Yöntem makalesi

Protein Bozulması ve Siklohekzimid Chase Analizi

29.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/53975

⸱

18 Nisan 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Ball State University, 2Bioproduct Research & Development, Eli Lilly and Company

Bu makalede

Özet

Protein bolluğu hem protein sentezi hem de protein yıkım oranlarını yansıtır. Bu makale, tek hücreli ökaryot, Saccharomyces cerevisiae (tomurcuklanan maya) modelinde protein bozulmasını analiz etmek için sikloheksimid kovalamacasının ve ardından western blotlamanın kullanımını açıklamaktadır.

Özet

Protein bolluğu Yönetmelik hemen hemen her hücresel süreç için çok önemlidir. Protein bolluk protein sentezi ve protein yıkımı oranları entegrasyonunu yansıtmaktadır. Protein bolluk raporlama birçok tahliller, protein düzeyleri çeviri ve proteoliz göreli etkilerinin ayrımcılığa izin vermez (örneğin, tek zamanlı noktası batı lekeleme, sitometri floresan mikroskobu veya büyüme-temelli muhabir deneyleri akış). Bu makalede, özellikle model, tek hücreli ökaryot protein parçalanmasını analiz etmek batı blot takip sikloheksimid kovalamacanın kullanımını, Saccharomyces cerevisiae (tomurcuklanan maya) açıklar. Bu prosedürde, maya hücreleri translasyonel önleyicisi sikloheksimid mevcudiyetinde inkübe edilir. Hücrelerin alikotlan sonra siklohekzimid eklenerek, aşağıdaki özel zaman noktalarında hemen toplanır. Hücreler lizlenir ve lisatlar fo poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrılırHer bir zaman noktasında, protein bolluğu Western blot analizini r. sikloheksimid Chase prosedürü hücresel proteinlerin çeşitli sabit durum nüfusun degradasyon kinetiğinin görselleştirme izin verir. Prosedür protein yıkımı üzerinde genetik gereksinimleri ve çevresel etkileri araştırmak için kullanılabilir.

Giriş

Proteinler hemen her hücresel süreçte önemli işlevleri yerine getirir. Pek çok fizyolojik işlem zaman ya da belirli koşullar altında, belirli bir süre için belirli bir protein (ya da proteinlerin) varlığını gerektirir. Organizmalar nedenle izlemek ve hücresel ihtiyaçlarını karşılamak 1 protein bolluğu düzenler. Örneğin, siklinler (hücre bölünmesini kontrol eden proteinler), hücre döngüsünün belirli aşamalarında mevcut olduğu ve düzenlenmiş siklin seviyelerinin kaybı habis tümör oluşumu 2 ile ilişkili olmuştur. Hücresel ihtiyaçlarını karşılamak için, protein düzeylerinin düzenlemenin yanı sıra hücreler, yanlış katlanmış, birleştirilmemiş ya da başka anormal bir protein moleküllerini 3 ortadan kaldırmak için bozundurucu bir kalite kontrol mekanizmaları kullanır. protein oranından kontrol makromoleküler sentezinin (kopya ve çeviri) ve bozulmaya (RNA çürüğü ve proteoliz) hem düzenlenmesini içerir. Bozulmuş veya aşırı protein yıkımı birden patolojilerin katkıdaKanser, sistik fibroz, nörodejeneratif koşullar, ve kalp-damar bozuklukları 4-8 dahildir. Proteolitik mekanizmaları nedenle hastalıkların 9-12 aralığı için gelecek vaat eden terapötik hedeflerini temsil eder.

