Yöntem makalesi

Tümör mikroçevresinde Gerçek zamanlı Multisellüler Dynamics Genişletilmiş Time-lapse intravital Görüntüleme

7.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54042

⸱

12 Haziran 2016

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy & Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Radiology, Albert Einstein College of Medicine, 3Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine, 4Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine

Bu makalede

Özet

Bu protokol, tek bir hücre çözünürlükte in vivo olarak, gerçek zamanlı olarak çok-etkileşimlerin uzatılmış zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için multiphoton mikroskobu kullanımını tarif eder.

Özet

Tümör mikroçevresinde, konakçı stromal hücreler, tümör ilerlemesini, anjiyogenezini, tümör hücresi yayılımını ve metastazı teşvik etmek için tümör hücreleri ile etkileşime girer. Tümör mikroçevresindeki çok hücreli etkileşimler, yönlü tümör hücresi motilitesi ve vasküler geçirgenlik dahil olmak üzere geçici olaylara yol açabilir. Tümör vasküler geçirgenliğinin ölçülmesi, vasküler boyaların ekstravazasyonunu ölçmek için sıklıkla kullanılan son nokta deneylerine sahiptir. Bununla birlikte, çok hücreli etkileşimlerin geçici doğası ve vasküler geçirgenlik nedeniyle, bu dinamik olayların kinetiği ayırt edilemez. Hücreleri ve damar sistemini enjekte edilebilir boyalar veya floresan proteinlerle etiketleyerek, yüksek çözünürlüklü hızlandırılmış intravital mikroskopi, tümör mikroçevresindeki geçici olayların doğrudan, gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine izin vermiştir. Burada, tümör mikroçevresindeki çok hücreli dinamikleri doğrudan görselleştirmek için canlı farelerde genişletilmiş intravital görüntüleme gerçekleştirmek için çoklu foton mikroskobu kullanmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, hücresel etiketleme stratejilerini, bir meme derisi flebinin cerrahi hazırlığını, enjekte edilebilir boyaların veya proteinlerin kuyruk ven kateteri ile uygulanmasını ve hızlandırılmış görüntülerin elde edilmesini detaylandırır. Bu yöntemden elde edilen hızlandırılmış sekanslar, tümör mikroçevresindeki hücresel motilite ve vasküler geçirgenlik olaylarının kinetiğinin görselleştirilmesini ve niceliklendirilmesini kolaylaştırır.

Giriş

primer meme tümörü tümör hücrelerinin yayılması makrofajlar ve endotel hücreleri dahil olmak üzere stromal hücreler sadece tümör hücrelerini içerir, ancak ana bilgisayar gösterilmiştir. Bundan başka, tümör damar sistemi artan geçirgenliği 1 anormaldir. Bu durumda, tümör hücreleri, makrofajlar ve endotelial hücreler, primer tümör mikro-vasküler geçirgenliği ve tümör hücre intravasation aracılık etkileşim belirleyen anlaşılması metastaz için önemlidir. damar geçirgenliği, tümör hücre intravazasyonunda ve tümör mikroçevresinde çok hücreli etkileşimler altında yatan sinyal mekanizmasının kinetik anlama anti-kanser tedavilerinin geliştirilmesine ve yönetiminde önemli bilgiler sağlayabilir.

In vivo olarak tümör damar geçirgenliğini incelemek birincil yöntemi Evans Mavi 2, yüksek molekül ağırlıklı dekstranlar (155 kDa) halinde ekstravasküler boyalar ölçülmesi olmuşturBoyanın enjeksiyonundan sonra sabit bir zaman noktalarında 3 ve florofor ya da (albümin dahil) Radyoaktif-konjüge proteinler 4. Mikroskopi Gelişmeler, hayvan modelleri ve floresan boyalar intravital mikroskobiyle 5 boyunca hücresel süreçleri ve canlı hayvan vasküler geçirgenliğin görselleştirme sağlamıştır.

