Yöntem makalesi

Farklılaşma Fates Mekansal Organizasyonu Probing İnsan pluripotent kök hücrelerin Stencil micropatterning

DOI:

10.3791/54097

⸱

17 Haziran 2016

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 2Singapore Institute of Neurotechnology (SINAPSE), National University of Singapore

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) farklılaştırmak ve farklı doku kalıpları içine kendini organize içsel yeteneği var; Bu mekansal çevre geçişlerini sunulmasını gerektirir rağmen. Biz hPSC farklılaşma desenleri kontrol etmek için biyokimyasal ve mekanik geçişlerini oluşturmak için basit ve sağlam bir yöntem olarak şablon micropatterning sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embriyonik kök hücreler ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler dahil olmak üzere insan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler), üç germ katmanına da farklılaşma yeteneğine sahiptir. Bu, onları rejeneratif tıp ve normal ve hastalıklı organogenezin deneysel modellemesi için çekici bir hücre kaynağı yapar. Bununla birlikte, hPSC'lerin in vitro farklılaşması heterojendir ve mekansal olarak düzensizdir. Hücre mikro modelleme teknolojileri, potansiyel olarak kök hücre mikro ortamlarını mekansal olarak kontrol etmek ve ortaya çıkan farklılaşma kaderlerini düzenlemek için araçlar sunar. Mikro modelleme hPSC'lerinin, hPSC'nin hayatta kalması ve bakımı için katı gereksinimleri dikkate alması gerekir. Burada, şablon mikro modellemeyi hPSC'lerle son derece uyumlu bir yöntem olarak tanımlıyoruz. hPSC mikro desenleri, hPSC'lerin alttaki hücre dışı matris kaplı substrata erişebileceği ve bağlanabileceği konumları fiziksel olarak sınırlayan hücre şablonu geçiş deliklerinin geometrileri ile belirtilir. Bu çalışma modu nedeniyle, diğer hücre mikro modelleme yöntemlerine kıyasla hPSC'leri yeterince destekleyebilen substratları kullanma konusunda daha fazla esneklik vardır. Ayrıca, hPSC mikro modellerinin başarılı bir şekilde üretilmesi için kritik adımları da vurguluyoruz. Örnek olarak, hPSC'lerin şablon mikro modellemesinin, hücre-hücre ve hücre-matris adezyonlarının uzamsal polarizasyonunu modüle etmek için kullanılabileceğini ve bunun da mezoendoderm farklılaşma modellerini belirlediğini gösteriyoruz. hPSC'leri mikro modellemeye yönelik bu basit ve sağlam yöntem, erken embriyonik gelişim sırasında doku organizasyonunu ve modellemeyi araştırmak için deneysel modeller oluşturma olasılığını genişletir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embriyonik kök hücreler (hESC) ve uyarılmış pluripotent kök hücrelerin (hiPSCs) de dahil olmak üzere insan pluripotent kök hücreler (hPSCs), yaygın olarak tüm hücre soyları halinde nedeniyle farklılaşma potansiyeli, normal ve hastalıklı organogenez deneysel modelleme gibi rejeneratif tıpta istismar üç germ katmanları 1,2. HPSCs farklılaşması kaderi fiziksel ipuçları 3-5 aracılık ettiği otokrin veya 1 sinyal parakrin yanı sıra mechanotransduction süreçleri modüle yerel çevresel faktörlere karşı oldukça duyarlıdır. Hücre micropatterning mekansal, hücre-hücre etkileşimleri 6 ve hücre-matris etkileşimlerinin 3 gibi, yerel hücresel mikro-kontrol etmek için bir araç olarak bir hücre popülasyonunun geometrisi ve konumu düzenlemek için geliştirilmiş tekniklerin bir dizi kapsar. hPSCs bağlamında, hücre micropatterning niş bağlıdır nasıl hakkında önemli bilgiler elde etmek için istihdam edilmiştirKBB otokrin sinyalizasyon erken embriyonik farklılaşma kalıpları 6 içine HESC Pluripotency-farklılaşma kararları 7 ve organizasyon düzenler. 2D ve 3D micropatterned hPSCs sırayla üç germ 8,9 içine farklılaşma kararları etkilemiş çok hücreli desen, koloni boyutunu denetlemek için kullanılmıştır. Bu integrin E-kadherin karışma hücre kaderi heterojen 10 çıkmasına neden olabilir araştırmak üzere bir hPSC koloni içindeki hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerinin ölçüde modüle edilmesi için çok-hPSC micropatterns kullanmışlardır. Doku veya organ gelişimi sırasında büyüme faktörleri ve hormonların etkisini araştırmak için gelişimsel hastalıklar 11, ilaç toksisitesi taraması için deneysel model olarak hPSCs ve çok hücreli micropatterns uygulanması yönünde yukarıdaki raporlar açık yeni caddeleri gösteriler ve oluşumunu çözülmeye doku desenleri.