Tek bir zaman noktasında proteinlerin analizi sentezi veya bozulma göreli katkılarını vermeden kararlı durum proteini bolluğu anlık görüntüsünü sağlar (örneğin, western blot 13 ​​tarafından, sitometri 14 veya floresan mikroskobu 15 akış). Benzer bir şekilde, büyüme göre raportör testleri sentez ve degradasyon 15-20 etkilerini ayırt olmadan uzun bir süre boyunca sabit durum protein seviyesini göstermektedir. Daha önce bolluk karşılaştırarak ve farmakolojik prote inaktive ederek, örneğin parçalayıcı mekanizmasının (belirli bileşenlerini inhibe sonra kararlı durum protein düzeyleri parçalayıcı süreçlerin katkısını anlaması mümkünasome 21 veya varsayılmış bir gen nakavt bozulması 13) için gerekli olduğu. Parçalayıcı yolları inhibe sonra kararlı durum protein düzeylerinde bir değişiklik protein bolluğu 13 kontrolüne proteoliz katkısı için güçlü kanıtlar sağlar. Ancak, bu tür bir analiz de protein döngüsü kinetiği ilişkin bilgi sağlamaz. Batı blot takip Siklohekzimid kovalamaca araştırmacılar zaman 22-24 üzerinde protein parçalanmasını görselleştirmek için izin vererek bu zayıflıkları üstesinden gelir. Sikloheksimid Chase, aşağıdaki protein saptama, batı lekeleme, radyoaktif izotoplar ve uzun immünopresipitasyon aşamalarla gerçekleştirilir, çünkü daha fazla, aynı zamanda protein degradasyonunu 25 görselleştirmek için gerçekleştirilen çok sayıda yaygın olarak kullanılan darbe takip teknikleri, farklı olarak, sikloheksimid Chase gerekli değildir.

Sikloheksimit birinci anti-mantar, uygun olan bir bileşik olarak tanımlanmıştır26,27 griseus gram-pozitif bakteri Streptomyces tarafından üretilen kravatlar. Özellikle ribozomal translokasyonu 28-31 bozarak ökaryot sitozolik (ama organel değil) çeviri inhibe eden hücre geçirgen bir moleküldür. Bir sikloheksimid Chase deneyde, sikloheksimid hücrelere ilave edilir ve hücre numuneleri, hemen ve bileşik 22 ilave edildikten sonra belirli zaman noktalarında alınır. Hücreler lizlenir ve her zaman noktasında bir protein bolluğu tipik western blot ile analiz edilmiştir. güvenle protein yıkımı atfedilebilir siklohekzimid eklenerek, aşağıdaki proteini bolluğu azaltır. nispeten istikrarlı bir protein bolca az değişiklik gösterecektir sırasında bir kararsız protein, zamanla bolca azalacaktır.

seçici protein yıkımı mekanizmaları son derece ökaryotlarının boyunca muhafaza edilmiştir. protein yıkımı hakkında bilinen çok ne ilk öğrenildiModel tek hücreli ökaryot, Saccharomyces cerevisiae (tomurcuklanan maya) 25,32-36. maya ile yapılan çalışmalar protein yıkımı içine yeni ve önemli bilgiler sunmaya devam etmek olasıdır. protein oranından Western blot analizi ile, ardından maya hücrelerinde sikloheksimid Chase bir yöntem sunulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Maya hücrelerinin 1. Büyüme ve Hasat