Birkaç kez puan üzerinden statik görüntülerin, ya da kısa time-lapse dizilerinin satın alarak Canlı hayvan görüntüleme tümörün mikro 6,7 dinamik olayların anlaşılması için izin vermez. Nitekim, 24 saat boyunca statik bir görüntü elde etme tümör damar ancak damar geçirgenliği dinamikleri 6 gözlenmemiştir, sızdıran olduğunu göstermiştir. Böylece, 12 saate kadar uzatılmış sürekli time-lapse görüntüleme tümör mikroçevresinde dinamik olayların kinetik yakalar.

Bu protokol, uzun bir zaman atlamalı multiphot kullanımını tarif ederintravital mikroskopi tümör mikro-dinamik çok hücreli olayları incelemek için. tümör mikroçevresinde birden fazla hücre tipleri enjekte edilebilir boyalarla veya floresan proteinleri ifade transgenik hayvanlar kullanılarak etiketlenir. vasküler boyalar veya proteinler görüntüleme başladıktan sonra enjekte edilebilir bir kuyruk damarından sonda kullanılarak tümör mikro çok hücreli olayların kinetik veriler elde etmek için. canlı hücre görüntüleme için meme tümörü deri bir kapakla cerrahi hazırlık aracılığıyla maruz kalmaktadır. Görüntüler birden photomultiplier tüpler (PMT) dedektörleri 8 ile donatılmış bir multiphoton mikroskop kullanarak 12 saate kadar için edinilir. Uygun filtreleri kullanarak, bir çıkarma algoritması tümörün mikro aynı anda 9 5 floresan sinyalleri elde etmek 4 PMT dedektörleri sağlar. Yüksek çözünürlüklü multiphoton İntra vital mikroskopik daha iyi bir yol, tümörün mikro tümör stromanın etkileşimleri, tek bir hücre çözünürlüklü görüntü yakalar Uvasküler geçirgenlik ve tümör hücre intravasation 10-13 nderstanding. Spesifik olarak, bir tümör hücresi, bir makrofaj ve endotel hücre arasındaki etkileşimi bölgelerde seçici meydana genişletilmiş intravital görüntüleme ortaya yüksek derecede lokalize edilen, geçici vasküler geçirgenlik etkinlik 13 (metastaz, TMEM 14 tümör mikro-olarak tanımlanmıştır). Bundan başka, tümör hücre intravasation, sadece TMEM gerçekleşir ve uzamsal ve geçici olarak vasküler geçirgenliği 13 ile ilişkilidir. Bu olayların dinamiklerinin tek hücreli çözünürlükte tümör mikroçevresinde floresan işaretli hücrelerin uzun time-lapse multiphoton mikroskobu kullanımı ile mümkün olmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

açıklanan tüm işlemler Tıp Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Albert Einstein College of tarafından önceden onay da dahil olmak üzere omurgalı hayvanların kullanımı için kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapılmalıdır.

1. Getirici floresanla işaretlenmiş tümörler ve tümör bağlantılı makrofajlar

  1. Gelişmiş yeşil floresan fare meme tümörü virüsü uzun terminal tekrarı, yani fluoresan muhabir [transgenik fareler polioma orta T antijenini (MMTV PyMT) tahrik kendiliğinden, yerli, genetik olarak fare meme kanseri modeli geçerek floresan etiketli tümör hücrelerinin oluşturmak protein (EGFP), geliştirilmiş mavi floresan proteinin (ECFP) ya da Dendra2] 8,9.
  2. PyMT hayvanlarda floresan etiket makrofajlar ile floresan [yani, MacGr myeloid- ve makrofaj spesifik floresan gazetecilere genetiği fare modelleri geçerek tümör hücrelerinin etiketlieen 15 veya MacBlue farenin CSF1R -GAL4VP16 / UAS ECFP 16].
  3. Seçenek olarak ise, floresan floresan etiketli PyMT tümör hücreleri (singeneik), insan meme kanseri hücre soyları ya da primer insan hastaya türevli tümörlerde (ksenogrefleri) 11,17 ortotopik transplantasyon ile tümörlerinin, etiketli oluşturur.
    1. İmplant floresan floresan etiketli tümör hücreleri ve miyeloid hücreler 13 hayvanlar oluşturmak için floresan protein etiketli miyeloid hücreler ile singeneik farelere PyMT tümör hücrelerini etiketli.
  4. başlangıç ​​2 saat önce floresan etiket makrofajlara insan hücre çizgileri ve hasta türetilmiş primer tümörlerin ksenograft tümör ağır birleşik bağışıklık eksikliği (SCID) farelere 10 mg damar içi (IV) kuyruk damarı / kg floresan 70 kDa dekstran 100 ul enjekte intravital görüntüleme.

