Yöntem makalesi

Fare Embriyonik Hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu

12.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/54150

⸱

17 Haziran 2016

 ,  ,  , 
1Departments of Medicine, Genetics and Biomedical Engineering, Yale Cardiovascular Research Center, Vascular Biology and Therapeutics Program, Yale Stem Cell Center, Yale University School of Medicine, 2Department of Pediatrics, Section of Neonatal-Perinatal Medicine, Yale University School of Medicine, 3Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPC) henüz küçük bazı endotel hücreleri kan yapıcı olmaya belirtmek hangi işlemi hakkında bilinen, gelişim sırasında uzman (hemogenic) endotel hücreleri kaynaklanıyor. Bu fare embriyonik dokulardan hemogenic endotel hücreleri ve HSPC eşzamanlı izolasyonu sağlayan bir akış-sitometri göre bir yöntem ortaya koymaktadır.

Özet

embriyonik vasküler endotel hemogenic endotel hücrelerinin özellikleri farklı dokulardaki kısa gelişim dönemlerinde oluşur ve (fare ekstra embriyonik yolk kesesi, plasenta, göbek damarları ve embriyonik aorta-gonad-mesonephros gelen kesin HSPC ortaya çıkması için gerekli olan AGM) bölgesi. Bu hücre popülasyonunun geçici doğası ve küçük boyutlu dikkatli ölçümü ve deneysel uygulamalar için tekrarlanabilir izolasyon teknik olarak zor hale getirir. Bu yumurta sarısının ve AGM bölgesindeki pik üretim zamanlarda hemogenic endotel hücreleri ve HSPC eşzamanlı izolasyonu için bir floresan-aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) tabanlı protokol kurduk. Biz yolk kesesi ve fare embriyoları AGM dokuların diseksiyonu için yöntemler göstermek ve biz önce FACS yoluyla belirlenmesi ve alımı için maksimum hücrenin hayatta kalması için optimize doku sindirim ve antikor konjugasyon koşullarını sunuyoruz. Temsilcisi FACS analizis araziler bu hemogenic endotelyal hücre ve HSPC fenotipleri belirlemek ve klonal düzeyde kendi kan yapıcı potansiyelini değerlendirmek için bir metilselüloz bazlı analiz tanımlamak gösterilmiştir.

Giriş

Fonksiyonel dolaşım sistemi kan damarları ve kan hücrelerinin paralel geliştirilmesini gerektirmektedir. Kan geliştirme (ilkel hematopoez) erken aşamalarında, eritroblastta kökeni şiddetle 1 tartışılan kalır. Buna karşılık, kan hücresi gelişimi (kesin hematopoez) sonraki aşamalarında, multi-soy HSPC uzman vasküler endotelyal yolk kesesi, plasenta içindeki kan oluşturan potansiyel (hemogenic endotel hücreleri) elde hücreleri ve AGM ortaya çıktığını giderek daha açık hale gelmiştir 2-5, hem de vitellin ve göbek damar embriyonik endokard 6 ve baş damar 7. Bu farklı dokuların içinde hemogenic endotel hücrelerinin şartname Belirli gelişim aşamaları gerçekleşir; Örneğin, ~ E8.25 de yolk kesesi içinde ve ~ E10 8-12 de AGM içinde. hemogenic Endo Her şeye rağmen, bu özel gelişim pencereleri sırasında nüfus11,12 - (yolk kesesi ve AGM endotel hücrelerinin% 3 1), endotel hücreleri, endoteliyal hücreler, küçük bir bölümünü temsil eder. hemogenic endotel hücre "tarifnamede" bir işlem de, insan, hematopoiez olarak, murin için önemlidir. Hematopoietik hücreler sarısı kese damar endotel ve insan embriyolarından 13 aortundan tomurcuk gösterilmiştir ve çeşitli laboratuarları insan pluripotent kök hücreleri, kan hücresi üretimi 14-16 ara madde, bir endotelyal hücre gerekli olduğu da gösterilmiştir. Bu durumda, kemirgen hemogenic endotel hücrelerinin fenotipi tanımlanması ve insan pluripotent kök hücrelerden hemogenic endotel hücrelerinin üretimi için in vitro teknolojilerin takip kolaylaştırmalıdır bu hayvan modelinde bunların gelişmesine yol moleküler olayları anlama. Buna karşılık, çok nesilli HSPC gelen farklı kan hücre tiplerinin büyük ölçekli üretimi için bir yaklaşım nihai olarak geliştirilmesi - kendilerini Deriara fizyolojik ilgili hemogenic endotel hücre ile insan pluripotent kök hücrelerinden ved - hematolojik, onkolojik ve rejeneratif tıp için inanılmaz bir terapötik potansiyele sahip olacaktır. Bu hedef doğrultusunda, biz embriyogenez sırasında kesin HSPC üretimin 11 ve AGM 12, iki büyük siteler kesesi fare sarısı içinde, bir klonal düzeyde, hemogenic endotel hücrelerinin fenotip tanımladınız. Bu nedenle Yetişkin kemik iliği 17, oluşum safhasındaki hemogenic endotel hücreleri ve HSPC sergi Hoechst boya akış özellikleri olan HSPC ve benzerleri "Yan nüfus" içinde (Şekil 3 'de gösterildiği gibi), bir FACS arsa 5,11,12 hücrelerinin (SP) görüntülenir. Buna ek olarak, aynı zamanda hemogenic endotel hücreleri hem endotelyal belirteçler ve hücreleri (sırasıyla flk1 ve cKit) kök ama hematopoietik kökenli işaretleyicisini CD45 5,11,12 ifade ettiklerini göstermiştir. Bu nedenle, hemogenic endotel hücreleri tanım olabilirified ve FACS ile izole flk1 + / cKit + / CD45- SP hücreleri gibi, ve bu hücreler, yumurta sarısının ve AGM hücreleri 5,11,12 arasında Flk1- / cKit + / CD45 + SP fraksiyonu içinde ihtiva HSPC yol göstermiştir. Hemogenic endotelyal hücrelerin ve HSPC, ya da (Şekil 1 'de gösterildiği gibi), ex vivo embriyo kültürü içinde 48 saat süre ile kültüre embriyolar olarak tanımlanır ve yolk kesesi ya da taze ötanazi embriyolar ya hasat AGM dokulardan izole edilebilir. Ex vivo kültür seçici izin farmakolojik maddeler tek tek embriyoların ön-işlem ve aynı zamanda arzu edilen transgenlerin (yani, lentiviral transdüksiyonu ile) kısa süreli bırakılması için izin verir. Bu tarifnamede tarif edilen yöntemle hemogenic endotel hücreleri ve HSPC FACS tespiti, genetik olarak manipüle fare modellerinde kesin hematopoietik gelişme nicel ölçüsü olarak kullanılabilir; hücreleri, kan-fo dahil olmak üzere sonraki deneysel uygulamalar için alınabilirrming deneyleri, ifade analizi ve nakli.