  1. Bir endojen maya protein degradasyon kinetiği analiz değilse, ilgili proteini kodlayan bir plazmid ile arzu edilen maya suşu (ler) dönüşümü. Maya transformasyonu için güvenilir yöntemler, daha önce 37 tarif edilmiştir.
  2. Uygun bir ortamda 5 ml maya inoküle (örneğin, dönüştürülmüş hücreler ya da dönüştürülmemiş hücreler için seçici olmayan bir maya ekstresi-pepton dekstroz (YPD) orta plasmid bakımı için Seçici Sentetik tanımlanan (SD) ortamı). döner, 30 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.
    Not: 30 ° C, tipik vahşi tip laboratuar maya kökleri 38 için en uygun bir büyüme sıcaklığıdır. Mutant maya cinsleri, 30 ° C 'de en iyi şekilde büyümez ve bazı proteinler sıcaklığa bağlı bozunmaya maruz Ancak, maya hücresi büyümesi ve sikloheksimid Chase için kullanılan sıcaklıklar deneysel 39 tespit edilmelidir.
  3. th ölçünHer gecede kültür, 600 nm (OD 600) e optik yoğunluk.
    Not: Hücreler logaritmik ya da sabit büyüme fazında olabilir, fakat minimal = OD 600 seyreltme izin 0.2 ml taze ortam 15 bir yoğunluğa ulaştığı olmalıdır.
  4. Taze ortam 0.2 15 ml'lik bir OD 600 değerine gece boyunca kültürler ile seyreltilir.
  5. Hücreler, orta-logaritmik büyüme fazı ulaşana kadar çalkalanarak 30 ° C'de inkübe edin maya (örneğin, OD 0.8 ve 1.2 arasında, 600).
  6. maya hücre büyümesi sırasında, sikloheksimid kovalamaca prosedürü için hazırlık aşağıdakileri gerçekleştirin:
    1. sikloheksimid mevcudiyetinde hücre inkübasyon için 30 ° C, 15 ml konik tüpü bir ısıtma bloğu ayarlayın. kültürlere verimli ısı dağılımını sağlamak için ısı bloğu çukurlarına su eklenir. 15 ml konik tüp, su seviyesi taşma yükselecek, ancak iyi bir dudak neden olacağını her kuyu gibi su ekleyin.
    2. hücre lisizini takiben protein denatürasyonu 95 ° C'de 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü ikinci bir ısıtma bloğu ayarlayın.
    3. Ön sıcak taze büyüme ortamı, 30 ° C (analiz edilecek kültür başına zaman noktası başına 1.1 mi).
    4. 50 ul 20x Durdurma Mix ekle (kültür başına bir tüp zaman başına nokta denenecek) mikrosantrifüj tüpleri önceden etiketlenmiş. buz üzerinde tüpler yerleştirin.
      DİKKAT: sodyum azid, 20x Durdurma Karışım bir madde, oral yoldan ya da deri teması ile toksiktir. Hazırlanması, saklanması ve sodyum azit tutarken üretici tavsiyelerine uyun. Kazara maruz kalma durumunda, üretici tarafından sağlanan malzeme güvenlik bilgi formunu danışın.
  7. Hücreler, orta-logaritmik büyüme ulaştığı zaman, her zaman noktasında her kültür 2.5 OD 600 birim toplamak (örneğin, 7,5 OD 600 tane üç zaman noktasında protein bolluğu analiz etmek için) tahlil edilecek. Santrifüj Eğer 3,0, 15 ml konik tüplerde hücreler toplanmış2 dakika boyunca oda sıcaklığında 00 xg.
    NOT: Bir OD 600 ünite OD 1.0 600, 1 ml kültüre mevcut maya miktarına eşittir. V = x OD 600 birim / OD 600 ölçüm süresi: X, OD 600 birim (V) hasat için gereken kültür (ml) hacmi, aşağıdaki denklem kullanılarak belirlenebilir. Örneğin, bir OD 1.0 600 maya hücresi kültürü 7.5 OD 600 birim hasat 7.5 OD 600 birim / 1.0 = 7.5 ml maya kültürü toplamak.
  8. 30 ° C (7.5 OD 600 birim örneğin, 3 ml), hücrelerin 2.5 OD 600 birimi başına (önceden ısıtılmış), taze büyüme ortamı, 1 ml her bir hücre pelletini.

