Yöntem makalesi

Looking Glass sayesinde: Time-lapse Mikroskopi ve Tek Hücre Boyuna izleme Anti-kanser Therapeutics Eğitim için

DOI:

10.3791/53994

⸱

14 Mayıs 2016

 , 
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Colorado, Boulder

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, anti-kanser terapötiklerine yanıt olarak tek hücreleri uzunlamasına izlemek için uzun süreli hızlandırılmış mikroskopi yöntemini açıklıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

anti-kanser ilaçları ile tek hücre yanıtı Popülasyon yanıtı belirlenmesinde önemli ölçüde katkıda bulunmaktadır ve bu nedenle genel bir sonuç önemli bir faktördür. Bağışıklık, akım sitometri ve sabit hücre deneyleri genellikle hücreler anti-kanser ilaçlar nasıl tepki incelemek için kullanılır. Bu yöntemler önemlidir, ancak onlar birkaç eksiklikler var. kanser ve normal hücreler arasındaki ve farklı kanser kaynaklı hücreler ve geçici ve nadir yanıtları arasındaki ilaç yanıtları değişkenlik nüfus ortalama analizleri kullanılarak doğrudan izlemek ve uzunlamasına bunları analiz edebilmek olmadan anlamak zordur. mikroskop, özellikle de görüntü canlı hücreler için uygundur. teknolojideki ilerlemeler, sadece hücre izleme değil, aynı zamanda hücresel yanıtların çeşitli gözlem sağlayan bir çözünürlükte rutin görüntü hücreleri sağlamaktadır. Biz sürekli time-lapse görüntüleme sağlayan detaylı bir yaklaşım tarifesasen sürece genellikle 96 saat kadar istediğiniz gibi ilaç yanıtı sırasında hücreler. yaklaşımın çeşitleri kullanılarak, hücreler hafta içinde izlenebilir. genetik olarak kodlanmış floresan biyosensörler sayısız süreçler, yolları ve tepkilerinin istihdam ile takip edilebilir. Bu izleme ve hücre büyümesi ve hücre döngüsü ilerlemesinin, kromozom dinamiği, DNA hasarının ölçme ve hücre ölümünü içerir örnekleri göstermektedir. Biz de teknik ve esnekliği çeşitlerini tartışmak ve bazı ortak tuzaklar vurgulayın.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Canlı hücre mikroskopi ve tek hücre boyuna izleme yeni bir teknik değildir. Erken mikroskoplar, meraklıları ve bilim adamları tek hücreler ve organizmalar, onların davranışlarını ve gelişimini 1-3 gözlenen ve inceledik. 1950'lerde Vanderbilt Üniversitesi'nde geç David Rogers ünlü bir örnek, bir Staphylococcus aureus bakterisi ve fagositoz 4 sonunda sürecini kovalayan bir kan yaymasında bir insan nötrofil gösterir. Bu canlı hücre film tek bir deneyde gözlenen ve korelasyon nasıl birden çok işlem mükemmel bir örnektir: Bir kimyasal degrade, mekanik ve hücre hareketi hızı algılama, hücre dinamikleri, yapışma, ve bir patojenin fagositozu şekillendirir.

tam otomatik mikroskopları ve son derece hassas dijital kameralar gelişi hücre biyolojisi değişen f temel soru sormak için mikroskobu kullanarak araştırmacılar bir çok artan sayılarda sonuçlandıHücreler 5,6 taşımak ve dinamikleri ve membran ticaretini 9-11 organel 7,8 bölmek nasıl rom. Floresan olmayan, 1953 yılında Frits Zernike için Nobel Ödülü topladı faz-kontrast (PC), ve diferansiyel girişim kontrast da dahil olmak üzere aydınlık mikroskobu (DIC) mikrotübül demetleri dahil hücre ve çekirdeklerin aynı zamanda alt hücresel yapıların gözlem için izin , kromozomlar, nükleol, organel dinamikleri ve kalın aktin lifleri 12. Genetik floresan proteinleri kodlanmış ve organeller karşı floresan boyaların geliştirilmesi önemli ölçüde time-lapse mikroskopi 13-15 etkiledi. Bu yazının odağı değil iken, hücre sferoidler ve in situ (Intravital mikroskopi) konfokal ve multiphoton mikroskopi kullanılarak görüntüleme yaklaşımının başka genişleme temsil ve kullanımı ve bu yaklaşımları 16-19 tartışmak seçkin makaleleri vardır.