2. Mikroskop Kurulum ve Görüntüleme Hazırlık

Not: Bu yordam set-up açıklarBir multiphoton mikroskop 8 intravital görüntüleme için.

  1. iki foton lazerler ve dedektörler de dahil olmak üzere tüm mikroskop ve lazer bileşenleri açın.
  2. sahne öncesi ısınmak için 30 ° C, ısıtma kutusunu açın. Bu adım, bir hayvan fizyolojik ısısını muhafaza etmek için kritiktir.
  3. ters bir mikroskop yerinde mikroskop sahnede ısmarlama sahne uç ile kullanım içindir. Özel uç görüntüleme için merkezi delikten geçen çapı "sahne ekleme uzayda ve 1 ile uyacak şekilde işlenmiş kalın alüminyum" 1/8 bir sayfadır.
    1. % 70 etanol ve kuru hava ile mikroskop sahne ve sahne parçasını silin.
    2. cam kapak ile optik temas sağlamak için 20X, 1.05 NA mikroskop objektif su büyük damla yerleştirin.
    3. mikroskop sahne uç üzerindeki görüntüleme portu üzerinden yer cam kapak (# 1.5 kalınlık). laboratuar bant ile yerde sabitleyin.
    4. 2 cm x 2 cm delik yumruk bir delik yumruk kullanınve esnek bir lastik pedi özel sahne eki delik ile uyumlu pad deliği mikroskop sahnede lastik pedi yerleştirin.

Görüntüleme sırasında Enjeksiyon için 3. Kuyruk Ven Kateterine hazırlanması ve Reaktifler

  1. polietilen (PE) tüp içinde 30 cm uzunluğunda kesilir.
  2. plastik montaj kopana kadar forseps kullanarak, ileri ve geri bir 31 G iğne metal iğne taşımak.
  3. forseps kullanarak, PE boru içine müstakil iğnenin künt ucunu.
  4. PE boru diğer ucunu bir 31 G iğne takın.
  5. steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile 1 cc şırınga doldurun ve 31 G iğne takın ve PBS ile tüp ve iğne bütün havayı temizlemek. PBS hidrasyon ve kan ozmolarite 9,18 muhafaza etmek için kullanılır, bununla birlikte izotonik tuz da kullanılabilir.
  6. 3 mg, 200 ul 1 cc şırınga doldurmak / 155 kDa dekstran-tetrametilrodamin (TMR kg) Veya vasküler etiketleme için kuantum noktaları.
  7. Bu buz üzerinde 1 cc şırınga ve yerine vasküler endotelyal büyüme faktörü A (VEGFA 165) içindeki bir 165 amino asit izoformunu gibi diğer enjekte edilebilir proteinleri hazırlayın. 0.05 mg / ml'lik bir konsantrasyonda 0.2 mg / kg VEGFA 165 19 enjekte edilir.