2. Siklohekzimid Chase

  1. 30 ° C ısı bloğu 5 dakika boyunca kuluçkalama ile maya hücre süspansiyonları dengelenmesi.
  2. 0:00 kadar saymak için bir zamanlayıcı hazırlayın.
  3. zamanlayıcı sikloheksimid kovalamaca, basın "Başlat" başlayacak. hızla,ama dikkatle, aşağıdaki adımları gerçekleştirin:
    1. İlk maya hücre süspansiyonuna, 250 ug / ml'lik bir son konsantrasyona kadar sikloheksimid ekleme (örneğin, hücre süspansiyonu, 3 ml, 20 mg / ml siklohegzimid stokunun 37.5 ul), ve vorteks kısa bir süre karıştırmak.
      DİKKAT: Siklohekzimid dermal tahriş ve ağız yoluyla ilaç yoluyla toksiktir. Hazırlanması, saklanması ve Siklohekzimidsiz işlerken üretici tavsiyelerine uyun. Kazara maruz kalma durumunda, üretici tarafından sağlanan malzeme güvenlik bilgi formunu danışın.
    2. Hemen sikloheksimid ve vorteks ilave edildikten sonra, 50 ul buz soğukluğunda 20x durdurma karışımı ihtiva eden bir ön-etiketli mikrosantrifüj tüpüne eklenmiştir sikloheksimid maya hücre süspansiyonu 950 ul (~ 2.4 OD 600 birim) aktarın. Tüm örnekler toplanmıştır kadar buz üzerinde ependorf tüp, ve yer Vortex.
    3. 30 ° C'ye kadar maya hücre süspansiyonu geri dönün.
  4. Adımları tekrarlayın 2.3 ile 2.3.1.3 Düzenli zaman aralıklarında (kalan maya hücresi süspansiyonları her biri için, örneğin, sikloheksimid ilave edilir, öyle ki, her 30 saniye, 1:00 de, 0:30 de, 0:00 de örnek # 3 Örnek 2. 1. Numune vb.).
  5. sonraki her zaman noktasında 50 ul önceden soğutulmuş 20x Durdurma Mix ihtiva eden etiketli mikrosantrifüj tüplerine vorteks maya hücresi süspansiyonları ve transfer 950 ul. Vortex ve buz üzerinde yer hücreler toplandı. 30 ° C ısı bloğu 15 ml konik tüpler dönün.
    1. Örneğin, 30 dakika sikloheksimid ilave edildikten sonra hücrelerin toplanması için, girdap (zamanla başlangıcında, maya hücre süspansiyonlarına sikloheksimid ilave arasında 30 saniyelik aralıklarla varsayarak) ve 30:00 de örnek # 1 hücre süspansiyonu 950 ul çıkarın . böylece 30:30 de örnek # 2 için tekrarlayın ve.
      Not: Chase süresince konik tüp yaklaşık 5 dakika 15 ml maya, girdap hücre süspansiyonları oturmasını önlemek için. Alternatif olarak, maya hücre süspansiyonus sikloheksimid takip deney süresince sürekli olarak ajite su banyosu içinde muhafaza edilebilir.
  6. Tüm numuneler toplanmıştır sonra, pelet 30 saniye boyunca oda sıcaklığında 6500 x g'de santrifüj ile hücreler toplandı. pipetle veya aspirasyon ile süpernatantı. Hücreler artık alkali lizis için hazır. Seçenek olarak ise, ek bileşen dondurularak sıvı azot ve mağaza pelet hücreleri -80 ° C'de ilave edildi.

3. Post-alkali Protein Ekstraksiyonu (16,40 den Modifiye)

  1. Her hücre pelletine damıtılmış suyun 100 ul ekle. Yukarı ve aşağı pipetleme veya vorteks tarafından süspanse edin.
  2. Her bir örnek için 0.2 M NaOH, 100 ul ekle. yukarı pipetleme ve aşağı ya da vorteks karıştırın.
  3. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında süspansiye edilmiş hücreler inkübe edin. Bu aşamada, maya hücreleri lize edilmemiştir ve proteinler 40 serbest edilmemiştir.
  4. Oda öfke 18.000 xg santrifüj Pelet hücreleri30 sn için çalıçtırdıgınızda. pipetle veya aspirasyon ile süpernatantı.
  5. , Hücreler lize edildi Her hücre pelletine Laemmli numune tampon 100 ul ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleme veya vorteks tarafından süspanse edin.
    Not: Tris-glisin çalışan tamponu sistemi kullanılarak sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile uyumlu bir biçimde NaOH ve Laemmli numune tamponu bültenleri proteinleri ile hücrelerin ardışık inkübasyon.
  6. 5 dakika tam proteinleri denatüre etmek için 95 ° C'de inkübe edin.
    Not: 95 ° C'de inkübasyon toplama eğilimli proteinlerin analizi için uygun değildir (örneğin, çeşitli transmembran segmentlerle proteinleri). Yüksek sıcaklıklarda 41 ° C'de inkübe bu proteinler çözünmez hale gelebilir. Bu nedenle, bu tür proteinlerin analizinde, lizatlar daha düşük sıcaklıklarda inkübe edilmelidir (örneğin, 37 ° C - 70 ° C) 10 - 30 dakika, hem deneysel olarak belirlenebilir.
  7. ro 18.000 xg'de santrifüj lizatları1 dakika için OM sıcaklığı çözünmeyen malzeme peletlendi. Süpernatan (çözünebilir ekstre protein), SDS-PAGE ve ardından Western blot analizi ile ayrılması için hazır hale gelir. Alternatif olarak, -20 ° C'de mağaza lizatları.