Hücre micropatter bir sayısızFalconnet diğerleri tarafından gözden olarak ning teknikler geliştirilmiştir. ark. 12 ancak böyle mikro temas 7,8,13 yazdırma gibi sadece bir avuç, Mikro kültürü 14,15, photopatterning 6 ve microstencils 16 başarıyla hPSCs ile hayata geçirilmiştir. micropatterning hPSCs Challenge etkilenmeleri ve hücre eki ve hayatta kalma için spesifik hücre dışı matris (ECM) ve büyüme koşullarının sıkı bir gereksinimi bulunmaktadır. 2D hPSC kalıpları için, mikro-kontak baskı doku kültürü ve cam yüzeylerde 13 hPSC micropatterns oluşturmak için en yaygın yöntemlerden biridir. yöntem, Matrigel olarak laminin ve bazal zar matris, aşağıdakileri içeren hPSC kültür, kullanılan model yaygın ECM için kullanılabilir. Bununla birlikte, tipik olarak poli-D-lizin ile destekli iki aşamalı bir kaplama işlemini gerektirir ve hPSCs 6,13 üzerine takmak için stabil ECM micropatterns yapmak için özel bir atıl atmosfer ve nem koşulları ihtiyacı. Her micropatterning yönteminin en önemli husus çevreleyen bölgelere belirsiz hücre eki en aza indirirken yüzey modifikasyonu rejimi istenilen geometrik çözünürlükte hPSC yapışkanlı ECM desenleri üretebilir olup olmadığıdır.

Burada, hPSCs üzerinde takmak için önce yapışkan ECM desen nesil ek yüzey modifikasyon adımlar olmadan hPSC micropatterns oluşturmak için basit bir yöntem olarak şablon micropatterning kullandığını rapor etmiştir. Hücre şablonun içinden delikler fiziksel ECM kaplamalar ve daha sonra ekilmiş hPSCs içeren bir hücre kültür substrat üzerine sızdırmaz boyutu milimetre mikron olan ince bir zar, örneğin, polidimetilsiloksan (PDMS) tabakanın içerir. şablon desenlendirme fiziksel hPSC yatan ECM kaplı yüzeye doğrudan erişim ve ekleyebilirsiniz konumu frenleyici çalışır gibi, bu yöntem hPSC kültürleri destekleyen çeşitli yüzeylerde ile uyumludur. sadece requiremenT Şablon malzeme seçimi alt-tabaka ile bir tersinir bir yalıtım oluşturmak olabilir. Bu alt-tabakalar, geleneksel doku kültür polistiren (TCPS) 17, ligand konjuge tabakaları 18, hem de ayarlanabilir sertlik elastomer tabakaları kapsar (örn., PDMS) 19. Bu yöntem, aynı zamanda, uygun bağlanma ve hPSCs farklılaşması için izin verilmesi için, vitronektin (veya VTN protein), laminin ve bazal membran matris (örneğin, Matrigel ve Geltrax) gibi farklı ECM'nin kaplama sağlar. Belirli hPSC hattı Bu nedenle, optimum aktarım için ECM alt-tabaka konfigürasyonları uygun hücre-matris yapışma, hayatta kalma ve farklılaşması için micropatterning şablona. Son zamanlarda, benzer bir yöntem, aynı zamanda, poli (metil metakrilat) ile micropatterning HESC (PMMA), mikro-Şablon dizileri 16 hepatik farklılaşma doğrudan bildirilmiştir.