Anti-Canc hücre tepkilerier ilaçlar veya doğal ürünler moleküler ve hücresel ölçekte belirlenir. Anlamak hücre yanıtları ve kaderleri aşağıdaki tedavisi genellikle tek hücreleri ölçmek nüfus ortalama deneyleri (örn., Immünoblotting, bütün kuyu ölçüleri), ya da immunofluorescent algılama ile sabit zaman noktaları ve akım sitometri, içerir. bir popülasyon içindeki ilaç tek hücre yanıtlarında heterojenliği, tümörler, özellikle de doygunluğuna aynı ilaç ile muamele edilir hücre hatları ve tümör boyunca görülen yanıt olarak değişkenlik bazı açıklayabilir. Belirli bir tek hücre ya da hücrelerin bir popülasyonu aşağıdaki uzunlamasına yaklaşımlar uzun süreli moleküler cevap yollarının doğrudan çalışma için olanak sağlayan daha az sık ama çok güçlü bir yaklaşım, farklı fenotipleri (örn., Hücre ölümü veya hücrenin bölme), gözlem hücre-hücre bir popülasyon içindeki değişkenliği ve nasıl bu faktörler popülasyon yanıtı dinamikleri 20-22 katkıda bulunur. Iyimser, güçlü olmakgözlemlemek ve uyuşturucu bazen başarısız neden çalışmak ve en iyi nasıl bunları kullanmak için nasıl anlayışımızı geliştirmemize yardımcı olacaktır tek hücre yanıtlarını ölçmek için.

Uzun vadeli time-lapse mikroskobu, uzunlamasına izleme ve ilaç yanıtları analiz tekniği birçok araştırmacı tarafından kullanılabilir ve fenotip yanıtları 20,21 gözlemlemek için sadece iletilen ışık kullanarak, basit olabilir. yaklaşımının ana bileşenleri şunlardır: ilgi hücreleri uygun hazırlanması, çevre haznesi ile otomatik mikroskop, kamera kazanmak ve zaman atlamalı yorumlayan görüntüleri saklamak, yazılım ve ölçmek ve hücreleri analiz etmek için bir bilgisayar ile entegre ve herhangi bir floresan biyosensörler. Biz aydınlık ve / veya widefield epifluorescent mikroskopi kullanılarak sürece birkaç gün kültür hücreleri time-lapse mikroskobu yürütmek için birçok ipuçları ile ayrıntılı bir protokol sağlar. kültüründe yetiştirilebilir herhangi bir hücre hattı için kullanılabilir Bu protokolanti-kanser tedavilerinin kendi yanıtlarını incelemek için. Biz elde edilen verilerin örneklerini sunmak ve kısaca farklı prob türleri, avantaj ve uzun vadeli time-lapse ve boyuna izleme dezavantajlarını tartışmak çok farklı genetik olarak kodlanmış floresan biyosensörler ve faz-kontrast mikroskobu örneği kullanılarak analiz, ne olabilir, olmayan doğrudan yaklaşımlar ve biz yaklaşımı kullanılarak kabul değil deneyimsiz araştırmacıların ilgi ve değer olacağını umuyoruz bazı değişimlerden anlaşılması zor ve deneyimli araştırmacılara bu yaklaşım için öğrendim.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıdaki protokol, Şekiller 4 ve 6 ile ilgili olarak elde etme ayarları ve deney koşullarında deneyler ile tanımlanan parametreleri kullanır. Bu parametrelerin çoğu, diğer deneyler uyacak şekilde değiştirilebilir (örneğin, maruz kalma süreleri, gruplama, floresan kanalları, vs.).. Tüm işlemler, kurumsal kurallar ve düzenlemelere uymak zorundadır ve kurumsal biyogüvenlik komitesi tarafından onaylanmalıdır. Mikroskop üretici web siteleri canlı hücre görüntüleme için mükemmel bilgiler içermektedir.

1. mikroskoplar ve Görüntüleme Yazılımı

  1. ters mikroskoplar çok çeşitli canlı hücre görüntüleme gerçekleştirin. En yaygın mikroskoplar Epifloresans ve eğirme diskli konfokal Geniş alanlı edilir. Burada, 200 watt metal halide ışık kaynağı ile bir otomatik ve motorlu widefield Epifloresans mikroskop kullanıyoruz.
  2. Bir sahne top almak veya çevre odasına mikroskop. Burada, bir sahne t kullanmakop çevre odası.
  3. time-lapse mikroskobu yürütmek için programları ile mikroskopları çalıştırmak için ticari yazılım kullanın.
  4. Görüntü analizi için ticari olarak temin edilebilen yazılımı veya ImageJ kullanın. Diğer birçok analiz araçları piyasada mevcuttur ve 8,18 yayınlanmış olan birçok ısmarlama programları vardır.