4. Temsilcisi SDS-PAGE ve Western Blot Prosedürü (16 uyarlanmıştır)

  1. Yük proteini moleküler ağırlık standartları ve bir SDS-PAGE jeli üzerine lizatları ampirik bir biçimde tespit hacmi.
    Not: ilgilenilen proteinin moleküler ağırlığı bazında SDS-PAGE jeli akrilamid ve bis-akrilamid yüzdesini seçin. Genel olarak, düşük bir yüzde jeller yüksek molekül ağırlıklı proteinlerin çözülmesi için daha uygundur.
  2. boya ön kadar 200 V çalıştırmak jel jel alt kenarı ulaşmıştır.
  3. 4 ° C'de 90 dakika - 60 20 V ıslak transferi poliviniliden florit (PVDF) membrana jel proteinleri aktarın.
  4. (TBC Tris tamponlu tuz içinde kuluçkalanmasıyla zar blokeS),% 5 kaymağı alınmış süt içeren, 1 saat boyunca veya bütün gece 4 ° C'de, oda sıcaklığında, sallanan.
    Not: gece boyunca inkübe bir membran mevcudiyetinde mikrobiyal büyümeyi önlemek için,% 0.02 nihai bir konsantrasyonda bloke çözeltisi içinde sodyum azit dahil edilmesi önerilmektedir.
  5. 1 saat süre ile, oda sıcaklığında,% 0.1 Tween-20 (TBS / T) ve% 1 yağsız süt, sallanan TBS daki protein için spesifik primer antikor ile membran inkübe edin.
  6. sallanan TBS / T ile oda sıcaklığında 3 x 5 dk membran yıkayın.
  7. Sallanan 1 saat boyunca oda sıcaklığında% 1 yağsız süt ile TBS / T uygun fluorofor-konjuge sekonder antikor ile membran inkübe edin.
    NOT: Flüoroforlar ışığa duyarlıdır. Bu nedenle, florofor konjüge antikor seyreltileri karanlıkta hazırlanmıştır ve membranların ışık geçirmeyen (ör, metal yaprak sarılı) co gerçekleşmelidir fluorophores ve daha sonra yıkama aşamasına konjuge antikor varlığında olmalıdırntainers.
  8. sallanan TBS / T ile oda sıcaklığında 3 x 5 dk membran yıkayın.
  9. LI-COR Odyssey CLX ve üretici tavsiyelerine aşağıdaki Image Studio yazılımı (ya da benzer görüntüleme cihazları ve yazılım), kullanarak görüntü membran.
  10. Membran görüntü aldıktan sonra, sallama, 1 saat süre ile, oda sıcaklığında,% 1 yağsız süt ile TBS / T içinde bir yükleme kontrol proteini için spesifik bir primer antikor ile membran inkübe edin.
  11. sallanan TBS / T ile oda sıcaklığında 3 x 5 dk membran yıkayın.
  12. Sallanan 1 saat boyunca oda sıcaklığında% 1 yağsız süt ile TBS / T uygun fluorofor-konjuge sekonder antikor ile membran inkübe edin.
  13. sallanan TBS / T ile oda sıcaklığında 3 x 5 dk membran yıkayın.
  14. Adım 4.9 gibi görüntü membran.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Sikloheksimid Chase yöntemi göstermek için, Deg1 -Sec62 stabilitesi (Şekil 1) bir model maya endoplazmik retikulum (ER) -associated bozulması (ERAD) alt-tabaka, 42-44 analiz edilmiştir. ERAD, kalite kontrol ubikuitin ligaz enzimleri kovalent ER zarında lokalize anormal proteinlerin küçük bir protein ubikitinin zincirlerini takın. Böyle polyubiquitylated proteinler daha sonra ER kaldırılır ve proteazom, büyük, sitozolik proteaz 45 tarafından...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu yazıda, protein yıkımı kinetik analiz etmek için bir yöntem sunulmaktadır. Bu teknik hali hazırda çeşitli mekanizmalar ile bozulmuş proteinler, bir dizi uygulanabilir. Sikloheksimid kovalamaca deneyleri belirli bir proteinin kararlı durum havuzunun bozulma kinetiği rapor dikkat etmek önemlidir. Diğer teknikler proteinlerinin spesifik popülasyonlarının degradasyon kinetiğinin analiz etmek için kullanılabilir. Örneğin, doğmakta olan polipeptidlerin parçalayıcı kaderi darbe kovalamaca analizi 55 tarafından iz...