Hayvan Başlık: Kullanım ve Etik Hususlar

Literatürde artan vücut embriyonik gelişim kesin hematopoez aşamasında HSPC oluşumuna hemogenic endotel hücrelerinin önemli bir katkı kurmuştur. Bununla birlikte, bir hemogenic kaderi doğru endotelyal hücrelerin bir alt şartname teşvik fizyolojik koşullar ve sinyal yeterince anlaşılamamıştır, dolayısıyla henüz in vitro ortamda taklit edilemez. Nitekim, bu yazıda anlatılan tekniklerin ex vivo hemogenic endotel hücre özellikleri ve HSPC üretimi için bir yaklaşım, bir gün gelişmiş olabilir, öyle ki hematovascular gelişimi, alanın anlayışı geliştirmek için laboratuar ve diğer gruplar tarafından şu anda kullanımda. Bu zamana kadar, ancak alan primer vahşi tip doku (ve gen bağlıdır kalırola- rak değiştirilmiş) farenin embriyolar daha fazla çalışma için hemogenic endotel hücreleri ve HSPC belirtilen elde edildi. Hemogenic endotelyal hücrelerin ve HSPC güvenilir bir şekilde tespit ve her iki E8.5 izole edilebilir (10-12 hücre gruplarının çifti) yumurta sarısının veya E10.5 (35-40 hücre gruplarının çift) 11,12 AGM. Nedeniyle hemogenic endotel hücrelerinin göreli kıtlığı (tipik olarak 1 temsil - Toplam endotel hücreleri bu dokuların içinde 11,12% 3) birden dokuların havuzu (~ 8 - 10) tek bir örnek haline yavrular kuvvetle amacıyla tavsiye edilir sonraki deney için yeterli hücre elde. hemogenic endotelyal hücrelerin ve HSPC başarılı bir şekilde tanımlanmış ve izole edilmiş olduğunu doğrulaması hematopoietik değişimini etkileme koşullar altında alınan hücre kültürü ile elde edilebilir. Bu koşullar altında, hemogenic endotelyal hücrelerin ve HSPC ery ihtiva kolonilerinin sonuçlanan çok soyundan hematopoyetik farklılaşmasını sergileyecekthroid progenitörler (BFU-E), granülosit ve makrofaj projenitörleri (CFU-GM), ve granülosit eritrosit, makrofaj, megakaryosit progenitör kolonileri (CFU-GEMM).

Protokol

Etik Beyanı: aşağıda özetlenen protokol tarafından gözden ve Yale Üniversitesi'nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi, yönergelerine uygun değil.

