Yöntem makalesi

Fare Lens Basınç Sertliği değerlendirin Cam lameller Sıralı Uygulama: Gerilme ve Morfometrik Analizleri

DOI:

10.3791/53986

⸱

3 Mayıs 2016

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Göz merceği sertliğinde yaşa bağlı artışlar presbiyopi ile bağlantılıdır. Bu protokol, fare merceği sertliğini ölçmek için basit, uygun maliyetli bir yöntemi açıklar. Fare mercekleri, insan mercekleri gibi, yaşla birlikte daha sert hale gelir. Bu yöntem hassastır ve daha büyük hayvanlardan elde edilen lensler için uyarlanabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Göz merceği kırar ve retinada net bir görüntü oluşturmak için ışık odaklanan şeffaf bir organdır. İnsanlarda, siliyer kaslar kasılır yakındaki nesnelere odaklanmak lens optik güç, konaklama olarak bilinen bir süreç içinde bir artışa yol açarak, lensi deforme etmek. Lens sertliği yaşa bağlı değişiklikler presbiyopi bağlantılı olmuştur, uzantısına göre karşılamak için objektif yeteneğini azalma ve, okuma gözlükleri için gereklidir. Fare lensler karşılamak ya da presbiyop geliştirmek değil olsa bile, fare modelleri anlayış lens patolojileri için paha biçilmez bir genetik araç sağlayabilir ve farelerde gözlenen hızlandırılmış yaşlanma lens yaşa bağlı değişikliklerin çalışmayı sağlar. Bu protokol, fare lens sertliği belirleyen sırayla uygulamak lens üzerine sıkıştırma yüklerini artan cam lamelleri kullanarak, basit, hassas ve düşük maliyetli yöntem gösterilmektedir. Temsilcisi veri fare lensler gibi, yaşla birlikte daha sert hale teyitİnsan lensler. Bu yöntem son derece tekrarlanabilir ve potansiyel büyük hayvanlar test lensleri mekanik olarak kadar ölçeklendirilebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lens, gözün ön kamarasında bulunan ve ışığın retinaya ince bir şekilde odaklanmasından sorumlu şeffaf ve avasküler bir organdır. Lens kapsülü adı verilen berrak bir bazal zar, epitel hücrelerinin1,2 ön tek tabakası ile kaplanmış uzun lif hücrelerinin bir yığınını çevreler. Lensin yaşam boyu büyümesi, lens ekvatorundaki epitel hücrelerinin sürekli çoğalmasına ve farklılaşarak yeni fiber hücrelere dönüşmesine ve bu hücrelerin önceki nesil fiber hücrelere konsantrik bir şekilde eklenmesine bağlıdır2. Zamanla, lens lifi hücreleri sıkışır ve lensin ortasında çekirdek1 adı verilen sert bir merkez oluşur. Gözün optik gücündeki diyoptrik bir değişiklik olarak tanımlanan akomodasyon, insanlarda siliyer kaslar lensi deforme etmek için kasıldığında ve yakındaki nesnelere odaklanmak için optik güçte gerçek bir artışa izin verdiğindemeydana gelir 3-5. Yerleştirilmemiş gözde, lens, zonüler liflerden gelen gerilim nedeniyle nispeten düzleştirilmiş bir durumda tutulur. Siliyer kaslar kasıldığında, lens üzerindeki gerilim serbest bırakılır, bu da lens ekvator çapının azalmasına ve eksenel kalınlığın artmasına neden olur. Lenste yaşa bağlı değişiklikler, ilerleyici bir lens konaklama kaybı olan presbiyopiye neden olur ve bu da okuma gözlüğü ihtiyacına yol açar.