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, destekleyici ve hevesli bir araştırma ortamı sağladıkları için Rubenstein laboratuvarının mevcut ve eski üyelerine teşekkür eder. Yazarlar, reaktifleri ve uzmanlıklarını paylaştığı için Mark Hochstrasser'e (Yale Üniversitesi) teşekkür eder. E.M.R., Stefan Kreft (Konstanz Üniversitesi) ve Jennifer Bruns'a (Pittsburgh Üniversitesi) proteinlerin kinetik analizindeki paha biçilmez uzmanlıklarını paylaştıkları için teşekkür eder. Bu çalışma, EMR'ye Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi (R15 GM111713), EMR'ye Ball State Üniversitesi ASPiRE araştırma ödülü, Ball State Üniversitesi'nden Sigma Xi'ye bir araştırma ödülü ve Ball State Üniversitesi Provost Ofisi ve Biyoloji Bölümü'nden fonlar ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
İstenilen maya suşları, plazmitler, standart ortam ve tampon bileşenleri
Tek kullanımlık borosilikat cam tüplerFisher Scientific14-961-32Çeşitli üreticilerden temin edilebilir
Sıcaklık ayarlı inkübatör (örn. Heratherm İnkübatör Modeli IMH180)Dot Scientific51028068Çeşitli üreticilerden temin edilebilir
18 mm tüpler için New Brunswick Değiştirilebilir Tambur (tüp silindiri)New BrunswickM1053-0450Süspansiyon halinde maya hücrelerinin gece boyunca  starter kültürlerini korumak için bir tüp silindiri önerilir. Alternatif olarak, bir tüp silindiri mevcut değilse, gece boyunca başlatıcı kültürler için sıcaklık kontrollü bir inkübatörde bir platform çalkalayıcı kullanılabilir. Daha büyük kültürleri süspansiyonda tutmak için bir platform çalkalayıcı veya tüp silindiri kullanılabilir.
New Brunswick TC-7 Makaralı Tambur 120 V 50/60 HNew BrunswickM1053-4004Tüp makaralı
SmartSpec Plus SpektrofotometreBio-Rad170-2525Çeşitli üreticilerden temin edilebilir
Santrifüj 5430Eppendorf5427 000.216 Ünite ile birlikte satılan rotor 1.5 ve 2.0 ml mikrosantrifüj tüpleri bulundurur. Rotor, 15 ve 50 ml konik tüpler içeren bir rotorla değiştirilebilir
Sabit Açılı Rotor F-35-6-30, Santrifüj Modeli 5430/R için Kapaklı ve Adaptörler, 15/50 ml Konik Tüpler, 6'lıEppendorfF-35-6-30
15 ml serigrafi baskılı vidalı kapaklı tüp 17 x 20 mm konik, polipropilenSarstedt62.554.205Çeşitli üreticilerden temin edilebilir
1.5 ml esnek tüp, PCR temiz, doğal mikrosantrifüj tüpleriEppendorf22364120Çeşitli üreticilerden temin edilebilir
Analog Dri-Bath IsıtıcılarıFisher Scientific1172011AQİki ısıtıcının mevcut olması önerilir (biri sikloheksimid tedavisi sırasında hücreleri inkübe etmek için ve diğeri proteinleri denatüre etmek için lizatları kaynatmak için). Alternatif olarak, 30 & derece; C su banyosu, sikloheksimid varlığında hücrelerin inkübasyonu için kullanılabilir. Sıcak plakalı kaynar su banyosu, proteinleri denatüre etmek için alternatif olarak kullanılabilir.
12 x 15 ml konik tüpler için ısıtma bloğuFisher Scientific11-473-70Sikloheksimid varlığında hücrelerin inkübasyonu sırasında Dri-Bath Isıtıcı ile kullanım için.
20 x 1,5 ml konik tüpler için ısıtma bloğuFisher Scientific11-718-9QProtein denatürasyonu için lizatları kaynatmak için Dri-Bath Isıtıcı ile kullanım içindir.
SDS-PAGE çalıştırma ve transfer cihazları, güç kaynakları ve görüntüleme ekipmanı veya SDS-PAGE ve membranaLaboratuvara ve uygulamaya göre değişir
Western blot görüntüleme sistemi (örn. Li-Cor Odyssey CLx tarayıcı ve Image Studio Yazılımı)Li-Cor9140-01Laboratuvara ve uygulamaya göre değişir
EMD Kırlangıç İmmobilon PVDF Transfer MembranlarıFisher ScientificIPFL00010Laboratuvara ve uygulamaya göre değişir
Birincil antikorlar (örn. Fosfogliserat Kinaz (Pgk1) Monoklonal antikor, fare (klon 22C5D8))Yaşam Teknolojileri459250Laboratuvara ve uygulamaya göre değişir
İkincil antikorlar (örn. Alexa-Fluor 680 Tavşan Anti-Fare IgG (H + L))Life TechnologiesA-21065Laboratuvara ve uygulamaya göre değişiklik gösterir
ile kullanım için aktarım için karanlık odalar