1. Tüm Embriyo Yolk Sac Çalışmaları Ex V ivo Kültürü (İsteğe bağlı)

  1. E7.0 hamile baraj öldürülür - E7.5 ve (2.4 adım - 2,7), aşağıda daha detaylı bir şekilde tarif edildiği gibi, steril koşullar altında rahim boynuzları çıkarın.
  2. Ayrı bütün çevredeki desidua dan (yumurta sarısının 12 sağlam) ile embriyolar, ve 50 ml polistiren tüplerde 50 ml bütün sıçan serumunda askıya.
  3. % 5 CO2 ile 3 dakika için gaz embriyo şişe, hemen daha önce 12,18 tarif. 48 saat - 24 için embriyolar kültüre eğer 24 saat sonra bu adımı yineleyin.
  4. en fazla 48 saat boyunca 37 ° C'de kültürü yuvarlanma inkübe edin.
    Not: Embriyolar (farmakolojik ajanlarla ex vivo olarak tedavi edilebilir, yani Notch inhibitörü DAP.T 12) ya da çözünür proteinleri (yani, bu tür faktörler içeren kültür ortamı içinde en fazla 2 saat için embriyo ön inkübasyon yoluyla fibronektin 19) ya da ex vivo kültür tamamı boyunca haddeleme kültür ortamına bu faktörlerin eklenmesiyle dönem. Gen ifadesi, 2 ila 12 saat için optimal olarak titre lentivirüs embriyoların önceden kuluçkaya yatırılması ile embriyolar manipüle edilebilir. Yolk kesesi vasküler ve hematopoetik gelişimi transgenik muhabiri fareler ve optik görüntüleme tekniklerini kullanarak gerçek zamanlı olarak izlenebilir.

Fare Embriyolar gelen Sarısı Sac (YS) ya da Aort-gonad-mesonephros (AGM) 2. diseksiyonu

  1. püskürtme ve sonraki hücre kültürlerinde kirlenmesini azaltmak için% 70 etanol ile tüm yüzeyleri silerek laboratuar tezgah sterilize edin. laboratuar tezgah yüzeyi üzerinde bir emici underpad yerleştirin.
  2. % 70 etanol ile cerrahi aletler sterilize. Tavsiye edilen cerrahi aletler, iki 5. düz güçtürps, ve bir 8.5 cm düz makas.
  3. Ex vivo kültür embriyolar ile çalışan varsa, dikkatli bir şekilde 50 ml Falcon tüplerinde gelen bütün embriyolar kaldırmak ve 2.8 adıma hemen geçin. Aksi takdirde, bu adımı atlayın ve 2.4 adıma geçin.
  4. Uygun embriyonik yaşta hamile baraj Euthanize (E8.5 eğer hasat YS, E10.5 hasat AGM ise).
    Not: açıklanan teknik bir çift yöntem ötenazi yaklaşım kullanır - mekanik servikal dislokasyon tarafından takip uçucu anestezik öldürücü doz - hayvan acı ve sıkıntı en aza indirmek için, ve hayvan deneklerin minimal invaziv ve insancıl sonlandırma sağlamak. eğitimli ve yetkin araştırmacı (: 2013 Baskı Hayvanlar Ötenazi için AVMA Kuralları) tarafından gerçekleştirilen zaman küçük kemirgen ötenazi Bu kombine teknik Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği tarafından tavsiye edilmektedir.
    1. 5 dakika - 3 izofluran bir öldürücü doz (> O 2% 5) kullanılarak fare anestezisi. (CAUTIAÇIK: İsofluranın bir toksik uçucu olduğu; Uygun solunum kişisel koruyucu ekipman ile kimyasal davlumbaz altında kullanın.)
    2. düzeltilmesi refleks kaybı, ayak tutam refleks kaybı ve solunum hızının azalması - - izofluran farelerin maruz kaldıktan sonra, anestezik düzeyinde en az üç işaretleri kontrol konuyu sağlamak için mekanik ötanazi geçilmeden önce derin bir anestezi uçağı elde ettik.
    3. Servikal hızla ölümüne neden baraj yerinden.
  5. underpad ötenazi baraj sırtüstü yerleştirin ve liberal% 70 etanol ile alt karın püskürtün.
  6. alt karın duvarının orta hat boyunca dikey bir kesi yapmak. ~ Ek 1 inç yatay kesi sağ ve dikey kesi orta sola uzanan olun ve tam sağ ve sol rahim boynuzları her içeren çok sayıda gebe embriyolar maruz karın duvarı uzak teşrih.
  7. forseps kullanarak, iki rahim boynuzu birini tutmakve mesometrium ayırmak için makas kullanın. 60 mm polistiren doku kültür plakasında steril Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içinde buz üzerinde kesilir rahim yerleştirin. diğer uterin boynuz için tekrarlayın.
  8. Standart ışık mikroskop altında, altta yatan gebelik kesesi ve desidua ortaya çıkarmak için rahim kesenin kas tabakasını çekmeye forseps kullanabilir. Yavaşça kapalı embriyo kesesi kaldırarak YS (Şekil 2A) izole eder. Vitellin gemilerin embriyonik kökeni de doğru embriyodan YS doku çıkarın.
  9. AGM izole etmek için, YS kaldırmak ve kalp ve ön ayakları seviyesinin altında embriyo transect ve toraks ve baş bölgesini atın. Sonra, sadece arka ayaklarında seviyesinin altında embriyo transect ve kaldırmak ve kuyruk dokusu atın. AGM (Şekil 2B) içeren geri kalan bölümünde, gelen arka ayaklarında ve aşırı ventral doku çıkarın.
  10. Birden fazla embriyo ve mağaza Havuz YS veya AGM dokularHBSS + içinde buz üzerinde temiz bir 1.5 ml tüp içinde (HBSS,% 10 (h / h) cenin sığır serumu ve 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, ve 0.3 mg / ml L-glutamin ile takviye edilmiş).