2. Hücresel Süreçler ve Fenotipik Yanıtlar görselleştirme

  1. aydınlık mikroskobu ile hücrelerin görselleştirmek. yalnız Diferansiyel girişim kontrast ve faz kontrast anti-kanser ilaç yanıtları yanıtları incelemek için çok bilgilendirici olabilir. Bu süreçler mitoz, hücre motilitesi ve apoptoz içerebilir.
  2. floresan biyosensörler ile hücre yapıları, organelleri ve süreçleri gözünüzde canlandırın. Floresan sondalar spesifik hücre içi süreçleri izleme bilgilendirici. Bunlar mikrotübül dinamiklerini, mitokondriyal ve endoplazmik retikulum dinamikleri, protein birikimi ve lokalizasyonu ve içerebilirmoleküler sinyal (örn., fosforilasyon, kalsiyum).

Numunelerin 3. hazırlanması

  1. Standart bir hücre kültürü sertifikalı kap içinde bulunan hücreler büyümek, nemlendirilmiş hücre kültürü yetiştirme cihazı kullanılmaktadır (örneğin, 37 o C,% 5 CO2,% 80 bağıl nem).
    1. EBSS'ye ile MEM HT1080 hücreleri büyütün. % 10 h / h FBS,% 1 h / h Pen / Strep,% 1 hac / hac sodyum piruvat ve% 1 h / h esansiyel olmayan amino asitler ile, ortam takviyesi.
  2. görüntüleme İki gün önce, sertifikalı steril laminer akış kaputun içindeki bir 12-iyi # 1.5 cam alt çanak 3 kuyu içine plaka 50,000 HT1080 FUCCI hücreleri. Deneyin başlaması için ~% 60 izdiham elde etmek için kaplama hücrelerinin sayısını ayarlar. hücre çizgisi ve deney hücre yoğunluğu doğasına bağlı olarak daha az olabilir.
    Not: Hücre yoğunluğu, hücre kuşağının büyümesinin ve deney sonuçları üzerinde derin bir etkiye sahip olabilir. en aza indirmek için hücreleri saymak deneme-to-deney variabilityoğunluğuna bağlı Y.
    1. çevre odasında ve deney için gerekli olan koşullar, tek bölmeli tepsilerde levha hücreler (genellikle 35-veya 60-mm), 4 de 35 mm'lik tabaklar, 6-, 12 veya 24-iyi hücre kültür plakaları ya da bağlı olarak çeşitli biçimlerde slaytlar lamel. Hücre kültürü plastik yoluyla # 1.5 en objektif lensler cam bu kalınlık için optimize edilmiştir cam ve görüntüleme ile cam-alt tabak kullanın çok kötüdür.
      Not: Bazı hücre hatları büyür ve camın üzerine hayatta yoktur. Bu gibi durumlarda, cam (örn., Poli-lisin ya da kolajen), hücre yapışmasını arttırmak için kaplanabilmektedir. Bu uygun bir seçenek olup olmadığını Bazı şirketler, bu ampirik olarak tespit edilmelidir optik hücre kültürü plastik imalatı.

4. Çevre Odası Kurulumu

  1. Önceden herhangi bir deney için, set-up çevre odasını 37 o C 80% nem ~ çalışır ve böylece örnek konumunda sıcaklık böylece. En kültürlenmiş hücreler nedeniyle ortam içinde, sodyum bikarbonat tamponu% 5 CO2 / denge hava atmosferinde büyür. Set-up bağlı olarak, ya% 5 CO 2 çevre kontrolörü ayarlamak ve hava ile% 100 CO 2 karıştırın, ya da% 5 CO 2 / denge hava gazı sertifikalı, önceden karıştırılmış kullanacaktır. Gaz akış hızları için üreticinin talimatlarını izlemelidir.
    Not: bazı hücre çizgileri de CO2 olmaksızın muhafaza edilebilir ve bu durumda, CO 2 bağımsız ortamda büyür. Özel olarak tasarlanmış görüntüleme medya autofluorescent bileşiklerinin eklenmesini sınırlar da mevcuttur. İstenen bir hücre tipi için tezler ortamlarda büyüme deneysel olarak daha önce tespit edilmelidir.
  2. görüntüleme önce su deposu steril damıtılmış su ile (üreticinin talimatlarına sonra) dolu olduğundan emin olun. İstenilen sıcaklık ayarına çevre odasında açın ve mikroskop sahne içerlek içine yerleştirin. gaz kaydetmek için, bu noktada akışını başlatmak yok.
    Not: sahne top haznesi ve sahne içerlek ve / veya deneye hareket eserleri tanıtmak olabilir odasına bağlantı kablolarının herhangi bir gerilim arasında herhangi bir boş alan varsa.
    1. sahneye çift içine odasına odasını takmadan önce sahne gömme açılış kenarları üzerinde parafin filmin parçalarını Lay ve hiçbir bağlantı odasının çekerek emin olun.
  3. Odası 37 o C gelmesini sağlayınız Hücre fizyolojisini etkileyen ve sürüklenme tanıtabilirsiniz görüntüleme sırasında sıcaklık dalgalanmaları önlemek için istikrarlı bir sıcaklık korumak. Ulaşan sıcaklık dengeleme genellikle ortama bağlı olarak 1 saat 30 dakika gerektirir.
    1. ısıtılırken odasına kuyulardan su ile bir 'kukla' çanak yerleştirin. odasına sağlamak yardımcı su taklit ile örnek dolu bir görüntüleme çanak, yeterince ısınmış ve stabilize edilir. Önceden ısıtılmış steril su ile bölme doldurmaIsı dengelenmesi için gerekli olan zamanı azaltır ve deneysel örnek ilavesinden sonra sıcaklık düşmesini minimuma indirir.