Birçok çalışma, presbiyopiyi lens6-11'in içsel sertliğinde yaşa bağlı artışla ilişkilendirmiştir. Sertlik, elastik bir nesnenin uygulanan yük altında deforme olmaya karşı gösterdiği direnç olarak tanımlanır. İnsan lenslerinin sertliğini incelemek için spin sıkıştırma12-14, aktüatör sıkıştırma15, prob girintisi16, dinamik mekanik analiz 6,10 ve kabarcık tabanlı akustik radyasyon kuvveti17 dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılmıştır. Fare lensleri presbiyopiyi barındırmaz veya geliştirmezken, lens patolojileri için fare modelleri değerli araçlardır, çünkü fareler daha büyük hayvanlardan daha ucuzdur, genetik olarak iyi karakterize edilir ve hızlı yaşlanma nedeniyle yaşa bağlı hızlandırılmış değişikliklere uğrar. Bir avuç çalışma, fare merceği sertliğini kompresyon yöntemleriyle incelemiş ve yaşlanma veya hedeflenen genetik bozulmalara bağlı olarak lens sertliğindeki değişiklikleri göstermiştir18-21. Bu nedenle, fare lensleri, lens sertliğindeki yaşa bağlı değişiklikleri incelemek için iyi modellerdir.

Bu protokol, merceğin bir diseksiyon mikroskobu ve ayna aracılığıyla fotoğraflanmasıyla bağlantılı olarak mercek üzerine cam lamellerin uygulanmasına dayalı fare merceği sertliğini belirlemek için basit ve ucuz, ancak kesin ve tekrarlanabilir bir sıkıştırma yöntemini tanımlar. Bu yöntem, kolayca imal edilen ve monte edilen bir aparat ile sağlam gerinim ve morfometrik veriler sağlar. Temsili sonuçlar, fare lenslerinin yaşla birlikte sertliğinin arttığını doğrulamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bütün hayvan prosedürleri Scripps Araştırma Enstitüsü'nde Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından Sağlık ve onaylı protokol çerçevesinde Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımı için Kılavuzu'nda tavsiyeleri doğrultusunda yapıldı.

1. Mercek Diseksiyon

  1. Sağlık "Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu" National Institutes ve onaylanmış kuruluş hayvan kullanım protokolleri önerilere göre fareler Euthanize.
  2. Kavisli bir forseps kullanılarak farelerden göz aydınlatmak. soketten göz getirmek ve daha sonra forseps ile soketten göz koparmak için forseps ile göz etrafında doku basınız. diseksiyon çanak taze 1x fosfat tamponlu salin (PBS) gözleri aktarın.
  3. mümkün olduğunca göz küresinin kadar yakın optik siniri kesti. Yavaşça ve dikkatlice delik nereye yoluyla küresi içine ince düz bir cımbız eklemeke optik sinir posterior çıkar.
  4. Dikkatle korneanın kenarından posterior göz küresi içine makas ile bir kesi yapmak. Kemirgen lensler gözün ~% 30 işgal. dikkatle bu kesiler yapmak ve lensi zarar vermemek için çok derin göz içine cımbız veya makas takmayın.
  5. göz küresi etrafında en az yarım kornea ve sklera arasındaki kavşakta boyunca kesilir.
  6. Yavaşça adımlarda 1.4 ve 1.5 yapılan açıklıktan göz merceği kaldırmak için kornea üzerinde itin.
  7. dikkatle hâlâ lense bağlı herhangi bir büyük enkaz kaldırmak için ince uçlu düz forseps kullanın. Görme sertlik ölçümlerine geçmeden önce herhangi bir hasar lensi kontrol edin.

2. Sertlik Ölçümleri

  1. bir analitik terazi kullanarak aynı kutudan en az 10 lamelleri tartılır. lamelleri ortalama ağırlığını bulun. Tutarlılık için, tüm deneyler için lamelleri aynı kutusunu kullanın. Ön-yaşDeney başlamadan önce en az 2 saat oda sıcaklığında 1 x PBS içinde lamelleri ve sağ-açılı ayna.
  2. 1x PBS 75 ml - ölçüm gözüne doldurun 65 ile (Şekil 1 e bakınız). Ölçüm odası bir in-house makine atölyesi tarafından pleksiglas üzerinden yapıldığı ve odasında Divots uygun bir matkap ucu ile istenilen derinliğe kadar ayarlanmış bir matkap basın tarafından yapılmıştır. Lensler mekanik test süresince, oda sıcaklığında 1 x PBS içinde saydam kalır.