Bir Tek Hücre Süspansiyon içine Primer Doku 3. Sindirim

  1. 4 ° C'de 2,000 x g'de 5 dakika boyunca hasat YS veya AGM dokuları ihtiva eden bir santrifüj tüpüne.
  2. 1 ml ya (YS için)% 0.05 veya HBSS + içinde seyreltilmiş kollajenaz tip II (AGM için)% 0.2 süpernatant ve tekrar süspansiyon doku çıkarın. tüp karıştırmak için her 5 dakika ters çevirici 37 ° C'de bir su banyosunda 30 dakika boyunca inkübe edin.
  3. Yavaşça mekanik P1000 pipet aracılığıyla numune 10 kez geçerek doku ayırmak. zorluk kısmen sindirilmiş doku aspire sahip olursa, pipet ucu delik bir makas ile ucu ~ 5 mm kesilerek genişletmiştir olabilir.
  4. 4 ° C'de 2,000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje örneği. 1 ml buz gibi soğuk HBSS + supernatant ve tekrar süspansiyon çıkarın.
  5. 70 & yoluyla örnek geçirin# 956; m hücre süzgecinden.
  6. Manuel veya otomatik hemasitometre kullanarak hücre sayımı.
  7. 4 ° C'de 2,000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje örneği. DMEM içinde süspanse örnek + pre (4.5 g / L glukoz Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı,% 10 (h / h) cenin sığır serumu ve 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, ve 0.3 mg / ml L-glutamin ile takviye edilmiş) hücreler 1 x 10 6 hücre / ml'lik bir nihai konsantrasyonda olacak şekilde 37 ° C'ye kadar ısıtıldı.

Floresan Konjuge Antikorlar ile Nükleik Asit Boya ve Etiketleme Hücreleri 4. Tedavi

  1. Kısım antikoru inkübasyon için yeni bir 1.5 ml tüpler içinde örneğin en az 100 ul (1 x 10 5 hücre).
  2. Aşağıdaki örnek ve gerekli kontrol tüpleri şunlardır: unstained; cKit-APC sadece; CD45-FITC sadece; CD31-PE sadece; Flk1-PECy7 sadece; Hoechst 33342 sadece; Hoechst 33342 yalnızca Verapamil +; Örnek (tüm renkleri alır, Verapamil almaz). 1 x 10 az kullanın Kontrol borular için 100 ul 5 hücre.
    Not: daha büyük bir hücre hacmi kriteri Hemogenic EC ve HSPC verimini en üst düzeye çıkarmak için, aynı konsantrasyonda örnek tüpüne de ilave edilebilir.
  3. Verapamil "Hoechst 33342 yalnızca + Verapamil" 50 uM'lik bir son konsantrasyon elde etmek için kontrol tüpüne% 95 etanol (gerekçe tartışma bakınız) içinde seyreltilmiş ekleyin. 37 ° C'de 5 dakika boyunca tüm tüpler inkübe edin. (DİKKAT: Verapamil güçlü bir kalsiyum kanal bloke edici madde olduğu ve son derece toksik eldiven kullanınız.).
  4. 5 ug / ml bir son konsantrasyona kadar, Hoechst 33342 + Verapamil sadece kontrole, "Hoechst 33342 yalnızca" kontrol Hoechst 33342 ekleyin ve "Örnek" tüp. ışıktan koruyarak 37 ° C 'de 1 saat, seyahati inkübe edin. Yavaşça her 15 dakikada tersine çevirerek karıştırın. (DİKKAT: Hoechst 33342 toksik nükleer boya ve eldiven ele alınmalıdır).
  5. Santrifüj tüm samp4 ° C'de 2,000 x g'de 5 dakika boyunca Les. Süpernatantı ve soğuk HBSS + içinde 1 x 10 5 hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda, hücre pelletleri tekrar süspansiyon.
  6. 2 ug / ml'lik bir nihai konsantrasyona kadar uygun bir antikor-sadece kontrol tüplerine ve "Örnek" tüp floresan konjuge antikor ekleyin. ışıktan koruyarak 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
  7. Santrifüj 4 ° C'de 2,000 x g'de 5 dakika boyunca bütün tüpler. Süpernatantı ve 500 ul buz gibi soğuk HBSS hücre pelletini. 5 ml acil FACS için ışıktan koruyarak buz üzerinde yuvarlak dipli polistiren FACS tüpü ve mağaza, mesh filtre kapağı ile Gerilme örnekleri.