5. Mikroskop Set-up

  1. mikroskop, ilişkili bilgisayar, ve gerekli çevre birimlerini açın.
    1. Işık kaynağına bağlı olarak, gerekli kadar açmak için sabırsızlanıyorum (örn., LED).
  2. Düşük pozisyonda objektif taret, kullanılacak 20X 0.7 NA hedefi seçin.
  3. amaç üzerinde örnek yerleştirin - Bu örnek odasına olduğunda daha kolay hücreleri bulmak için yapacaktır.
  4. önceki deneylerden biliniyorsa, şu anda görüntüleme parametreleri tanımlayın.

6. Mikroskop ve Odası'na Hücreler taşınması

  1. Taşıma hücreleri, çevresel bölmeye inkübatör yansıması. Bu nispeten düşük CO2 etkilerini sınırlamak için hızlı bir şekilde yapılır emin olun atmosfer ve hücreler üzerindeki sıcaklık azaldı. Numune taşıma ve dökülme durumunda temiz-up için tüm kurumsal biyogüvenlik kurallarına uyun.
    1. Büyük çevre değişiklikleri önlemek için kapalı bir Strafor kap veya yalıtılmış torba hücreleri yerleştirin.
  2. üreticinin talimatlarına aşağıdaki odasına örnek görüntüleme çanak yerleştirin.
  3. Hücre, çevresel bölme içinde tespit edildikten sonra, kararlı bir ortam sağlamak hemen atmosferik gaz kaynak (lar) açmak için bölme mühür.
    1. bazı çevresel odaları sıkı, mühürlü kapağı kullanmak yok gibi, büyüme ortamının üstüne buharlaşmasını, steril bir katman, embriyo sertifikalı madeni yağ geciktirir. Cam görüntüleme alanını engellemeyecek için dikkatli olmak örnek çanak çevre-kenarlarda gaz geçirgen parafin filmi sarın. Lokalize, ikincil nemlendirme yöntemleri kullanılabilir. performasını azaltabilir örnek çanak kapağı üzerinde yoğunlaşmaaydınlık mikroskobu mance.
  4. Erken deney sırasında termal sürüklenme etkisini en aza indirmek amacıyla, time-lapse başlamadan önce 30 dakika bekleyin. Gerekli zamanlı görüntüleme çanak büyüklüğü ve diğer faktörlere bağlı olarak değişir. ampirik belirleyin.