Hücre şablonlar, farklı malzemelerden imal edilebilir araya dahilALS 20,21, poli (p-ksilen) polimerler 22,23, PMMA 16 ve en çok PDMS 24-28. Silisyum ve poli (p-ksilen) polimerler şablonlar biyolojik kullanıcılara kendi sınırları erişilebilirlik özel ekipman 20-23 ile geçiş delikleri doğrudan aşındırma gerektirir. PDMS şablonlar tipik olarak 3 um 2,000 um 11,26-29 aralığındadır istenen bir özellik boyutuna bağlı olarak farklı yöntemler ile imal edilebilir. Küçük özellikler istenirse, ince stenciling levhalar micropatterns 28 kabartmaları içeren bir microfabricated silikon şablona basın kalıplama PDMS pre-polimer üretilebilir. Özellikler> 1,000 mikron, bir CO2 lazer kesici doğrudan şablon imalat sırasında önceden döküm PDMS kağıda desenleri kesmek için kolay ve düşük maliyetli bir yöntem sağlar. PDMS şablon geri dönüşümlü da yeterli tutarlılık ile deneylerini yapmak için onları maliyet-etkin hale getirir.

Burada lazer kesim tarafından 1000 mikron özelliklere sahip bir PDMS şablonun imalat ve HESC micropatterns üretimi için detaylı metodoloji sunuyoruz. Bu HESC micropatterns integrinin ölçüde modüle etmek için kullanıldı ve hücre yapışmasının mekansal polarizasyon hücresi kaderi heterojen 10 sonuçlanan araştırmak üzere E-kadherin uyumlu bir HESC koloni içinde yapışıklıklar aracılı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu protokol PDMS şablon kullanarak HESC hattının lazer kesim ve micropatterning, H9 tarafından 1000 mikron desenleri ile PDMS şablonun yapımını anlatmaktadır.

1. Tasarım ve micropatterning için PDMS şablonun Fabrikasyon

  1. İstenilen geometri ve boyut (örneğin, 1,000 mikron daireler) ve bilgisayar destekli tasarım yazılımı 10 kullanarak şablon conta geçiş delikleri ile stenciling sayfasını tasarlayın.
  2. 120-150 mikron ve kalın polidimetilsiloksan (PDMS) yaprak sırasıyla CO2 lazer kesici 10 kullanılarak 2 mm stenciling levha ve conta Lazerle kesilmiş.
  3. micropatterning PDMS şablonu elde etmek için 3-4 saat boyunca 60 ° C'de, sıvı sertleşmemiş PDMS ve fırında kullanarak PDMS şablonundaki sayfası ile PDMS conta Bond.
  4. Kullanmadan önce, bir fırın içinde, 30 dakika ve kurutma 120 ° C de otoklavlama PDMS şablon sterilize edin.

2. hESC AnaBakým

  1. Kültür HESC 37 ° C'de 1 x HESC nitelikli bazal membran matrisi kaplanmış hücre kültür plakaları bir besleme içermeyen muhafaza edici ortam içinde hatları ve% 5 CO2.
  2. Geçiş yaklaşık olarak% 70 dispaz tedavisi ile 37 ° C 'de 3 dakika inkübasyon ile birleşik ve mekanik 100-200 um kümelerine HESC koloniler ayrışan olan HESC. 6 bölme: 1 oranındaki bazal membran matris kaplı doku kültür polistiren üzerinde büyüme alanı 9.6 cm2 başına 30-50 kümeleri yoğunluğunda HESC topaklar Plate.