FACS 5. Tanımlama ve Hemogenic endotel Hücreleri İzolasyon ve HSPC

Not: Bu protokol 100 mw 355 nm UV lazer ile donatılmış bir BD FACSAria 5-lazer sistemi, 200 mw 405 nm Menekşe lazer, 200 mw 488 nm Mavi lazer, 200 mw 532 nm Yeşil lazer kullanılarak optimize edildi ve bir 150 mw 637 nm Kırmızılazer. Hücreler, kılıf sıvısı olarak ve aseptik koşullar altında steril PBS içinde kriteri edildi ve bir numunesi basınca ayarlanmış debi ile 100 um ağızlıktan 1 1500 maksimum şekilde - 2,000 olayları hücre stresi en aza indirmek için, saniyede elde edilir.

  1. Yukarıda açıklanan bu ayarları altında, FACS hücre sıralayıcı lazer yoğunlukları optimize etmek ve üreticinin talimatlarına göre çok renkli spektral tazminat kontrolünü gerçekleştirmek için "boyanmamış" ve tek renk kontrol tüpleri kullanın. (Daha fazla bilgi için üreticinin talimatlarına bakın) ileri ve yan dağılım canlı hücre gerçekleştirmek ve toplam olaylardan ayrımcılık çiftli için.
    Not: Bu protokol, genellikle ~ 70 sonuçlanır -% 80 canlı hücreler. sorunları düşük hücre yaşayabilirliği ile karşılaşılırsa, dokular, başlangıçta buz ortamda hızlı bir şekilde kesilir sağlamak ve aksi belirtilerek dışında tüm adımlar kesme ve hücre ölümünü en aza indirmek için hafif bir pipetle, buz üzerine yapılmasını(Hücre canlılığını korumaya daha fazla ayrıntı için tartışma bakınız).
  2. Yan nüfus (SP) olayları (Şekil 3A) tanımlamak için Hoechst Mavi floresan vs Hoechst Red diferansiyel doğrusal ölçekli arsa kullanın. kapıları düzgün numune için çizilir olduğunu doğrulamak için bir negatif kontrol olarak "Hoechst 33342 sadece + Verapamil" denetimi kullanın. SP olmayan SP hücrelerin solundaki bir omuz olarak görünür ve Verapamil ile tedavi edilen kontrol azalacaktır. Olmayan SP popülasyon olmayan hemogenic EC (Şekil 3B) tanımlamak için kullanılır.
  3. Ek diferansiyel floresan araziler (log ölçekli eksen) oluşturun ve hemogenic endotel hücrelerini (Şekil 3C-E) tanımlamak için SP kızı kapıları çizin.
    Not: Hemogenic endotel hücreleri flk1 + / cKit + / CD45- SP hücreleri (Şekil 3B) ve profil ve HSPC Flk1- / cKit + / CD45 + SP hücreleri (Şekil 3E) vardır edilir. Hemogenic endotel carşın CD31 + / CD45- olmayan SP hücreleri (Şekil 3B) ve bu yaklaşımda tanımlanan olmayan hemogenic endotelyal hücreler paralel olarak analiz edilebilir.
  4. hemogenic endotelyal hücre ya HSPC kısmını hematopoietik kültür plakaları içeren metilselüloz üzerine (aşağıya bakınız), ya da daha sonraki işlem ve analiz için başka tamponlar içine alın.