7. Görüntüleme kurma

  1. en iyi veri temsil edecek seçin görüntüleme koşulları. , Pozlama süreleri sınırlayıcı düşük yoğunlukta ışık kullanılarak ve ışığın uzun dalga boylarına göre heyecanlıyız sondalar seçerek fototoksisite önlemek için gerekli tedbirleri alın.
  2. Her bir konum için X, Y ve Z düzlemi ve istenen dalga boyu (ları) nın, görüntülenecek. Zaman çözünürlüklü pozisyonları ve dalga boyu sayısı ile sınırlıdır. En hücresel süreçlerin uzun vadeli time-lapse, bir görüntü her 10 elde - 20 dakika; yüksek zaman çözünürlüğü (kısa aralıklar, örneğin., 1 dk) daha fazla veri noktaları ve bu nedenle daha güçlü hücre izleme sağlar, fakat aynı zamanda daha entegre sonuçlanırışığa maruz kalma ve daha büyük veri setleri.
    1. - 50 msn, Texas Red / TRITC - 40 msn, aydınlık - 20 milisaniye FITC / GFP: HT1080 FUCCI dinamik, yeşil ve kırmızı floresan proteinleri olduğu gibi (Temsilcisi Sonuçlar bakınız), aşağıdaki poz kez kullanabilirsiniz. 2 x 2 bin kullanın.
  3. Gelişmiş ayarları altında, varsayılan parametreler kullanılarak yazılım kontrollü otomatik netleme etkinleştirin. Tavsiye adım büyüklüğü ile 10 mikron bir otofokus aralığını tanımlayın. time-lapse başlamadan önce bu yaptığınızdan emin olun. Aydınlık görüntüleri ile otofokus ve asla floresan ile fototoksisite ve photobleaching azaltmak için.
    1. motorlu bir sahne ile herhangi bir mikroskop yazılım kontrollü otomatik netleme sistemleri kullanmak ve doğrudan örnek üzerinde odaklanmak. Ancak, deney edinme hızını sınırlayabilir. Sürekli odaklama sistemleri daha fazla pozisyon için izin time-lapse mikroskopi için iyi çalışır ve hızını artırmak kontrollü donanım görüntülü veya devralma daha yüksek bir oran olması. Bununla birlikte,Hava-cam arayüzü tespiti güveniyor ve kuyunun üzerinden cam kalınlığı varyasyonları ile numunenin odağı kaybedebilir.
  4. Medya 37 o C ısıtılmış olmuştur istenen ilaç konsantrasyonu içeren medyanın yarısını Değiştir Kısmi medya yedek termal sürüklenme azaltmaya yardımcı olur. Bu deneyde koşulları araç (DMSO), 1 uM selinexor ve 10 uM PD0332991 vardır.
    Not: Bu adım aynı zamanda duraklatma ve deney yeniden başlatarak satın başlattıktan sonra yapılabilir. Bu tek hücre öncesi ve sonrası ilaç etkileşimleri uzunlamasına izleme sağlar. İlaç kararlılığı ya da metabolizma eğer duraklatma ve medya aynı yöntemle yapılabilir yerine, bir husustur. İlaç bozulması veya metabolizma testi için, muamele edilmiş hücreler ortam, aynı zamanda ilaç etkisini test etmek için saf hücrelerde yerleştirilebilir.
  5. time-lapse başlatın.
  6. Zaman atlamalı çalışır gibi, görüntülü alanlar odak ve Chambe içinde kalmasını sağlamakr nemli 37 o C korur
    1. zaman noktaları arasındaki zaman boşluğu sırasında edinme duraklatarak gerektiği gibi odağı ayarlayın.
  7. Gerekirse, uzun deneyler sırasında bölmeye su ilave edilir. 37 o C'de önceden ısıtılmış steril damıtılmış su eklemek suretiyle soğutma odalı önlemek

8. Time-lapse Bitiş

  1. Deney tamamlanma tükendi zaman otomatik olarak durdurmak için ayarlanmamış ise, satın durdurun.
  2. düzgün veri kaybı olabilir bitmiş değilse çoğu yazılım paketleri otomatik olarak satın alma sırasında tasarruf rağmen time-lapse, sabit diske düzgün kaydedildi emin olun.
  3. mikroskop odasına çıkarın ve onaylı kurumsal biyogüvenlik prosedürleri takip biyolojik tehlikeli atık haline hücrelerin imha edin.

9. Boyuna Takip ve Analiz Zaman atlamalı Verilerinin

  1. bir analiz için metodoloji seçinilgi biyolojik süreçler için uygundur. Birçok ImageJ için eklentileri, MATLAB kullanarak programları ve özel platformlar özel uygulamalar için üretilmiştir. Şekiller 4 ve 5'te gösterildiği gibi, aşağıdaki yöntem çekirdeklerin nükleer flüoresan analiz izleme kapsar.
  2. ImageJ kullanılan kanallar için tif görüntü yığınlarını açın. Alternatif olarak, Bioformats eklentisi kullanarak doğrudan ImageJ satın alma programı açık yerli dosyaları.
  3. aydınlık görüntü veya (eğer kullanılıyorsa) nükleer etiket kanalını kullanarak bir hücrenin çekirdeğinde içinde faiz (ROI) bir bölge çizin ve ROI yöneticisi ekleyin. Not: görüntülü hücreler nükleer etiketi varsa (örneğin, histon H2B EGFP.), Daha sonra otomatik hücre izleme süresi faiz (ROI) bireysel çekirdekleri temsil bölgeleri oluşturmak için kullanılabilir.
  4. dahaki sefere noktasına geçin ve aynı nucleu içinde ROI konumlandırmaks. ROI yöneticisi ROI ekleyin.
  5. Izlemek ve hücresel bir olay (mitoz, apoptoz, vb.) Veya hücre artık izlenebilir kalmayıncaya kadar bireysel hücre için İB'leri yapmaya devam (yani., Çerçevenin dışına taşır veya deney biter).
  6. ROI onlar alanında bulunmaktadır zaman içinde hücreler için kurulduğunda, ilgi floresan kanalları üzerine onları üst üste. Her bir zaman noktası için her kanalda floresans ortalama yoğunluğu ölçülür. daha sonra kullanmak üzere ROI listesini kaydedin.
    1. Çeşitli ölçümler farklı deneyler uygulamalar için ROI içinde yapılabilir. (Örneğin. ROI, entegre yoğunluğu, vb içinde ortalama yoğunluğu.) Analitik yöntemi seçmek için bir menüyü getirmek için ... Analiz → Set Ölçümleri tıklayın.
  7. Izlerken tek tek hücrelerin hücre kaderi (örn., Apoptoz, bölünme, hayatta kalma) unutmayın. Bu hayatta kalma eğrileri ve furthe yaratılması için izinr populasyon çözümlemesi.
  8. Her iki kanal için ortalama yoğunluğu ile, terapötik (Şekil 5B, Cı) yanıt olarak hücre döngüsü dinamikleri görüntülemek için bir dağılım grafiği oluşturur.
    Not: Lineer zaman tek tek hücreler için oluşturulan veya izlenen bir hücre popülasyonu üzerinden ortalaması olabilir. Kantitatif görüntüleme kanser tedavi tepki olarak karmaşık tepkiler ve hücre ilişkilerin kurulması için çok önemli olabilir. Uzun vadeli time-lapse mikroskopi, uzunlamasına izleme ve veri analiz mikroskopisi ve analiz araçları türü için birçok seçenek ile, bir çok adımlı bir süreçtir ve Şekil 1'de verilen genel hatlarıyla izlemektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uzun vadeli time-lapse mikroskopi ve doğrudan uzunlamasına izleme ilaç yanıtı sırasında birçok anti-kanser etkileri çalışma için izin verir. Şekil 1 'de genel hatları sonra hücreler çeşitli örnekleri takip anti-kanser ilaçları ile tedavi edilen doğrulanmış floresan haberci ifade gösterilmiştir ve farklı yaklaşımlar kullanılarak analiz edilmiştir.