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri 3. Stencil micropatterning

  1. Desenlendirme hücre önce Hazırlık
    1. Petri kabı içine ultra saf su içinde 700 ul% 70 analitik dereceli etanol dağıtım ve üstüne şablon koyarak bir 60 mm Petri kabı üzerine PDMS şablon Seal.
    2. t gecede izin biyogüvenlik kabini içinde Petri kabı yerleştirinO kuru etanol.
    3. hiçbir kabarcık şablon Petri kabı ile iyi bir sızdırmazlık oluşturur emin olmak için şablon altında bulunmaktadır edin. Bu ECM kaplama solüsyonu sızıntılarını önler. hücre tohumlama için hazır olana kadar steril koşullar altında Petri kabı ve mağaza kapatılmalıdır.
    4. Analiz Sertifikalarını göre hESC nitelikli bazal membran matris hacimde hazırlayın. Besin Karışımı, F-12 (DMEM / F12) üreticinin ürün sayfasına göre: her bir sıvı bölüntü verimleri 1 Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı içinde, 25 ml içinde seyreltilmiş x HESC nitelikli bazal membran matrisi çözeltisi emin olun.
    5. 1.5 × hESC nitelikli bazal membran matris çözümü yapmak için DMEM / F12 16.7 ml hESC nitelikli bazal membran matris bir kısım ekleyerek ECM kaplama çözeltisi hazırlayın. jelleşme önlemek için buz üzerinde tüm ECM kaplama çözümü tutun.
    6. 10 uM ROCK inhibitörü (Y27632) ile HESC bakım ortamı Supplement.
  2. stenciled alt-tabaka üzerine ECM kaplama
    1. 90 saniye boyunca 100 plazma 2 WO Petri kabı davranın. sterilite sağlamak için, yalnızca öncesinde plazma işlemine plazma odasının içine Petri kabı kapağını açın ve hızlı bir şekilde tedavinin tamamlanmasından sonra Petri kabı arka kapak. Bu yüzey ıslanmasını kolaylaştırır ve ECM kaplama çözeltisinin ilave edilmesi sırasında geçiş delikleri mikrodesenlerle hava kabarcığı oluşmasını engeller.
    2. Bütün şablon kapsayacak şekilde 1.5 × hESC nitelikli bazal membran matris solüsyon 450 ul ekleyin. Örneğin Parafilm olarak öz kapatılabilen film ile Petri Seal kurumasını önlemek için bir çözüm ve kullanımdan önce 37 ° C de 5 saat inkübe edilir.
  3. Stenciled alt tabaka üzerine Tohum HESC
    1. Yuvarlak, sıkı Packe tipik HESC morfolojisi kaybını gösteren farklılaşmış hücre alanları belirlemek için 6-çukurlu plaka içindeki HESC koloniler incelenmesi (örneğin, kayıpd epitel morfoloji, belirgin nükleol yüksek çekirdek / sitoplazma oranı). Bir vakum aspiratörü kullanarak farklı bölgeleri çıkarın.
    2. oyuk başına 2 ml DMEM / F12 ile iki kez yıkanır.
    3. 6 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu, örneğin Accutase olarak sindirim enzimleri, 1 ml ilave edilir ve 8 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. alt tabakadan tüm kolonileri ayırmak için hafifçe plaka dokunun.
    4. Sindirim enzimlerinin 1 ml başına DMEM / F12 içinde en az 4 ml de her durulama ve 15 ml konik tüp içine hücre süspansiyonu toplanır.
    5. Oda sıcaklığında 3 dakika 200 x g'da hücre süspansiyonu santrifüj.
    6. Aspire süpernatant kaldırmak ve hücrelerin yeniden askıya ROCK inhibitörü (Rocki) ile desteklenmiş HESC bakım ortamı 400 ul ekleyin. Hücre süspansiyonu yukarı Pipet ve yavaşça aşağı 3 kez tek hücre içine kümeleri kırmak için.