Kalıcı Tail Ven Kateter 4. yerleştirilmesi

  1. Taşıyıcı gaz olarak O 2 ile% 5 izofluran ile bir indüksiyon odasını kullanarak anestezi altında hayvan yerleştirin.
  2. tam anestezi ve bir ayak tutam yanıt vermiyor kez ameliyat platforma fare aktarın.
  3. Cerrahi platforma Açık izofluran anestezi hattı, indüksiyon odasına anestezi hattını kapatın ve hayvanın burnu üzerine burun konisi yerleştirin. 2.5% 5 ile% den izofluran azaltın.
  4. anestezi sırasında kurumasını önlemek için fare gözleri oftalmik merhem sürün.
  5. ısıtma lambası altında hayvan ısıtınEk 2 dk kuyruk dolaşımını artırmak için sirkülasyon derin anestezi ile yavaşlatır olarak.
  6. % 70 etanol ile fare kuyruğu ven sterilize edin.
  7. hayvanın yan kuyruk damar içine Bölüm 3 inşa kateter 31 G iğne ucu yerleştirin ve 2-3 mm iğne itin.
  8. kuyruk damarından yerleştirilir kateter sağlanması, kan görmek şırınga geri çekin.
  9. kuyruk uzunluğu boyunca damar yer paralel iğne tutma iğne üzerine yerleştirilen laboratuvar bant 1 cm uzunluğu kullanın.

5. Cilt Kapak Cerrahi Prosedür Meme Tümör Açığa

  1. ameliyat işlemine hayvan tümörü ve% 70 etanol ile ventral yüzeyi bez. Not: tarif edildiği gibi, bu işlem tam aseptik gerçekleştirilmez. enfeksiyon karıştırıcı bir faktör haline gelebilir uzun görüntüleme oturumları için, uygun aseptik teknik kullanılması tavsiye edilir.
  2. Steri kullanmaSteril makas ventral orta hat uzunluğu yaklaşık 1 cm boyunca bir cilt altı kesi yapmak ile le forseps, ventral cilt kaldırın. insizyon sırasında periton delinmesiyle kaçının.
  3. Yavaşça meme tümörü açığa çıkarmak üzere periton meme bezi ve tümör bağlama bağ dokusu kesti.
  4. yavaşça çıkarın ve tümör damar bütünlüğünü korumak ve kanama en aza indirirken tümörün maruz yüzeyinden fasya ve yağ kesip, makas ve forseps kullanma. Bu adım tümörün tümör mimarisi ve damar kaynağı sağlamada önemlidir.

Mikroskopi 6. Hayvan hazırlanması

  1. görüntüleme için mikroskop objektif üzerine sahne insert üzerine lamel üzerine yerleştirilir maruz tümör ile önceden ısıtılmış görüntüleme aşamasına hayvan aktarın. İğneyi çıkarmak için değil, böylece hayvan ile hafifçe kuyruk ven kateteri aktarmak için özen gösterin.
  2. Yeri inciHayvanın burnu üzerinden e anestezi burun konisi% 3 izofluran anestezi seti korumak için.
  3. Tümör kauçuk ped deliğe aittir ve cam lamel ile temas eder, böylece hayvan yerleştirin.
  4. yavaşça yerine tümör tutun ve görüntü alımı sırasında hareketi azaltmak için laboratuvar bant ile mikroskop sahneye bunları düzeltmek için iki lastik pedleri kullanmayın.
  5. hidratlı doku tutmak ve lamel ile optik temas sağlamak için PBS ile lastik pedi odasına doldurun.
  6. Bir pulse oksimetre probu ile hayvanın hayati belirtilerini izlemek başlayın. hayvan uyluk bir klip sensörünü takın. Seçenek olarak boyun çevresine uyacak şekilde yapılandırılmış bir yaka kullanılabilir.
  7. 30 ° C 20 korumak için hayvan üzerinde ısıtma kutusu yerleştirin.
  8. Yavaş yavaş anestezi korumak ve kan akışını korumak için 0.5-1% izofluran düzeyini azaltır.