Tek başına faz kontrast mikroskop çok bilgilendirici ve sağlam m...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Time-lapse Mikroskopi ve Boyuna İzleme Avantajları

bu araştırmacılar, bireysel hücreleri ve kaderlerini yanı sıra tüm nüfusu izlemenize olanak sağlar olarak mikroskop ilaç yanıtının uzunlamasına çalışmalar için ideal bir araçtır. bir hücre popülasyonu içinde, ilaç yanıtındaki değişkenliği, anti-kanser terapötik tasarımı için önemli bir sorundur. tek hücre Boyuna izleme araştırmacılar bu değişkenliği gözlemlemek ve hücre popülasyonu ile ilgilidir olarak yatan mekanizmaları ve...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Teknik destek için Joshua Marcus'a ve teknik tavsiye için Richard J. McIntosh Işık Mikroskobu Çekirdek Tesisi Direktörü Dr. Jolien Tyler'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Colorado Boulder Üniversitesi ve Colorado Boulder Üniversitesi Lisansüstü Okulu'ndan JDO'ya sağlanan fonlarla desteklenmiştir. RTB, kısmen NIH'den (T32 GM008759) doktora öncesi eğitim hibesi ile desteklenmektedir. Selinexor için Karyopharm Therapeutics, Inc.'e ve Kinesin-5 inhibitörü için Merck Serono'ya teşekkür ederiz. FUCCI plazmitleri, MTA aracılığıyla Atsushi Miyawaki'den (RIKEN, Japonya) gelmektedir. mCherry-BP1-2 Addgene'dendi. H2b-mCherry ve β-tubulin-EGFP'yi eksprese eden HeLa, Daniel Gerlich'ten (IMBA, Avusturya Bilimler Akademisi, Avusturya) alınmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Taxol (paklitaksel)SigmaT7191mikrotübül stabilize edici ilaç
EtoposideSelleckchemS1225topoizomeraz II inhibitörü
SelinexorKaryopharm TherapeuticsveXPO1/CRM1 inhibitörü, hediye
Kinesin-5 inhibitörüMerck Seronohediye, ayrıca American Custom Chemicals Corporation'dan temin edilebilir. CAS 858668-07-2
Hücre büyüme ortamıHyClone (Fisher) veya Mediatechbirçok şirket mevcut
%5 CO2/denge havası, sertifikalıAirgasZ03NI7222004379
35 mm Çanak, 20 mm cam tabanlıCellvisD35-20-1.5-Nbirçok şirket mevcut
35 mm 4 kuyulu Çanak, 20 mm cam tabanlıCellvisD35C4-20-1.5-Nbirçok şirket mevcut
35 mm Çanak, ızgara cam altMatTekP35G-2-14-CGRDbirçok şirket mevcut
Çok kuyulu, cam altCellvisP12-1.5H-Nbirçok şirket mevcut
Olympus IX81 ters epifloresan mikroskobuOlympus
Olympus IX2-UCB denetleyiciOlympus
PRIOR LumenPro200Önceki BilimselLümen200PRO
ÖNCEKİ Proscan III motorlu sahnePrio ScientificH117
STEV odasıInVivo ScientificSTEV. ECU. HC5 STAGE TOP
Çevre Kontrol ÜnitesiInVivo ScientificSTEV. ECU. HC5 STAGE TOP
Hamamatsu ORCA R2 CCD denetleyiciliHamamatsuC10600
Nikon Eclipse TiNikon
Nikon lazer fırlatmaNikon
SOLA hafif motorlümencor
iXon Ultra 897 EM-CCDANDOR 
TOKAI HIT kulüp odasıTOKAI HITTIZSH