    7. tek bir hücre süspansiyonu iyice karıştırın ve DMEM / F12 (1:20 seyreltme) 190 ul içine hücre örneklerinin 10 ul sulandırmak. Bir hemocytome kullanınter stok hücre süspansiyonu hücre yoğunluğu belirlemek için.
    8. Belirli bir şablon için gerekli olan hücre tohum yoğunluğu hesaplanır.
      Not: Örneğin, deneysel olarak tek hücreler konfluent tek tabaka yaklaşık / mm2 4,444 hücreleri elde etmek için, hücre tohum yoğunluğu saptadık. Bu durumda, bir 450 mm 2 alanına ve 400 ul tohumlama hacmi ile bir şablon 2.000.000 hücre / 400 ul bir yoğunlukta olduğu, bir hücre süspansiyonu gerektirecektir.
    9. Rocki ile desteklenmiş HESC kültür ortamı ile gerekli tohumlama yoğunluğu (adım 3.3.8 NOT bakınız) stok hücre süspansiyonu seyreltilir.
    10. Her şablonun içine hücrelerin gerekli sayıda içeren hücre süspansiyonu belirlenen hacim ekleme ve hücreler yerleşmek için izin oda sıcaklığında 5 dakika boyunca kaputu rahatsız Petri kabı bırakın.
    11. inkübatör içine Petri kabı aktarın ve hücre yapışmasını sağlamak üzere 1 saat boyunca inkübe edilir. sırasında Petri kabı seviyede tutmak için özenHücreler şablonun bir tek tabakalı olarak kalması, böylece süreci aktarın.
  4. Şablon çıkarma ve desensiz substratın pasivasyon
    1. hücrelerin düzgün alttaki tabaka üzerine takılı olup olmadığını kontrol etmek için mikroskop altında Petri kabı inceleyin.
    2. şablonun hücre süspansiyonu uzak aspire.
    3. şablon çevreleyen alana DMEM / F12 içinde% 0.5 Hücre kültürü uyumlu iyonik olmayan yüzey aktif madde 2 ml / tabak ekleyin.
    4. yavaşça şablon kalkmasına otoklavlanmış forseps bir çift kullanın. Şablon kurumasını hücreleri önlemek için sıyrılır gibi iyonik olmayan yüzey aktif madde çözeltisi etrafında dönme. Görme Petri kabındaki micropatterned hücreleri gözlemlemek.
    5. 37 ° C'de 10 dakika süre ile% 0.5, iyonik olmayan yüzey aktif madde DMEM / F12 çözeltisi içinde micropatterned hücreleri inkübe edin.
    6. uzaklıkta aspire iyonik olmayan yüzey aktif madde DMEM / F12 çözeltisi. 2 ml / DMEM / F12 çanak ile 3 kere yıkayın.
    7. hESC 2 ml / tabak eklemebakım ortamı Rocki ile takviye edilmiş ve bir gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    8. Gece boyunca inkübasyondan sonra, Rocki ile takviye aspirat HESC bakım ortamı, DMEM / F12 ile bir kez yıkanır ve 2 ml / 100 ng / ml Aktivin, 25 ng / ml BMP4 ve 10 ng / ml FGF2'nin ile takviye farklılaştırma ortamının çanak ekleyerek mesoendoderm farklılaşmasını teşvik .
    9. Faz kontrast görüntüleme kullanılarak micropatterns değerlendirin ve daha önce 8 açıklandığı gibi, her model için ortalama Brachyury (T) yoğunluk profilleri hesaplamak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda 1000 mikron özellikleri üretmek için bir lazer kesici kullanarak bir hücre şablonun imalat açıklar. şablon 2 bölümden oluşmaktadır: ince stenciling sayfası geçiş delikleri mikrodesenlerle içeren (kalın yaklaşık 100-200 mikron) ve ECM kaplama çözeltisi veya hücre süspansiyonu içeren bir PDMS conta. Burada, 127 um ve 2 mm kalınlığında, ticari olarak temin PDMS sayfaları, sırasıyla delikli kalıpla baskı tabakası ve conta olarak kullanılmıştır. Bu tür yan kaplama olarak kontrol kal...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Micropatterning şablon imalatı