7. Görüntü Alma ve Fluoresc Enjeksiyonent Boyalar ve Enjekte Proteinler

  1. Tümörün yüzeyinde floresan tümör hücreleri üzerinde mikroskop mercek odak kullanma.
  2. kan damarlarını akan alanları bularak ilgi alanı seçin. akan kan damarları ile ilgi alanının seçimi tümör damarsal değerlendirmek için kritik öneme sahiptir.
  3. ilgi bir bölge seçildikten sonra multiphoton görüntüleme moduna mikroskop geçin.
  4. z-serisi üst ve alt limitlerini ayarlayın. istediğiniz başlangıç ​​konumuna hedefi taşımak için odak ayarlayıcısı kullanarak ve Z konumu "Üst" butonuna tıklayarak z serinin üst sınırını ayarlayın. ikinci harmonik üretimi (SHG) kanal tümör yüzeyindeki kolajen lif şebekesi görselleştirilmesi ve hiçbir hücre sadece kolajen lifleri görünür olduğunda gözlemleyerek z serisinin üst sınırını belirleyin.
    1. (Typica istenen görüntüleme derinliğe kadar objektif hareket ettirerek z serisinin alt sınırını ayarlayınLly 50-150 mikron) ve Z konumu tıklayarak "Alt" tuşuna basınız.
    2. adım büyüklüğü alanına istediğiniz değeri yazarak adım boyutunu ayarlayın. çözünürlük ve satın alma süre hususlara dayalı adım boyutunu belirlemek (genellikle 2 mikron yüksek çözünürlüklü 3 boyutlu rekonstrüksiyon için kullanılan ve 5 mikron aksi bir).
  5. Time-Lapse alanına istenilen hızlandırılmış zamanı Time-Lapse paneline geçiş ve girerek time-lapse aralığını ayarlayın. Optimal zamansal çözünürlük için sürekli görüntüleme için 0 sn için zaman aralığını ayarlayabilirsiniz. Not: Uzun time-lapse görüntüleme için objektif daldırma sıvı doldurmak için satın almalar arasında 10 sn zaman aralığını ayarlamak için tavsiye edilir.
  6. görüntüleme için parametreler belirlenmiştir edildikten sonra, yavaş yavaş 155 kDa dekstran-TMR enjekte edilir.
    1. Kuyruk ven kateteri PBS ile şırınga çıkarın ve li içine herhangi bir kabarcıklar tanıtmak için 155 kDa dekstran-TMR özen içeren şırınga ile değiştirinne.
    2. Yavaş yavaş 200 ul maksimum hacmi ile, fare içine 155 kDa dekstran-TMR enjekte ve şırınga PBS içeren şırınga değiştirin. KRİTİK ADIM: yavaş yavaş enjeksiyon yapın ve ven dışında çözüm almamak için önlem alın.
  7. Kayıt butonuna tıklayarak daha sonra bunları bastırmak için Z-Stack ve Time-Lapse düğmeleriyle tarafından Z-yığın time-lapse görüntüleme edinilmesini başlatın.
  8. Diğer floresan dekstranlar, örneğin, 10 kDa dekstran-floresin izotiyosiyanat (FITC), veya proteinler, örneğin, VEGFA 165, önceden hazırlanmış ise, 0 = en az bir başlangıç ​​için görüntü elde başladıktan sonra bunları enjekte edilir.
    1. Kuyruk ven kateteri PBS ile şırınga çıkarın ve hattına herhangi bir kabarcıklar tanıtmak için 10 kDa dekstran-FITC veya VEGFA 165 özen içeren şırınga ile değiştirin.
    2. Yavaşça kuyruk ven kateter yoluyla fare içine enjekte edilebilir enjekteve PBS ihtiva eden bir şırınga ile bir şırınga değiştirin.
  9. Her 30-45 dk, yavaş yavaş hayvanın hidrasyon korumak için PBS veya serum fizyolojik 50 ul enjekte edilir.