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abercrombie, M., Heaysman, J. E., Pegrum, S. M. The locomotion of fibroblasts in culture I. Movements of the leading edge. Exp Cell Res. 59, 393-398 (1970).
  2. Abercrombie, M., Heaysman, J. E. Observations on the social behaviour of cells in tissue culture. I. Speed of movement of chick heart fibroblasts in relation to their mutual contacts. Exp Cell Res. 5, 111-131 (1953).
  3. Landecker, H. Seeing things: from microcinematography to live cell imaging. Nat Methods. 6, 707-709 (2009).
  4. The Chase - Panoramic QuickTime Movie of Classic Rogers Neutrophil Chasing S aureus Bacteria. Bepress. , Available from: http://works.bepress.com/gmcnamara (2012).
  5. van Roosmalen, W., Le Devedec, S. E., Zovko, S., de Bont, H., Bvan de Water, Functional screening with a live cell imaging-based random cell migration assay. Methods Mol Biol. 769, 435-448 (2011).
  6. Krueger, E. W., Orth, J. D., Cao, H., McNiven, M. A. A dynamin-cortactin-Arp2/3 complex mediates actin reorganization in growth factor-stimulated cells. Mol Biol Cell. 14, 1085-1096 (2003).
  7. Cluet, D., Stebe, P. N., Riche, S., Spichty, M., Delattre, M. Automated high-throughput quantification of mitotic spindle positioning from DIC movies of Caenorhabditis embryos. PLoS One. 9 (e93718), (2014).
  8. Held, M., et al. Cell Cognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7, 747-754 (2010).
  9. Orth, J. D., Krueger, E. W., Weller, S. G., McNiven, M. A. A novel endocytic mechanism of epidermal growth factor receptor sequestration and internalization. Cancer Res. 66, 3603-3610 (2006).
  10. Rowland, A. A., Chitwood, P. J., Phillips, M. J., Voeltz, G. K. ER contact sites define the position and timing of endosome fission. Cell. 159, 1027-1041 (2014).
  11. Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nat Cell Biol. 4, 691-698 (2002).
  12. Centonze Frohlich, V. Phase contrast and differential interference contrast (DIC) microscopy. J Vis Exp. , (2008).
  13. Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques--illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17, 14067-14090 (2012).
  14. Guan, Y., et al. Live-cell multiphoton fluorescence correlation spectroscopy with an improved large Stokes shift fluorescent protein. Mol Biol Cell. 26, 2054-2066 (2015).
  15. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
  16. Orth, J. D., et al. Analysis of mitosis and antimitotic drug responses in tumors by in vivo microscopy and single-cell pharmacodynamics. Cancer Res. 71, 4608-4616 (2011).
  17. Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. In vivo imaging of tumors. Cold Spring Harb Protoc. (5452), (2010).
  18. Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12, 577-585 (2015).
  19. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (50088), (2013).
  20. Orth, J. D., et al. Quantitative live imaging of cancer and normal cells treated with Kinesin-5 inhibitors indicates significant differences in phenotypic responses and cell fate. Mol Cancer Ther. 7, 3480-3489 (2008).
  21. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14, 111-122 (2008).
  22. Yang, R., Niepel, M., Mitchison, T. K., Sorger, P. K. Dissecting variability in responses to cancer chemotherapy through systems pharmacology. Clin Pharmacol Ther. 88, 34-38 (2010).
  23. Orth, J. D., McNiven, M. A. Get off my back! Rapid receptor internalization through circular dorsal ruffles. Cancer Res. 66, 11094-11096 (2006).
  24. Li, J., et al. Co-inhibition of polo-like kinase 1 and Aurora kinases promotes mitotic catastrophe. Oncotarget. 6, 9327-9340 (2015).
  25. Orth, J. D., Loewer, A., Lahav, G., Mitchison, T. J. Prolonged mitotic arrest triggers partial activation of apoptosis, resulting in DNA damage and p53 induction. Mol Biol Cell. 23, 567-576 (2012).
  26. Batchelor, E., Loewer, A., Mock, C., Lahav, G. Stimulus-dependent dynamics of p53 in single cells. Mol Syst Biol. 7 (488), (2011).
  27. Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
  28. Zhang, C. Z., Leibowitz, M. L., Pellman, D. Chromothripsis and beyond: rapid genome evolution from complex chromosomal rearrangements. Genes Dev. 27, 2513-2530 (2013).
  29. Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522, 179-184 (2015).
  30. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