Kültür 6. Hematopoetik Farklılaşma

  1. 0.5 ml (135 ul / cm2), oda sıcaklığında, 24 oyuklu bir doku kültür plakasının deliklerinin istenen sayıda metilselüloz bazlı hematopoietik kültür ortamı ekleyin. buharlaşmasını en aza indirmek için kullanılmayan kuyulara 0.5 ml steril su ekleyin. Taze hazırlayın ve kullanılana kadar oda sıcaklığında tutulması.
  2. Sıralama 1-10 hücreler klonal analizi için, veya en fazla 1000 hemogenic endotel hücreleri (flk1 + / cKit + / CD45- SP hücreleri) her kuyuya doğrudan dökme genişlemesi ve farklılaşması için ya HSPC (Flk1- / cKit + / CD45 + SP hücreleri)plaka metilselüloz içeren. % 20 - koloni oluşumu yaklaşık 10 tespit edilir.
  3. kabarcıklarının oluşmasını önlemek için özen, 3 kez - steril doku kültürü kaputu, nazikçe numaralı seribaşı metilselüloz medya 2 Her çukurun tekrar süspansiyon, onun deliği genişletmek için kesilmiş ucu ile P1000 ucu kullanın. Bu optimum büyüme için yarı katı metilselüloz halinde sıralanır hücrelerin süspansiyon sağlar.
  4. En fazla 2 hafta içinde% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe plakası.
  5. Zaman içinde farklı hematopoietik hücre kolonilerinin oluşması (Şekil 4), tek bir hücre kültürleri izleyin. gün 1, 3, 7 numaraya ve farklılaştırılmış hematopoetik koloni tipi için kuyu Puan ve adım 6.7 aşağıda belirtilen yönteme (ler) tarafından 14.
    1. 1 gün Skor plakaları sıralanmış hücrelerin confluency ve sürekli canlılığı onaylamak için.
    2. 3. günün "kırma ile yapışık hemogenic endotel hücre kolonilerinin erken oluşumu kontrolsesi "morfoloji (3 gün morfoloji gösterimi için Goldie ve ark., 11 ve Marcelo ve ark., 12 bakınız).
    3. gün 5 ile 7 - sıralanır hemogenic EC içeren kuyularda yuvarlak HSPC kümelerin oluşumu için kontrol edin. HSPC bir "Arnavut kaldırımı" endotel hücre morfolojisi sergileyen hemogenic EC basık bitişik dikkat edilmelidir.
      Not: Hemogenic endotel hücreleri (hematopoetik koloni sayısı ile belirlenir) hematopoietik koloni oluşturmalıdır, ve (tek bir hücreden çok koloni tiplerinin gözlem ile belirlenen) çok soyundan farklılaşma kapasitesi göstermelidir. Daha önce FACS tarafından alınan hemogenic EC ya da HSPC% 20 farklılaştırılması ve metilselüloz 11 hematopoietik koloni çoğalan oluşturulması için hayatta ~ gözledik.
  6. Faz mikroskobu ile koloni oluşumunu değerlendirmek için:
    1. Görselleştirmek ve düşük büyütme und de kolonileri saymayınGoldie ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi ER bir faz ışık mikroskobu ve koloni morfolojisi ile BFU-E, CFU-GM, ve CFU-GEMM kolonilerini teşhis. 11.
  7. Hücre morfolojisi edilmesi suretiyle koloni oluşumunu değerlendirmek için:
    1. sonu ile P1000 ucu içine metil yüzeyden aspire bireysel koloniler deliği genişletmek için kesilmiş. Bu yapışkan metilselüloz ortamın aspirasyon kolaylaştırır ve koloni başarılı alma sağlamaktadır.
    2. Süspanse 5 dakika boyunca 28 xg'de bir Sitosantrifüj kullanarak bir cam slayt üzerine 200 ml HBSS içine kolonileri ve spin aldı.
    3. 5 dakika için% 100 metanol slaytlar düzeltmek (DİKKAT: Metanol toksik ve sadece uygun havalandırma ve kişisel koruyucu ekipman ile kimyasal kaputu kullanılmalıdır).
    4. 20 dakika (DİKKAT için% 0.04 Giemsa slaytlar Batmak. Giemsa leke metanol içeren uygun havalandırma ve kişi ile bir kimyasal kaput kullanınEl koruyucu ekipman).
    5. deiyonize su slaytlar durulayın.
    6. Montaj klasik metilselüloz ortamda kültürlenir yetişkin kemik iliğinden hematopoietik hücrelerde gözlenen hücre morfolojisini karşılaştıran standart bir ışık mikroskobu altında, yüksek büyütmede lamelleri ve görüntü ile kayar. Örnekler için, üreticinin talimatlarına bakın.
  8. FACS ile hematopoietik kökenli belirteçleri hücre ekspresyonu ile koloni oluşumunu değerlendirmek için:
    1. 0.5 mi metilselüloz kültüre koloni içeren 24 oyuklu plakanın her oyuğuna HBSS 2 ml ilave edilir (örneğin, ticari olarak temin edilebilen hazır metilselüloz 1 seyreltin: 4). yukarı pipet ve aşağı karıştırmak ve taze tüp (ler) transfer.
    2. Standart bir masa üstü mikro santrifüj kullanılarak 4 ° C'de 5 dakika boyunca 2000 x g'de santrifüje örneği.
    3. eğer istenirse örnekleri havuzu, 1 ml HBSS + supernatant ve tekrar süspansiyon hücre pelet (ler) çıkarın.
    4. Santrifüj4 ° C'de 5 dakika boyunca 2000 x g'de, GE örneği.
    5. 400 ul HBSS + supernatant ve tekrar süspansiyon hücre pelet (ler) çıkarın.
    6. Dört 1.5 ml tüpler içine kısım örnek şöyledir: unstained; B220-FITC sadece; GR-1-FITC sadece; Ter119-FITC, sadece.
    7. 2 ug / ml'lik bir nihai konsantrasyona kadar, uygun bir tüp floresan-konjuge antikor ekleyin. 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    8. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 2000 x g'de santrifüje örneği. Süpernatantı ve buz gibi soğuk 0.5 ml HBSS hücre pelletini.
    9. Her hematopoetik soy marker ifade FACS tarafından her bir örnek analiz: B220 B-hücrelerini 20 işaretleri; GR-1 işaretleri miyeloid hücrelerin 21; Ter119 eritroit hücreleri 22 işaretler.
      Not: eğer istenirse, diğer hematopoietik kökenli belirteçleri hedefleme ilave antikorlar, bu yaklaşım dahil edilebilir.