8. Ötenazi

  1. görüntü alımı bitiminde, hayvan euthanize.
    1. % 5 izofluran artırın.
    2. nefes ve sahne hayvan kaldırmak çözüldükten sonra 30 saniye kadar% 5 izofluran altında hayvan tutun.
    3. tam ötenazi sağlamak için servikal dislokasyon gerçekleştirin.

9. Görüntü İşleme

  1. her zaman bir noktada her kanal için 16 bit TIFF dosyalar görüntüleri kazanmak ve sırayla kaydedin.
  2. Spektral örtüşme (yani, GFP ve OBP), xy sürüklenme ortadan kaldırılması ve ImageJ 9 kurulan yöntemler kullanılarak time-lapse dizilerinden film nesil ayrılmasını gerçekleştirin. Yüksek çözünürlüklü görüntüler 13 3D yüzey rekonstrüksiyon gerçekleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Genişletilmiş zaman atlamalı intravital mikroskopi tümör mikroçevresinde çok hücreli süreçlerin tek bir hücre çözünürlükte görüntüleme sağlıyor. floresan etiketleme tümör hücreleri, makrofajlar, vasküler alan, ikinci harmonik oluşumu sinyali kullanılarak kolajen lif şebekesi görselleştirerek, tümörün mikro birden fazla bölme aynı zamanda görüntüleme sırasında izlenir. Dendra2 (Şekil 1A) ile etiketlenmiş meme tümörü hücreleri, MMTV PyMT-Dendra2 farelerde yapıldığı gibi fl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

tümör mikroçevresinde kendiliğinden meydana gelen hücresel etkileşimler, tümör hücre hareketliliği ve intravasation değişikliklere yol açabilir. Canlı tümör dokusunun yüksek çözünürlüklü intravital görüntüleme son derece geçici 10,13,24 olabilir çok hücreli dinamikleri görselleştirme izin verir. Tümörün mikro süreçlerin moleküler mekanizmaları hakkında gerekli bilgi verebilir ayrık zamanlı noktaları ile elde edilen in vivo deneylerde veya time-lapse görüntüleri uç noktası. Intravital görüntü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu araştırma ödül sayısı (ASH, W81XWH-13-1-0010) kapsamında Savunma Bakanlığı Meme Kanseri Araştırma Programı, NIH CA100324, PPG CA100324 ve Entegre Görüntüleme Programı tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
155 kDa dekstran-tetrametilrodamin izotiyosiyanatSigma AldrichT12871x PBS'de 20 mg / ml'de sulandırılır
70 kDa dekstran-Texas RedLife TechnologiesD-18301x PBS'de 10 mg / ml'de sulandırılır 10
kDa dekstran-floresein izotiyosiyanatSigma AldrichFD10S,1x PBS'de 20 mg / ml'de sulandırılır
Qdot 705 ITK Amino (PEG) Kuantum Noktaları Ömrü Seyreltik 25 & # 956 Q21561MP Teknolojiler; 175 μ'da L; l enjeksiyon için 1x
PBS MMTV-PyMT farelerJackson Laboratuvarı2374
Csf1r-ECFP fareleri (Csf1r-Gal4 / VP16, UAS-ECFP)Jackson Laboratuvarı26051
Csf1r-EGFP fareleriJackson Laboratuvarı18549
1x PBSYaşam Teknolojileri
İzolezi (izofluran)Henry Schein Hayvan Sağlığı50033250 ml
OxygenAirTech
1 ml şırınga, tüberkülin kayma ucuBD309659
30 G x 1 (0,3 mm x 25  mm) iğneBD305128
Polietilen mikro tıbbi boru & nbsp;Scientific Commodities IncBB31695-PE / 10,28 mm İç Çap x 0,64 mm Dış Çap
Mikroskop kapak camıCorning2980-225kalınlık 1.5, 22 x 50  mm
PhysioSuite MouseSTAT nabız oksimetresi, yazılım ve sensörlerKent Scientific
Laboratuvar bandıFisher Scientific159015R
yumuşak kauçuk pedMcMaster-Carr8514K62Ultra Yumuşak Poliüretan Film, 3/16" Kalın, 12 "x 12", 40 Oo Durometre, Düz Arka
sert lastik pedMcMaster-Carr8568K615Yüksek Mukavemetli Neopren Kauçuk Levha 1/4 "Kalınlık, 12" x 12", 50  Bir Durometre
MikroskobuOlympusMikroskop, 20X 1.05NA objektif lensi kullanan bir Olympus IX-71 standına dayanan özel olarak üretilmiş iki lazerli multifoton mikroskobudur.
7-Zımba setiMcMaster-Carr3429A121/4" ila 1" Delik Çapı, Çekiç Tahrikli Delgeç için
, ,