Elek micropatterning niş aracılı farklılaşma model oluşturmanın araştırmak için hPSC micropatterns oluşturmak için ideal bir yöntem sağlar. Böyle microcontact baskı ve photopatterning gibi diğer micropatterning teknikleri üzerinde şablon desen önemli avantajı, yüzey modifikasyonu gerektirmez ve geleneksel TCPS yüzeylerde uygulanabilir olmasıdır. Bu nedenle, farklı hPSC hatları için optimize edilmiş kültür ortamı ECM kaplamalar kolaylık...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları var.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma ödeneği başlatın NUS tarafından (R-397-000-192-133) ve ETPL Gap Fonu (R-397-000-198-592) desteklenir. GS NUS Araştırma bilginidir. Yazarlar, hücre micropatterning onu teknik destek için Dr. Jiangwa Xing teşekkür etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

&

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
  2 mm kalınlığında PDMS levhaÖzel Silikon Ürünleri A.Ş., ABDSSPM823-.005mu için rezervuar oluşturmak için kullanılır
; m kalınlığında PDMS levhaÖzel Silikon Ürünleri A.Ş., ABDSSPM823-.040Şablon oluşturmak için kullanılır;
60 mm Petri kabıNunc Nunclon Delta150326Mikro modelleme için substrat
AccutaseAccutase, Merck Millipore, SingapurSCR005H9 hücrelerini tek hücrelere ayırmak için enzim
Aktivin   Ar-Ge D Systems, Singapur338-AC-010H9 farklılaşması için büyüme faktörü
BMP4 Ar-Ge D Systems, Singapur338-BP-010H9 farklılaşması için büyüme faktörü
Plazma sistemi Femto Science, KoreCUTE-MPtrade'in plazma oksidasyonu için
; Teknolojiler, Singapur7923sırasında hücre-ECM yapışmasını zayıflatmak için kullanılan enzim
GIBCO, ABD11330032H9 hücreleri için bazal ortam
FGF2R& D Sistemleri, Singapur233– FB– 025H9 farklılaşması için büyüme faktörü
H9 hücre hattıWiCell Research Institute, Inc., ABDWA09İnsan embriyonik kök hücreleri
hESC nitelikli bazal membran matrisiMatrigel, BD Biosciences, Singapur354277H9 hücrelerinin büyümesini desteklemek için hücre dışı matris kaplama
Ters mikroskopLeica Microsystems, SingapurDMi1Parlak alanı yakalamak için görüntüler
Lazer kesiciEpilog Helix 24 Lazer Sistemitrade'de açık delikler oluşturmak için kullanılır
; 1 orta Kök Hücre ve ticaret; Teknolojiler, Singapur5850H9 hücreleri için bakım ortamı
PDMS &SYLGARD & reg; 184, Dow Corning Co., ABD3097358-1004PDMS şablonunu ve koruyucuyu yapıştırmak için kullanılır
ROCKi Y27632Calbiochem, Merck Millipore, Singapur688000H9 hücrelerini tek hücreler olarak tutar 
STEMdiff ve ticaret; APEL ve ticaret; orta Kök Hücre ve ticaret; Teknolojiler, Singapur5210H9 hücreleri için farklılaşma ortamı
Polietilen tereftalat filmiSureMark SingaporeSQ-6633Şablon oluşturmak için kullanılır;
Hücre kültürü uyumlu iyonik olmayan yüzey aktif maddePluronik asit F-127, Sigma, SingapurP2443Mikro desenli olmayan substratlarda hücre yapışmasını itmek için pasifleştirici reaktif
Şablon 120-150 & Şablon Dispase StemCell & DMEM/F12 geçişi PDMS levha mTeSR