Sonuçlar

Ileri ve yan dağılım (gösterilmemiştir) tarafından standart canlı hücre ve çiftli ayrımcılık ardından Şekil 3. Sundu temsili araziler benzer FACS dağılım araziler verecektir embriyonik YS veya Genel Kurul'dan hemogenic endotel hücreleri ve HSPC Başarılı etiketleme, yan nüfus (SP) olaylar "omuz" olarak Verapamil yokluğunda doğrusal Hoechst Kırmızı Hoechst vs Mavi diferansiyel arsa görüntülendi (non-SP) olaylar (Şekil 3A) çoğunluğu sol-kaymıştır. toplam canlı YS hücrelerinin% 3 ve 3 - - total canlı AGM olayların% 5 SP kapısı düzgün çizilmiş zaman, SP hücreleri yaklaşık 1 temsil edecek. Verapamil tedavisi ne olursa olsun doku kaynağı (Şekil 3A, üst paneller) SP olayları 50> içinde% inhibisyon yol açmalıdır. Biz daha önce SP omuz dışında görünür ama aynı zamanda verapamil tarafından engellenen diğer popülasyonları Ter119 pozitif eritromisin olduğu tespit ettikoblastları ve bu nedenle SP nüfus 5 dışındadır.

SP ile karşılaştırıldığında, sigara SP hücreleri SP "omuz" (Şekil 3A) komşu hücrelerin yoğun küme olarak tanımlanır. Bu nüfus CD45-FITC kızı arsa (Şekil 3B) vs CD31-PE kullanılarak ayırt edilebilir olmayan Hemogenic EC, CD31 olarak + / CD45- olayları içerir. Geri göreli kolaylıkla sıralanabilir AGM (Şekil 3B) ya da yolk kesesi (gösterilmemiştir) ve bu hücrelerin yüksek sayıda olmayan SP hücrelerinin% 5 - Sigara Hemogenic AK genellikle 2 'dir.

HSPC ve Hemogenic AT tanımlanması için, kızı kapıları CD45 + hücreleri, tipik olarak CD45 + ve CD45- hücreleri tanımlayan SP fraksiyondan çizilir (Şekil 3C) veya YS hem de toplam etkinlik% 20 (gösterilmemiştir). Hemogenic EC, daha sonra flk1-PECy7 kızı p vs diferansiyel cKit-APC CD45- hücrelerinden tanımlanırÇok Çift pozitif olaylar gibi, ve tipik olarak 1 temsil eder - AGM (Şekil 3 D) veya YS birinden izole edildiğinde CD45- etkinlikleri% 3 (gösterilmemiştir). HSPC Flk1- / cKit + hücreleri gibi flk1-PECy7 kızı karşılaştırılmaktadır ayrı cKit-APC CD45 + fraksiyondan tanımlanmış ve tipik olarak yaklaşık 25 temsil eder - (ya da YS değil edilen zaman CD45 + hücrelerinin küçük bir nüfusun% 30 gösterilir) veya AGM (Şekil 3 E). Bu protokol, birden çok embriyo doku toplanmış bile, her bir hücre tipinde birkaç yüz dönmek için bu nedenle Hemogenic EC ve HSPC hem oldukça nadirdir (~ toplam hücre olayları% 0.01), ve tipik bir örneğidir. kızı parsellerde Gates, negatif kontrol gruplarına atıfta bulunularak kurulmalıdır. Spesifik ve spesifik olmayan antikor boyama ayırt etmek amacıyla, kapılar, ilk iki boyanmamış kontroller ile referans (Şekil 3'de çizilmelidirFloresan konjuge bir eş izotipli (IgG2a veya IgG2b) kontrol antikorları ile muamele edilmiş C), hem de örnekleri (gösterilmemiştir). Bu işlem kontrol spesifik olmayan boyama biz izotip eşleştirilmiş kontrol antikorları (örn., IgG2a-PE veya IgG2b-FITC) başlangıçta FACS sıralayıcı ayarlarını optimize ve kapı sınırlarını belirlemek için kullanılan öneririz nedenle ederken, bu protokol ile az olduğunu ortaya koymuştur biz de boyanmamış kontroller sıralama rutin FACS sırasında kapı sınırları ve deneysel kalitesini doğrulamak için yeterli olduğunu bulmak. kapıları düzgün çizilmiş ise lekesiz veya izotip eşleştirilmiş kontrollerden kayıt yaparken, en az olumlu dağılım tek veya çift pozitif kapıları dikkat edilmelidir.

