Epitelden mezenkimal geçişe (EMT) kanserlerin invaziv hale gelmesine izin verir. EMT'yi araştırmak için, serum ve enzimlerden yoksun bir nöral kök hücre (NSC) tabanlı in vitro model tanımlanmıştır. Bu standartlaştırılmış sistem, hücre göçünün, gen ve protein ekspresyonunun kantitatif ve kalitatif değerlendirmesine izin verir. Model, ilaç keşfi için uygundur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Ilaç keşfi için uygundur EMT araştırma için enzim ve serum içermeyen nöral kök hücre kültürü modeli
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
mezenkimal geçiş (EMT) için epitel epitel mezenşimin içine transdifferentiating işlemi anlatılmaktadır. EMT da yaygın, glioblastoma en sık malign beyin tümörü meydana embriyonik gelişim sırasında temel bir süreçtir. EMT, aynı zamanda, göğüs kanseri, akciğer kanseri, kolon kanseri, mide kanseri de dahil olmak üzere beyin dışında çok karsinom gözlenmiştir. EMT merkezi göç, işgali ve metastaz oluşumunu teşvik ederek malignite bağlantılıdır. EMT indüksiyon mekanizmaları tam olarak anlaşılmış değildir. Burada kortikal nöral kök hücre (NSC'lerde) ve daha sonra EMT indüksiyonu standart izolasyonu için in vitro bir sistem tarif eder. Bu sistem tek hücreler veya eksplant kültürü ya da kullanmak için esneklik sağlar. Bu sistemde, sıçan veya fare embriyonik ön beyin NSC'lerde, tanımlanmış bir ortam içinde kültürlenmiş ve serum enzimlerin yoksundur. NSC'lerde oligodendrositlerin gözlenen olig2 ve Sox10 iki transkripsiyon faktörleri olarak ifadeYTE ön-madde hücreleri (OPC). Bu sistemi kullanarak, FGF-, BMP- arasındaki etkileşimler Zeb1, Zeb2 içeren TGFβ-sinyal ve Twist2 TGFβ etkinleştirme önemli ölçüde sinerjistik BMP- / TGFβ-etkileşim olduğunu, hücre göçü geliştirilmiş burada gözlenmiştir. Sonuçlar EMT indüksiyonu ve bakım dahil olmak FGF-, BMP- ve TGFβ-sinyal ağı işaret eder. Bu model sistemi, in vitro EMT araştırmak için uygundur. Bu düşük maliyetli ve yüksek tekrarlanabilirlik göstermektedir. Ayrıca, göç yanıtlara göre (kantitatif mesafe ölçümü) ve inhibe etmek veya EMT (kalitatif ölçümü) geliştirmek için bileşikler yüksek verimli tarama ile farklı bileşiklerin karşılaştırılmasına imkan verir. modeli bu nedenle de EMT etkileyen maddeler için ilaç kütüphaneleri test etmek için uygundur.
Giriş
Embriyonik gelişme birkaç aşamalarında, epitel hücreleri birbirine (örneğin, sıkı kavşaklar) için güçlü bağlılığı kaybeder ve mezenkimal geçiş (EMT) 1 bir süreç olarak adlandırılan epitel bir göçmen fenotip kazanır. EMT gibi mezenkimal nöral tepe hücreleri gibi ek hücre tiplerinin oluşumu neuroepithelium 2 ayıran bir popülasyon için gereklidir. EMT evrelerinde sadece gerekli değil, aynı zamanda lezyonlar 4 demiyelinizan böyle yara iyileşmesi 3 ve merkezi sinir sistemi (MSS) rejenerasyon olarak yetişkin organizmada fizyolojik süreçleri, korumak için yetişkin hayatının ileriki aşamalarında gerekli değildir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan prosedürleri 'Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu' (NIH yayın, 8 th edition, 2011) izledi ve Basel Hayvan Refahı Komitesi (Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için İsviçre Kuralları) tarafından onaylanmıştır. bu kurallara hayvan protokolü "düşük hayvan şiddeti notu" olarak kabul edilir.
Genişletme maddesi hazırlanması 1.
Not: Doku kültürü için standart olarak aseptik koşullarda çalışmak.