Kaynaklar

  1. Jankowska, E., Stoj, J., Karpowicz, P., Osmulski, P. A., Gaczynska, M. The proteasome in health and disease. Cur Pharm Des. 19 (6), 1010-1028 (2013).
  2. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 369-381 (2006).
  3. Amm, I., Sommer, T., Wolf, D. H. Protein quality control and elimination of protein waste: the role of the ubiquitin-proteasome system. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 182-196 (2014).
  4. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426 (6968), 895-899 (2003).
  5. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiol Rev. 92 (2), 537-576 (2012).
  6. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circ Res. 112 (7), 1046-1058 (2013).
  7. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
  8. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochem. 8 Suppl 1, S11(2007).
  9. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (1), 29-46 (2011).
  10. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Curr Pharm Des. 19 (18), 3175-3189 (2013).
  11. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30 (11-12), 1172-1184 (2008).
  12. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opin Ther Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  13. Crowder, J. J., et al. Rkr1/Ltn1 Ubiquitin Ligase-Mediated Degradation of Translationally Stalled Endoplasmic Reticulum Proteins. J Biol Chem. 290 (30), 18454-18466 (2015).
  14. Gardner, R. G., et al. Endoplasmic reticulum degradation requires lumen to cytosol signaling. Transmembrane control of Hrd1p by Hrd3p. J Cell Biol. 151 (1), 69-82 (2000).
  15. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283 (47), 32302-32316 (2008).
  16. Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J Vis Exp. (96), e52428(2015).
  17. Cohen, I., Geffen, Y., Ravid, G., Ravid, T. Reporter-based growth assay for systematic analysis of protein degradation. J Vis Exp. (93), e52021(2014).
  18. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25 (3), 533-543 (2006).
  19. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. J Biol Chem. 283 (24), 16374-16383 (2008).
  20. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Rep. 5 (7), 692-697 (2004).
  21. Habeck, G., Ebner, F. A., Shimada-Kreft, H., Kreft, S. G. The yeast ERAD-C ubiquitin ligase Doa10 recognizes an intramembrane degron. J Cell Biol. 209 (2), 261-273 (2015).
  22. Tran, J. R., Brodsky, J. L. Assays to measure ER-associated degradation in yeast. Methods Mol Biol. 832, 505-518 (2012).
  23. Kao, S. H., et al. GSK3beta controls epithelial-mesenchymal transition and tumor metastasis by CHIP-mediated degradation of Slug. Oncogene. 33 (24), 3172-3182 (2014).
  24. Hampton, R. Y., Rine, J. Regulated degradation of HMG-CoA reductase, an integral membrane protein of the endoplasmic reticulum, in yeast. J Cell Biol. 125 (2), 299-312 (1994).
  25. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61 (4), 697-708 (1990).
  26. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6 (3), 209-217 (2010).
  27. Whiffen, A. J., Bohonos, N., Emerson, R. L. The Production of an Antifungal Antibiotic by Streptomyces griseus. J Bacteriol. 52 (5), 610-611 (1946).
  28. Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
  29. Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  30. Kerridge, D. The effect of actidione and other antifungal agents on nucleic acid and protein synthesis in Saccharomyces carlsbergensis. J Gen Microbiol. 19 (3), 497-506 (1958).
  31. Chakrabarti, S., Dube, D. K., Roy, S. C. Effects of emetine and cycloheximide on mitochondrial protein synthesis in different systems. Biochem J. 128 (2), 461-462 (1972).
  32. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. EMBO J. 11 (8), 3077-3080 (1992).
  33. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA. 311 (19), 1969-1970 (2014).
  34. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. EMBO J. 10 (3), 555-562 (1991).
  35. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365 (6442), 176-179 (1993).