figure-protocol-1
Şekil 1:. Sertlik Ölçüm Odası farklı derinliklerde ve şekiller divots çeşitli ısmarlama sertlik ölçüm odasının boyutlarını gösteren bir fotoğraf. 200 mikron veya 300 mikron derin (sarı ok başları) olan yuvarlak Divots fare lensler üzerinde ölçümler için kullanılmaktadır. Divots 2 mm çapında ve ~ 13 vardır-. Odanın kenarından 14 mm bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. lens tutmak için kullanılacak çimen sabit bir mesafede odasına dik açılı ayna yerleştirin. Ayna deney sırasında hareket olmadığından emin olun.
  2. dikkatle ele geçirmek forseps veya kavisli bir forseps ile ölçüm odasına transfer disseke lensler.
  3. tepeme gelen yüksüz lens bir üst görünüm resim çekin. mikroskop (altta) ve sol ve sağ tarafta bir fiber optik ışık kaynağı diseksiyon gelen aydınlatma ile 30X büyütmede fare lens fotoğraf çekmek. Maksimum ışık yoğunluğu% 80 fiber optik güç kaynağı olarak ayarlayın. gerektiği gibi ortam aydınlatması, kullanıcı tercihi ve resim kalitesine dayalı güç kaynağı çıkışını ayarlayın.
  4. ri aracılığıyla görülebilir yüksüz lensin yan görünüm resim çekinGHT-açılı ayna. Kamera kalibre değilse, odak ayna kenarına bir resim çekmek. Ayna kenarı 5 mm uzunluğunda ve bu ölçü daha sonra piksel / mm belirlemek ve görüntülerde bir ölçek çubuğu olarak hizmet için kullanılabilir.
  5. Yeri çimen içine lens ve lens çimen güvenli ve düz oturduğundan emin olun. yüklemeden önce lensin bir fotoğrafını çekin. lens, ön veya arka direğe çimen istirahat edilmelidir.
  6. lens üzerine yavaşça 1 lamel yerleştirin. sürünme izin vermek için 2 dakika bekleyin ve yüklü lens başka yan görünüm resim çekmek.
  7. Adım 2.8 gibi lamelleri ekleme ve 10 lamelleri toplam uygulanır kadar adım 2.8 gibi her lamel eklenmesinden sonra yan görünüm Fotoğraf çekmeye devam edin.
  8. Tüm lamelleri çıkarın. 2 dakika bekleyin ve tüm lamelleri çıkardıktan sonra lens (iç ve dış çimen ve) bir yan bakışı resim çekmek.

3. Objektif Nucleus Ölçümü

  1. unsurlar içinLens çekirdeği boyutu ine, 1x PBS ile dolu temiz bir Petri kabı objektif hareket.
  2. Yavaşça ince düz forseps kullanarak lensi açarlar.
  3. Slough off eldivenli parmakları arasında merceği yuvarlayarak kortikal lif hücreleri. Kalan lens çekirdeği sert bir mermer gibi hissedeceksiniz. yaş 1 ay başlayan yetişkin lensler üzerinde çekirdeğini izole etmek için bu yordamı kullanın. İzole çekirdeği katı bir cisim olduğundan, mercek çekirdeğin ileri mekanik test, bu anlatılan yöntemi kullanarak yapılamaz.
  4. Yavaşça Petri kabındaki 1x PBS lens çekirdeği durulayın.
  5. geri ölçüm odasına (değil çimen olarak) içine lens çekirdeği koyun ve dik açılı ayna aracılığıyla mercek çekirdeğinin bir görüntü alır.

figure-protocol-2
Şekil 2:. Ex lameller tarafından Sıkıştırılmış bir fare Lensler (A) şematik ve (B) fotoğraf1x PBS ile dolu ölçüm odasında 200 mikron derinliğinde çimen içinde 2 aylık fare lensi gösteren deneysel bir kurulum. Bir dik açı ayna ve bir diseksiyon mikroskobu üzerine monte edilmiş bir dijital kamera lamelleri ile sıkıştırma sırasında lens görüntüleri toplamak için kullanılmıştır. (C) arka arkaya lamelleri artan sayıda sıkıştırılan 2 aylık vahşi tip lensin sagital görüş Fotoğraflar eksenel ve ekvatoral çapları ölçülerek ve lamel tabanlı sıkıştırma testi sırasında eksenel ve ekvatoral suşları hesaplamak için ham veri sağladı. lensin bir yansıması zaman lamelleri (çoğu açıkça görülebilir 1 lamel görüntüde) görülebilir. ölçümleri yaparken, yansıma görmezden ve lensin apekse ölçün. (D) 2 aylık vahşi tip objektif sonrası sıkıştırma ve izole objektif çekirdeğin sagital manzarası fotoğrafları. Post-sıkıştırma objektif ve izole çekirdek çimen dışında oturuyor. Ölçek çubukları, 1mM. Bu rakam, gökh modifiye edilirve ark. PLoS biri 2012 yılında 19. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