Kaynaklar

  1. Gerlowski, L. E., Jain, R. K. Microvascular permeability of normal and neoplastic tissues. Microvasc Res. 31 (3), 288-305 (1986).
  2. Wang, H. -L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, (2014).
  3. Dvorak, H. F. Rous-Whipple Award Lecture. How tumors make bad blood vessels and stroma. Am J Pathol. 162 (6), 1747-1757 (2003).
  4. Nagy, J. A., et al. Permeability properties of tumor surrogate blood vessels induced by VEGF-A. Lab Invest. 86 (8), 767-780 (2006).
  5. Egawa, G., et al. Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy. Sci Rep. 3, (2013).
  6. Yuan, F., et al. Vascular permeability in a human tumor xenograft: molecular size dependence and cutoff size. Cancer Res. 55 (17), 3752-3756 (1995).
  7. Dellian, M., Yuan, F., Trubetskoy, V. S., Torchilin, V. P., Jain, R. K. Vascular permeability in a human tumour xenograft: molecular charge dependence. Br J Cancer. 82 (9), 1513-1518 (2000).
  8. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  9. Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. 19, (2013).
  10. Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo. cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294(2013).
  11. Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995(2014).
  12. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. J Cell Sci. 13, 2120-2131 (2011).
  13. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA). Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
  14. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15, 2433-2441 (2009).
  15. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  16. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukcocyte Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
  17. Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
  18. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (73), (2013).
  19. Weis, S., Cui, J., Barnes, L., Cheresh, D. Endothelial barrier disruption by VEGF-mediated Src activity potentiates tumor cell extravasation and metastasis. J Cell Biol. 167 (2), 223-229 (2004).
  20. Wyckoff, J., Gligorijevic, B., Entenberg, D., Segall, J., Condeelis, J. High-Resolution Multiphoton Imaging of Tumors. In Vivo. Cold Spring Harb Protoc. (10), (2011).
  21. Lathia, J. D., et al. Direct in vivo. evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6 (9), e24807(2011).
  22. Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
  23. Dreher, M. R., et al. Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers. J Natl Cancer Inst. 98 (5), 335-344 (2006).
  24. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  25. Chittajallu, D. R., et al. In vivo. cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).
  26. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  27. Yano, S., et al. Spatial-temporal FUCCI imaging of each cell in a tumor demonstrates locational dependence of cell cycle dynamics and chemoresponsiveness. Cell Cycle. 13 (13), 2110-2119 (2014).
  28. Yang, M., Jiang, P., Hoffman, R. M. Whole-body subcellular multicolor imaging of tumor-host interaction and drug response in real time. Cancer Res. 67 (11), 5195-5200 (2007).
  29. Manning, C. S., et al. Intravital imaging reveals conversion between distinct tumor vascular morphologies and localized vascular response to Sunitinib. Intravital. 2 (1), 24790(2013).
  30. Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model. Histochem Cell Biol. 130 (6), 1147-1154 (2008).
  31. Brown, E. B., et al. In vivo. measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nat Med. 7 (7), 864-868 (2001).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

ok Fotonlu MikroskopiVask ler Ge irgenlikZaman Atlamal G r nt lemeH cresel aretlemeMeme Deri FlabDekstran EkstravazasyonuKuantum Noktas aretleme

İlgili makaleler