In Vivo Biyosensör Drosophila olmayan apoptotik Kaspaz Aktivite Tracks

Ho Lam Tang; Ho Man Tang; Ming Chiu Fung; J. Marie Hardwick

doi:10.3791/53992

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

In Vivo Biyosensör Drosophila olmayan apoptotik Kaspaz Aktivite Tracks

8.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/53992

⸱

27 Kasım 2016

Ho Lam Tang¹ , Ho Man Tang¹ , Ming Chiu Fung² , J. Marie Hardwick¹

¹W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, ²School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong

Bu makalede

Özet

Kaspaz aktivitesi düşük seviyelerini ihtiva Tüm hayvanlarda sağlıklı hücreleri saptamak için, CaspaseTracker belirlenen son derece hassas biyosensör Drosophila için hazırlandı. Kaspaz bağımlı biyosensör aktivitesi ölüm uyarımının olmaması durumunda optimum koşullar altında yetiştirilen yetişkin hayvan iç organlar içinde uzun ömürlü, sağlıklı hücrelerde tespit edilir.

Özet

Kapazlar, proteolitik aktiviteleri yoluyla apoptotik hücre ölümünün anahtar aracılarıdır. Kaspazlar hücrelerde mevcut teknolojiler tarafından tespit edilebilen seviyelere aktive edildiğinde, apoptozun genellikle kısa bir süre sonra meydana geldiği varsayılır. Kaspazlar, birkaç dakika içinde hızlı ve tam hücre yıkımına neden olmak için birçok fonksiyonel ve yapısal bileşeni parçalayabilir. Bununla birlikte, biriken kanıtlar, normal sağlıklı hücrelerde aynı kaspazların, muhtemelen daha düşük enzimatik seviyelerde başka işlevlere sahip olduğunu göstermektedir. Apoptotik olmayan kaspaz aktivitesi ile ilgili çalışmalar, düşük kaspaz aktivitesi seviyelerinin tespit edilmesindeki zorluklar ve in vivo olarak nihai hücre kaderinin izlenmesi ile ilgili zorluklar nedeniyle engellenmiştir. Burada, bütün hayvanlarda kaspaz aktivitesi yaşamış hücreleri kalıcı olarak etiketleyen ultra hassas bir kaspaz raportörü olan CaspaseTracker'ın kullanımını gösteriyoruz. Drosophila melanogaster için bu in vivo çift renkli CaspaseTracker biyosensörü, yakın zamanda veya devam eden kaspaz aktivitesini belirtmek için kırmızı floresan proteini (RFP) geçici olarak eksprese eder ve geçmişte herhangi bir zamanda kaspaz aktivitesi yaşamış ancak ölmemiş hücrelerde yeşil floresan proteini (GFP) kalıcı olarak eksprese eder. Daha da önemlisi, bu kaspaza bağımlı in vivo biyosensör, yetişkin sinek boyunca organ sistemlerinin dokularında apoptotik olmayan kaspaz aktivitesinin varlığını kolayca ortaya koymaktadır. Bu, beyin, bağırsak, malpighian tübülleri, kardiya, yumurtalık kanalları ve diğer dokulardaki sağlıklı hücrelerde biyosensör aktivitesini tespit etmek için tek tek sineklerin tüm montaj diseksiyonları kullanılarak gösterilmiştir. CaspaseTracker, kaspaz aktivasyonundan en az 10 gün sonra yetişkin nöronlarda ve diğer dokularda biyosensör aktivitesi tespit edildiğinden, uzun ömürlü hücrelerde apoptotik olmayan kaspaz aktivitesini tespit eder. Bu biyosensör, canlı hayvanlarda apoptotik olmayan kaspaz aktivitesinin rollerini ve moleküler mekanizmalarını ortaya çıkarmak için önemli bir araç görevi görür.

Giriş

Kaspazlar önemli aspartat kalıntısı sonra uzun hücre içi proteinleri bölünmesiyle apoptotik hücre ölümüne aracılık sistein proteazlardır. Örneğin, başlatıcı kaspaz efektör Kaspaz, baskılanmasını durdurmak DNA nükleazlar, bölen iskelet parçaları etkinleştirmek ve hücreleri hızla demontaj ve hücre cesetlerin imha komşu hücreler tarafından kendi tanıma ve yutulmasına uyarmak için hücre zarlarının lipit kompozisyonunu değiştirmek. ^1-4 tahmin edilmektedir hücrelerin milyarlarca insan vücudunda günde ölür, ve apoptoz kemoterapi kaynaklı tümör hücre ölümünün önemli bir mekanizması olduğunu. ⁵ caspases farklı bir dizi doğal bağışıklığı uyarmak için fark....