- İki adet 15 ml tüpler alın ve 5 L-glutamin içermeyen DMEM / F12 ilave edin (1: 1) 500 ml'lik ortam şişe içine iki adet 15 ml tüpler her biri. İlk 15 ml tüp, 50 mg, insan apo-transferrin, putreskin 1 M stok (0.1 ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu EMT model sistem olarak tek hücre ya da gelişmekte olan sinir tüpün belirli bir bölgeden eksplant olarak iki NSC'lerde standart izolasyonuna dayanmaktadır, merkezi korteks (Şekiller 1 ve 2). Nicel değerlendirmesi için, eksplantlar 500 mikron ızgara kültürü çanak (Şekil 3) merkezinde hakkı ekildi. Merkezi korteksten eksplantlar ilk büyüme faktörleri (Tablo 1) farklı kombinasyonları ilave iki gün sonra iki gün FGF2&.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
EMT analizi kullanan NSC'lerde için standart bir sistem tarif edilmektedir Bu çalışmada, (Ek Şekil 3'te özetlenmiştir). Standardizasyon tekrarlanabilirliği (Tablo 1 ve 2) sağlamaktadır. NSC'lerde gelişmekte korteksinden normal EMT uğramayan bir doku elde edilir. Bu EMT erken aşamada analizi için avantajlıdır. EMT içinde ilk adımlar yeterli genetik değişiklikler birikmiş ve zaten EMT özelliklerini benimsemiş olabilir tümör hücrelerinde okudu edilemez. Ayrıca, primer tümör örn.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Çalışma MHS ve AG (SNF IZLIZ3_157230) bir hibe ile Basel Bilim Vakfı Üniversitesi ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir. Biz teşekkür ederiz: Dr. Tania Rinaldi Burkat cömertçe altyapının sağlanması için; tartışmalar ve yorumlar için Bettler grubun tüm üyeleri. Biz Gerhard Dorne (Leica Microsystems, İsviçre) Full HD MC170 video kamera profesyonel ve yetkin montaj için (Leica Microsystems, İsviçre) teşekkür ederim.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| BMP4, rhBMP4 | RnD Sistemleri | 314-BP-01M | |
| Sığır pankreas insülini | Sigma | I1882 | |
| Boyden odası, CytoSelect hücre istilası testi | Cell Biolabs | CBA-110 | 24 oyuklu plaka sistemi |
| Izgaralı hücre kültürü kabı | Ibidi 500 mm çanak, 35 mm | 80156 | |
| CellMask Orange | Life Technologies | C10045 | Plazma membran boyası, 1:1.000'de kullanın. |
| DAPI | LifeTechnologies | D1306 | 5 mg / ml'de stok. 1: 10.000'de kullanın. Kanserojen. Uygun koruma (eldiven, mont, gözlük) gereklidir. |
| DMEM / F12 1: 1 orta boy şişe | Gibco Invitrogen | 21331-020 | |
| FGF2, rhFGF2 | RnD Sistemleri | 233-FB-01M | |
| Fibronektin, sığır | Sigma ve nbsp; | F4759 | |
| Glutamax takviyesi | Gibco Invitrogen | 35050-061 | |
| Piksel ölçüm özelliğine sahip grafik yazılımı | Fiji | fiji.sc/Fiji | sürüm 2.0.0-rc-30/1.49s |
| HBSS media | Sigma | H9394 | |
| İnsan apo-Transferrin | Sigma | T1147 | Olası akciğer tahriş edici. Solumaktan kaçının. Uygun koruma kullanın. |
| L-glutamin | Gibco Invitrogen | 25030-024 | |
| Nestin, Fare anti Nestin antikoru | Genetex | GTX26142 | 1:100'de kullanım, %4 PFA fiksasyonu, Triton X100 %0.1 |
| Olig2'de, Tavşan anti Olig2 antikoru | Hirohide Takebayash tarafından sağlanmıştır | Kişisel stok | 1: 2.000,% 4 PFA fiksasyonunda, Triton X100'de% 0.1'de kullanın |
| Penisilin / Streptomisin / Fungizone | Gibco Invitrogen | 15240-062 | |
| Podoplanin, Fare anti Podoplanin antikoru | Acris | DM3614P | 1:250,% 4 PFA fiksasyonunda kullanın, Triton X100 |
| Poly-L-ornitin | Sigma'dan | P3655 | |
| Putresin | Sigma | P5780 | Cildi ve gözü tahriş eder. Uygun koruma gereklidir. |
| Sodyum selenit | Sigma | S5261 | |
| Sox10, Tavşan anti Sox10 antikoru | Millipore Chemicon | AB5774 | 1:200'de, %4 PFA fiksasyonunda kullanın, Triton X100 %0.1'de |
| TGFb1, rhTGFb1 | RnD Sistemleri | 240-B-010 | |
| Kaplamasız Petri kapları | Falcon Corning | 351029 |
Kaynaklar
- Nieto, M. A. Epithelial-Mesenchymal Transitions in development and disease: old views and new perspectives. Int J Dev Biol. 53, 1541-1547 (2009).
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