4. Görüntü Analizi

  1. yüklemeden önce ve ImageJ veya benzer bir yazılım kullanarak her yükleme aşamasından sonra lenslerin ekvatoral ve eksenel çaplarını ölçün. Her mercek çekirdeğinin çapını ölçün. Herhangi bir yönde bir ölçüm 19,21 yeterli olacaktır bu yüzden objektif çekirdeği neredeyse küreseldir.
  2. kullanılan çimen derinliğini ekleyerek çapları eksenel lensi düzeltin. Ölçüm odasında, çimen lens eksenel kalınlığı 200 mikron (2 aylık fare lensler) ya da 300 mikron (4 aylık ve 8 aylık fare lensler) gizlenmiş.
  3. , Ε = (d - d 0) denklem kullanılarak lens çapı ölçümleri eksenel ve ekvatoral suşları hesaplayın ε suşu / d, 0, d eksenel veya equatorial belirli bir yük altında çapı ve d, 0, sıfır yükte karşılık gelen eksenel veya ekvatoral çapıdır.
  4. (Mg olarak) uygulanan yükün fonksiyonu olarak eksenel ve ekvatoral suşları çizilir.
  5. eksenel Ekvator ve nükleer çapları çiziniz. Hesaplayın ve ekvator çapı eksenel çapı bölerek mercek boy oranını arsa.
  6. Hesaplamak ve denklem kullanılarak objektif hacmini arsa hacmi = r E Ekvator yarıçapı ve r A adımında 2.6 alınan resimden ölçülen eksenel yarıçap olduğunu 4/3 × π × r E 2 × r A,. Bu denklem objektif bir basık küremsi (elipsoid) 1,22 olduğunu varsayar.
  7. Hesaplayın ve adım 3.5 alınan resimden ölçülen r N objektif çekirdeğinin yarıçapı r N 3, × denklemi, hacim = 4/3 × π kullanarak nükleer hacim arsa. Bu denklem lens çekirdeği i varsayarsa küre 19,21.
  8. Hesaplayın ve lens hacmine nükleer hacim oranı olarak nükleer fraksiyonu arsa.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