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Graf, T., Stadtfeld, M. Heterogeneity of embryonic and adult stem cells. Cell Stem Cell. 3 (5), 480-483 (2008).
  2. Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
  3. Guilak, F., Cohen, D. M., Estes, B. T., Gimble, J. M., Liedtke, W., Chen, C. S. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell Stem Cell. 5 (1), 17-26 (2009).
  4. Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nat Mater. 13 (6), 558-569 (2014).
  5. Joddar, B., Ito, Y. Artificial niche substrates for embryonic and induced pluripotent stem cell cultures. J Biotechnol. 168 (2), 218-228 (2013).
  6. Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nat Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
  7. Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
  8. Lee, L. H., Peerani, R., Ungrin, M., Joshi, C., Kumacheva, E., Zandstra, P. Micropatterning of human embryonic stem cells dissects the mesoderm and endoderm lineages. Stem Cell Res. 2 (2), 155-162 (2009).
  9. Hwang, Y. S., Chung, B. G., Ortmann, D., Hattori, N., Moeller, H. C., Khademhosseini, A. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (40), 16978-16983 (2009).
  10. Toh, Y. C., Xing, J., Yu, H. Modulation of integrin and E-cadherin-mediated adhesions to spatially control heterogeneity in human pluripotent stem cell differentiation. Biomaterials. 50 (0), 87-97 (2015).
  11. Xing, J., Toh, Y. C., Xu, S., Yu, H. A method for human teratogen detection by geometrically confined cell differentiation and migration. Sci Rep. 5, 10038(2015).
  12. Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
  13. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  14. Khademhosseini, A., et al. Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates. Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).
  15. Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. 3-D microwell culture of human embryonic stem cells. Biomaterials. 27 (36), 6032-6042 (2006).
  16. Yao, R., et al. Hepatic differentiation of human embryonic stem cells as microscaled multilayered colonies leading to enhanced homogeneity and maturation. Small. 10 (21), 4311-4323 (2014).
  17. Mei, Y., et al. Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells. Nat Mater. 9 (9), 768-778 (2010).
  18. Melkoumian, Z., et al. Synthetic peptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 28 (6), 606-610 (2010).
  19. Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cell Mater. 18, 1-13 (2009).
  20. Carter, S. B. Haptotactic islands: a method of confining single cells to study individual cell reactions and clone formation. Exp Cell Res. 48 (1), 189-193 (1967).
  21. Jimbo, Y., Robinson, H. P., Kawana, A. Simultaneous measurement of intracellular calcium and electrical activity from patterned neural networks in culture. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (8), 804-810 (1993).
  22. Wright, D., et al. Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning. J Biomed Mater Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).
  23. Jinno, S., et al. Microfabricated multilayer parylene-C stencils for the generation of patterned dynamic co-cultures. J Biomed Mater Res A. 86 (1), 278-288 (2008).
  24. Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15 (8), 2973-2984 (1999).
  25. Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures. J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).
  26. Park, J., et al. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7 (8), 1018-1028 (2007).
  27. Choi, J. H., Lee, H., Jin, H. K., Bae, J. S., Kim, G. M. Micropatterning of neural stem cells and Purkinje neurons using a polydimethylsiloxane (PDMS) stencil. Lab Chip. 12 (23), 5045-5050 (2012).
  28. Li, W., et al. NeuroArray: a universal interface for patterning and interrogating neural circuitry with single cell resolution. Sci Rep. 4, 4784(2014).
  29. Guvanasen, G. S., Mancini, M. L., Calhoun, W. A., Rajaraman, S., DeWeerth, S. P. Polydimethylsiloxane Microstencils Molded on 3-D-Printed Templates. J Microelectromech S. 23 (5), 1045-1053 (2014).
  30. Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PLoS One. 7 (12), 51499(2012).
  31. Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat Mater. 9 (1), 82-88 (2010).
  32. Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues. Cancer Microenviron. 5 (1), 29-38 (2012).
  33. Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4201-4213 (2010).
  34. Eroshenko, N., Ramachandran, R., Yadavalli, V. K., Rao, R. R. Effect of substrate stiffness on early human embryonic stem cell differentiation. J Biol Eng. 7 (1), 7(2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

H cre AdezyonuMezoendoderm DiferansiyasyonuPDMS ablonBazal Membran MatrisiH cre EkimiMikroskopi Analizi

İlgili makaleler