  31. Neggers, J. E., et al. Identifying drug-target selectivity of small-molecule CRM1/XPO1 inhibitors by CRISPR/Cas9 genome editing. Chem Biol. 22, 107-116 (2015).
  32. Gravina, G. L., et al. XPO1/CRM1-Selective Inhibitors of Nuclear Export (SINE) reduce tumor spreading and improve overall survival in preclinical models of prostate cancer (PCa). Journal of hematology and oncology. 7 (46), (2014).
  33. Mendonca, J., et al. Selective inhibitors of nuclear export (SINE) as novel therapeutics for prostate cancer. Oncotarget. 5, 6102-6112 (2014).
  34. Marcus, J. M., Burke, R. T., DeSisto, J. A., Landesman, Y., Orth, J. D. Longitudinal tracking of single live cancer cells to understand cell cycle effects of the nuclear export inhibitor, selinexor. Scientific reports. 5, 14391(2015).
  35. Senapedis, W. T., Baloglu, E., Landesman, Y. Clinical translation of nuclear export inhibitors in cancer. Semin Cancer Biol. 27, 74-86 (2014).
  36. Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
  37. D'Arpa, P., Beardmore, C., Liu, L. F. Involvement of nucleic acid synthesis in cell killing mechanisms of topoisomerase poisons. Cancer Res. 50, 6919-6924 (1990).
  38. Palmitelli, M., de Campos-Nebel, M., Gonzalez-Cid, M. Progression of chromosomal damage induced by etoposide in G2 phase in a DNA-PKcs-deficient context. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. , (2015).
  39. Albeck, J. G., Burke, J. M., Spencer, S. L., Lauffenburger, D. A., Sorger, P. K. Modeling a snap-action, variable-delay switch controlling extrinsic cell death. PLoS biology. 6, 2831-2852 (2008).
  40. N'Diaye, E. N., et al. PLIC proteins or ubiquilins regulate autophagy-dependent cell survival during nutrient starvation. EMBO reports. 10, 173-179 (2009).
  41. Xu, J., Liu, Z. F., Wang, J., Deng, P., Jiang, Y. Study of localization and translocation of human high mobility group protein B1 in eukaryotic cells. Zhongguo wei zhong bing ji jiu yi xue = Chinese critical care medicine = Zhongguo weizhongbing jijiuyixue. 18, 338-341 (2006).
  42. Hoppe, G., Talcott, K. E., Bhattacharya, S. K., Crabb, J. W., Sears, J. E. Molecular basis for the redox control of nuclear transport of the structural chromatin protein Hmgb1. Exp Cell Res. 312, 3526-3538 (2006).
  43. Moshfegh, Y., Bravo-Cordero, J. J., Miskolci, V., Condeelis, J., Hodgson, L. A Trio-Rac1-Pak1 signalling axis drives invadopodia disassembly. Nat Cell Biol. 16, 574-586 (2014).
  44. Yu, X., Machesky, L. M. Cells assemble invadopodia-like structures and invade into matrigel in a matrix metalloprotease dependent manner in the circular invasion assay. PLoS One. 7 (e30605), (2012).
  45. Neumann, B., et al. Phenotypic profiling of the human genome by time-lapse microscopy reveals cell division genes. Nature. 464, 721-727 (2010).
  46. Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nat Cell Biol. 13, 371-381 (2011).
  47. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
  48. Wollman, R., Meyer, T. Coordinated oscillations in cortical actin and Ca2+ correlate with cycles of vesicle secretion. Nat Cell Biol. 14, 1261-1269 (2012).
  49. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society reviews. 38, 2887-2921 (2009).
  50. Kilgore, J. A., Dolman, N. J., Davidson, M. W., et al. A review of reagents for fluorescence microscopy of cellular compartments and structures, Part II: reagents for non-vesicular organelles. Current protocols in cytometry. Robinson, J. . P. aul 66, (2013).
  51. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  52. Shi, J., Zhou, Y., Huang, H. C., Mitchison, T. J. Navitoclax (ABT-263) accelerates apoptosis during drug-induced mitotic arrest by antagonizing Bcl-xL. Cancer Res. 71, 4518-4526 (2011).
  53. Tan, N., et al. Navitoclax enhances the efficacy of taxanes in non-small cell lung cancer models. Clin Cancer Res. 17, 1394-1404 (2011).
  54. Ramapathiran, L., et al. Single-cell imaging of the heat-shock response in colon cancer cells suggests that magnitude and length rather than time of onset determines resistance to apoptosis. J Cell Sci. 127, 609-619 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Time lapse MicroscopySingle Cell TrackingAnti cancer TherapeuticsHT1080 CellsEnvironmental ChamberFluorescent BiosensorsCell Growth AnalysisChromosome DynamicsDNA DamageCell Death

İlgili makaleler