığı gibi çeşitli kronik ilerleyici hastalıkların patogenezinde rol oynar. Patolojik ayırt edici özellik, hastalık şiddeti ile ilişkili olan fibroblastik odakların oluşumudur. Fibroblastik odaklardan oluşan mezenkimal hücrelerin, başlangıçta yerleşik intrapulmoner fibroblastlar ve kemik iliğinden dolaşımdaki fibrositler dahil olmak üzere çeşitli hücre kaynaklarından türetildiği öne sürülmektedir. Son zamanlarda, epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) geçiren mezenkimal hücrelerin de fibrozis patogenezine katkıda bulunduğu düşünülmektedir. Ek olarak, EMT, büyüme faktörü β dönüştürülerek indüklenebilir ve EMT, tümör nekroz faktörü α gibi pro-inflamatuar sitokinler tarafından arttırılabilir. Jel kasılma testi, fibroblastların karakteristik fonksiyonlarından biri olan ve yara onarımı ve fibrozise katkıda bulunan kontraktilitenin değerlendirilmesi için ideal bir in vitro modeldir. Burada, EMT uygulanan mezenkimal hücrelerin kasılma yeteneğini değerlendirmek için bir jel kasılma testinin geliştirilmesi gösterilmiştir.

Introduction

Fibroz, interstisyel akciğer hastalığı, kardiyak fibroz, karaciğer sirozu, böbrek yetmezliği, terminal, sistemik skleroz, otoimmün hastalık ¹ gibi çeşitli kronik progresif hastalıkların patogenezinde rol oynamaktadır. interstisyel akciğer hastalıkları arasında, idiyopatik pulmoner fibrozis (IPF) kronik ilerleyici bir hastalıktır ve kötü prognozu gösterir. IPF patolojik bulgusudur prognoz ile ilişkili olduğu aktive fibroblast ve miyofibroblastlar oluşan fibroblastik odaklar geliştirilmesidir. Bu tür akciğer fibroblast kökenleri aslen ikamet akciğer fibroblastlar dahil olmak üzere ve kemik iliği fibrositlerden dolaşan birkaç mezenkimal hücrelerden, elde edil....

Protocol

1. Hazırlıklar ve Kültür Akciğer Epitel Hücreleri

1. Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) içinde kültür A549 insan akciğer epitel hücreleri (yapışık hücre çizgisi), 100 ug / ml streptomisin ve% 10 fetal sığır serumu (FBS), 100 lU / ml penisilin, ve.
2. Çıkarın ve Kültür bir tabaktan alınan hücre kültürü ortamı atmak ve 5 ile bir kez yıkayın - fosfat tamponlu tuzlu su, 10 ml (PBS). Yıkandıktan sonra, hemen PBS aspire.
3. 3 dakika boyunca _CO2 2 ml tripsin / etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (% 0.05) ilave edin ve 37 ° C'de inkübe ve% 5.
4. Hücre kültürü ortamı, santrifüj 150 x g'de 4 dakika boyunca oda sıcaklığ....

Results

EMT sırasında, epitel hücreleri E-kaderin gibi epitel belirteçleri, kaybetmek ve bu vimentin ve α-düz kas ^4,5 aktin olarak mezenkimal belirteçler, ifadesini kazanır. TGF-ß1 ve TNF-a ile A549 insan akciğer epitel hücrelerine inkübasyonu EMT indükler. Normal A549 hücrelerinin görünümü epitel hücreleri (Şekil 3A) bir özelliğidir şekil ve üçgen şekli gibi çakıl taşı, ancak, TGF-ß1 ve TNF-a ile uyarılmış sonra görünümü mezenşimal benzer uzun bir mil bir biçime hücr.......