sertliği ve 2, 4 ve 8 aylık bir fare lenslerin boyutlarının ölçüldü. Fareler TSRI Hayvancılık Tesisi elde edilen saf C57BL6 suşu arka planda tüm yabani tip hayvanlar vardı ve her lens 1 ila 10 lamelleri ile yüklendi. eksenel ve ekvatoral suşları her lamel ilave edildikten sonra lensin eksenel ve ekvatoral çapları ölçülerek ve daha sonra karşılık gelen boş çapa çapında her değişikliği normalize ederek uygulanan yükün bir fonksiyonu olarak hesaplandı. Her yaştan sekiz lensler test edildi v...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lens sertliği ölçmek için bu yöntemi kullanırken birkaç önemli hususlar vardır. odanın (θ) alt kısmına göre - (8.5 ° 8) İlk olarak, lamelleri hafif eğik bir açıyla lens uygulanır. Bu da, eksenel fazla ekvatoryal yerine yük çok küçük bir bileşen uygulanır. Ancak, bu ekvatoral yük günah θ ≈ 0.1 19 çünkü önemsiz kabul edilir. Bu yöntem büyük lensler için adapte edilirse, odasının tabanına lamelleri açısı ekvator yük gerilme hesaplamaları hesaba gerekip gerekmediğini belirlemek üzere ölçülecek gerekir. İkinci ola...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Ulusal Göz Enstitüsü Hibe R01 EY017724 (VMF) ve Ulusal Artrit ve Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü Hibe K99 AR066534 (DSG) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
İnce uçlu düz forsepsİnce Bilimsel Aletler11252-40
Mikrodiseksiyon makası, düz kenarİnce Bilimsel Aletler15000-00
Kavisli forsepsİnce Bilimsel Aletler11272-40
Forseps tutmaHammacherHSC 702-93İsteğe bağlı
Diseksiyon kabıFisher Scientific12565154
60 mm Petri kabıFisher Scientific0875713A
1x fosfat tamponlu salin (PBS)Life Technologies14190
18 x 18 mm cam lamellerFisher Scientific12-542A
LensleriÖzel yapım (bkz. Şekil 1)
Dik açılı aynaEdmund Optics45-591
Işık kaynağıSchott/Fostec8375
Işıklı diseksiyon mikroskobuOlympusSZX-ILLD100SZ-PT fototüplü
Dijital fotoğraf makinesiNikonCoolpix 990
tutmak için bölmeli ölçüm bölmesi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lovicu, F. J., Robinson, M. L. Development of the ocular lens. , Cambridge University Press. (2004).
  2. Piatigorsky, J. Lens differentiation in vertebrates. A review of cellular and molecular features. Differentiation. 19 (3), 134-153 (1981).
  3. Glasser, A. Restoration of accommodation: surgical options for correction of presbyopia. Clin Exp Optom. 91 (3), 279-295 (2008).
  4. Keeney, A. H., Hagman, R. E., Fratello, C. J. Dictionary of ophthalmic optics. , Butterworth-Heinemann. (1995).
  5. Millodot, M. Dictionary of optometry and visual science. 7, Elsevier/Butterworth-Heinemann. (2009).
  6. Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia. Mol Vis. 10, 956-963 (2004).
  7. Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility. Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).
  8. Pierscionek, B. K. Age-related response of human lenses to stretching forces. Exp Eye Res. 60 (3), 325-332 (1995).
  9. Glasser, A., Biometric Campbell, M. C. optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia. Vision Res. 39 (11), 1991-2015 (1999).
  10. Weeber, H. A., van der Heijde, R. G. On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude. Exp Eye Res. 85 (5), 602-607 (2007).
  11. Weeber, H. A., et al. Dynamic mechanical properties of human lenses. Exp Eye Res. 80 (3), 425-434 (2005).
  12. Fisher, R. F. Elastic properties of the human lens. Exp Eye Res. 11 (1), 143(1971).
  13. Krueger, R. R., Sun, X. K., Stroh, J., Myers, R. Experimental increase in accommodative potential after neodymium: yttrium-aluminum-garnet laser photodisruption of paired cadaver lenses. Ophthalmology. 108 (11), 2122-2129 (2001).
  14. Burd, H. J., Wilde, G. S., Judge, S. J. An improved spinning lens test to determine the stiffness of the human lens. Exp Eye Res. 92 (1), 28-39 (2011).
  15. Glasser, A., Campbell, M. C. Presbyopia and the optical changes in the human crystalline lens with age. Vision Res. 38 (2), 209-229 (1998).
  16. Pau, H., Kranz, J. The increasing sclerosis of the human lens with age and its relevance to accommodation and presbyopia. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 229 (3), 294-296 (1991).
  17. Hollman, K. W., O'Donnell, M., Erpelding, T. N. Mapping elasticity in human lenses using bubble-based acoustic radiation force. Exp Eye Res. 85 (6), 890-893 (2007).
  18. Baradia, H., Nikahd, N., Glasser, A. Mouse lens stiffness measurements. Exp Eye Res. 91 (2), 300-307 (2010).
  19. Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734(2012).
  20. Sindhu Kumari, S., et al. Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics. Biochem Biophys Res Commun. , (2015).
  21. Fudge, D. S., et al. Intermediate filaments regulate tissue size and stiffness in the murine lens. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3860-3867 (2011).
  22. Kuszak, J. R., Mazurkiewicz, M., Zoltoski, R. Computer modeling of secondary fiber development and growth: I. Nonprimate lenses. Mol Vis. 12, 251-270 (2006).
  23. Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy. Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mouse Lens StiffnessCompressive StiffnessGlass CoverslipsLens DissectionMorphometric AnalysisStrain MeasurementPBS ChamberDissecting MicroscopeImage AnalysisLens Nucleus

İlgili makaleler