  36. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273 (5282), 1725-1728 (1996).
  37. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protoc. 2 (1), 31-34 (2007).
  38. Bergman, L. W. Growth and maintenance of yeast. Methods Mol Biol. 177, 9-14 (2001).
  39. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Degradation of subunits of the Sec61p complex, an integral component of the ER membrane, by the ubiquitin-proteasome pathway. EMBO J. 15 (9), 2069-2076 (1996).
  40. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
  41. Sharma, M., Benharouga, M., Hu, W., Lukacs, G. L. Conformational and temperature-sensitive stability defects of the delta F508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in post-endoplasmic reticulum compartments. J Biol Chem. 276 (12), 8942-8950 (2001).
  42. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. EMBO J. 17 (12), 3251-3257 (1998).
  43. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. J Cell Biol. 197 (6), 761-773 (2012).
  44. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. J Cell Biol. 181 (7), 1095-1105 (2008).
  45. Thibault, G., Ng, D. T. The endoplasmic reticulum-associated degradation pathways of budding yeast. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (12), (2012).
  46. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. J Biol Chem. 272 (33), 20427-20434 (1997).
  47. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. J Biol Chem. 276 (1), 541-550 (2001).
  48. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35 (43), 13843-13848 (1996).
  49. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Role of Cue1p in ubiquitination and degradation at the ER surface. Science. 278 (5344), 1806-1809 (1997).
  50. Metzger, M. B., et al. A structurally unique E2-binding domain activates ubiquitination by the ERAD E2, Ubc7p, through multiple mechanisms. Mol Cell. 50 (4), 516-527 (2013).
  51. Bazirgan, O. A., Hampton, R. Y. Cue1p is an activator of Ubc7p E2 activity in vitro and in vivo. J Biol Chem. 283 (19), 12797-12810 (2008).
  52. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. J Cell Biol. 172 (2), 211-219 (2006).
  53. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74 (2), 357-369 (1993).
  54. Jungmann, J., Reins, H. A., Schobert, C., Jentsch, S. Resistance to cadmium mediated by ubiquitin-dependent proteolysis. Nature. 361 (6410), 369-371 (1993).
  55. Tansey, W. P. Pulse-chase assay for measuring protein stability in yeast. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
  56. Hanna, J., Leggett, D. S., Finley, D. Ubiquitin depletion as a key mediator of toxicity by translational inhibitors. Mol Cell Biol. 23 (24), 9251-9261 (2003).
  57. Wilson, W. A., Hawley, S. A., Hardie, D. G. Glucose repression/derepression in budding yeast: SNF1 protein kinase is activated by phosphorylation under derepressing conditions, and this correlates with a high AMP:ATP ratio. Curr Biol. 6 (11), 1426-1434 (1996).
  58. Ashe, M. P., De Long, S. K., Sachs, A. B. Glucose depletion rapidly inhibits translation initiation in yeast. Mol Biol Cell. 11 (3), 833-848 (2000).
  59. Grant, C. M., MacIver, F. H., Dawes, I. W. Mitochondrial function is required for resistance to oxidative stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 410 (2-3), 219-222 (1997).
  60. Javmen, A., et al. beta-Glucan from Saccharomyces cerevisiae Induces IFN-gamma Production In Vivo in BALB/c Mice. In Vivo. 29 (3), 359-363 (2015).
  61. Link, A. J., LaBaer, J. Trichloroacetic acid (TCA) precipitation of proteins. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (8), 993-994 (2011).
  62. Hornbeck, P. V. Enzyme-Linked Immunosorbent Assays. Curr Protoc Immunol. 110, 2.1.1-2.1.23 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Western Blot AnaliziProtein Sentezi nhibisyonuMaya H cre LizisiSDS PAGE Ay r mGenetik Gereksinim Analizievresel Etkiler al masKararl Durum Pop lasyonu

İlgili makaleler