Discussion

Bu çalışmada geliştirilen protokol iki adımları içerir. İlk adım, ikinci bir basamaklı bir jel tahlili daralma ise, EMT indüklemek için gerçekleştirilir. hücrelerin EMT uygulanan onaylamak için önemli olduğundan, adım 2 morfolojik ve gen ekspresyon değişiklikleri için mükemmel bir tamamlayıcı sağlar. Daha önceki çalışmalar, A549 hücrelerinin EMT, TGF-ß1 sadece ²⁴ tarafından indüklendiğini göstermiştir; Daha önce ¹⁰ rapor ettiği gibi, ancak, TNF-α tedavisi EMT ve mezenkimal hücre belirteçleri kazanı.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	sigma aldrich	11965-092	A549 ortamı için
FBS	GIBCO	10437
Dönüştürücü Büyüme Faktörü-β 1, İnsan, rekombinant	Wako Laboratuvar kimyasalları	209-16544
Rekombinant İnsan TNF -&alfa;	Ar-Ge D sistemleri	210-TA / CF
E-Cadherin (24E10) Tavşan mAb	Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi	# 3195	1: 3.000 seyreltme
Vimentin (D21H3) Tavşan mAb	Hücre Sinyal Teknolojisi	# 5741	1: 3.000 seyreltme
Anti-&alfa; -Tubulin antikoru	sigma aldrich	T9026	1: 10.000 seyreltme
Monoklonal Anti-Aktin, &alfa;-Düz Kas antikoru & nbsp;	sigma aldrich	A5228	1:10.000 seyreltme
Anti-N-kaderin antikoru	BD İletim Laboratuvarları	# 610920	1: 1.000 seyreltme
Anti-Fare IgG, HRP'ye Bağlı Bütün Ab Koyunu (ikincil antikor)	GE Healthcare	NA931-100UL	1: 20.000 seyreltme
Anti-Tavşan IgG, HRP'ye Bağlı Bütün Ab Eşek (ikincil antikor)	GE Healthcare	NA934-100UL	1: 20.000 seyreltme
Engelleme reaktifi	GE Healthcare	RPN418	TBS-T'de %2
6 Kuyu Temizle Düz Tabanlı TC ile Muamele Edilmiş Çok Kuyulu Hücre Kültürü Plakası, Kapaklı	corning	# 353046
100 mm Hücre kültürü kabı	TPP	# 93100
DMEM, toz	yaşam teknolojileri	12100-046	4 kez; DMEM
Tip 1 kollajen jel	Nitta jelatin	Cellmatrix tip IA
24 Kuyu hücre kültürü plakası	AGC TECHNO GLASS	1820-024
Jel Dokümantasyon Sistemi	ATTO	AE-6911FXN	Jel görüntüleyici
Jel analiz yazılımı	ATTO	Densitograph, ver.	AE-6911FXN
Tripsin-EDTA (%0,05), fenol kırmızı	yaşam teknolojileri	ile
24 Kuyulu Plaka, İşlem Görmemiş	IWAKI	1820-024
Tripan Mavisi Çözeltisi, %0,4Yaşam Teknolojileri		15250-061
RNA ekstraksiyon kiti	Qiagen	74106
Ters transkriptaz	yaşam teknolojileri	18080044
Gerçek zamanlı PCR sistemi	Stratagene	Mx-3000P
SYBR yeşil PCR kiti	Qiagen	204145
Proteaz İnhibitörü Kokteyli (100x)	yaşam teknolojileri	78429
PVDF membranı	ATTO	2392390
Protein tahlil kiti	bio-rad	5000006JA
Poliakrilamid jel	ATTO	2331810
Batı lekeleme tespit reaktifi	GE Healthcare	RPN2232
Soğuk CCD kamera	ATTO	Ez-Capture MG / ST
Tripsin inhibitörü	sigma aldrich	T9003-100MG
Polioksietilen (20) Sorbitan Monolaurat	Wako Laboratuvar kimyasalları	163-11512
Polioksietilen (9) oktifenil eter	Wako Laboratuvar kimyasalları	141-08321