AGM ve HSPC gelen Hemogenic endotel hücreleri metilselüloz (Şekil 4A) kültür 14 gün boyunca hematopoietik farklılaşma tabi tutulur. Koloni türünün nispi oranı, tipik olarak, bu gözlenenKültürler doku kaynağı bağlıdır. E10.5 AGM izole hemogenic endotel hücreleri yükselişi CFU ağırlıklı vermek ise BFU-E, CFU-GM ve birkaç CFU-GEMM 5 E8.5-E9.5 doğurup doğurmadığı de yolk kesesi dokularından izole Hemogenic endotel hücreleri, Şekil 4B (üst sol panel) 'de gösterildiği gibi diğer soy hala görülmektedir, ancak -GEMM 12. HSPC bu hücreler aynı zamanda da diğer hematopoetik koloni tiplerinin ayırt edecek, ancak aynı zamanda, metilselüloz kültür üzerine CFU-GEMM ağırlıklı yükselir (Şekil 4B, en iyi, orta panel) elde E10.5 AGM izole edilir. Sigara hemogenic endotel hücreleri (CD31 + / CD45- olmayan SP), aynı zamanda (Şekil 4B, sağ üst panel) kaplama edilmiştir. Bu hücreler 14 gün sonra hematopoetik kültüründe hiçbir büyüme göstermektedir.

ve hematopoietik A ifadesi olmayan hücreler de dahil olmak üzere ayrı ayrı yüzey işaretleyici ifade eden hücre tipleri hematopoietik kapasitesi, TahlillerND endotel belirteçler CD31, flk1, c-Kit, VE-cad E10.5 de AGM SP fraksiyonu içinde, CD41, ve CD45 sınırlıdır yapıldı ve E10.5 AGM bu çok soyundan koloni oluşturan çalışma aktivitesi sergilerler edilmiştir CD31 + 'ya, vE-kaderin + c-Kit + CD41 + ve CD45 + SP hücreleri 12. İlginç bir şekilde, koloni oluşturucu etkinlik her iki Flk-1 + ve FLK-1 SP hücrelerinde tespit edildi, fakat sadece flk1 + c-Kit + CD45- SP hücrelerinin her iki "parke ile karakterize edilen ara endotel tek tabaka ile çok soyundan koloniler açan "endotel hücre morfolojisi (Şekil 4B, sol alt panel) ve Dil-AcLDL alımı 12 ile. Ayrıca, C-Kit sentezlenmesi AGM SP hücreleri 12 hematopoietik aktivitesi için gereklidir.

hemogenic endotel hücreleri ile karşılaştırıldığında bazı miyeloid progenitör içindeki morfolojik özelliklere sahip olduğu gösterilmiştir birlikte, miyeloid progenitör hücreler CD45 ifade ve çok nesilli koloniler oluşturamaz . HSPC da çok soyundan koloniler oluşturur, fakat bu hücrelerin CD45 rağmen, Flk-1 ekspresyonunu 12,23 yoksun olup, altta kalan endotelyal tek tabaka (Şekil 4B, sağ alt panel) dışında yuvarlak hücre kümeleri meydana getirirler. Bu nedenle, nüfus şunlarla kan yapıcı potansiyeli ve sağlam hematoendothelial gen ekspresyonu ile endotel hücreleri temsil (Flk-1 + / c-Kit + / CD45-SP hücreleri ya da) halinde hemogenic endotele tanımlayan GATA-1/2, Lmo2 SCL / Tal-1, Runx-1, c-Kit, hematopoietik kök ve projenitör hücreleri, hem de bunların olmayan hemogenic endotel hücre örneklerinden farklı olan CD34, CD41, ve CD45 11.

figure-results-1
Şekil 1. Genel İş Akışı. Kısaca, embriyolar hamile baraj çıkarılır ve YS veya AGM dokular hasat edilir. Embriyolar, isteğe bağlı olarak 2 kültürlenebilir 4-48 saat, ex vivo doku hasat öncesi. Hasat YS veya AGM dokular kontrol ve numune tüpleri içine örnek olarak, tek bir hücre süspansiyonu ile sindirilmiş ve Hoechst boya ve / veya floresan-konjuge antikor varlığında inkübe edilir. Verapamil, bir kalsiyum kanal engelleyici, aynı zamanda bir SP fraksiyonunun doğru gating doğrulanması için gerekli bir negatif kontrol oluşturmak için kullanılır. Hemogenic endotel hücreleri FACS ile tespit edildiği gibidir flk1 + / cKit + / CD45- SP hücreleri HSPC hücrelerinin Flk1- / cKit + / CD45 + SP fraksiyonu içinde ihtiva ederken; Her iki hücre tipleri hemogenic potansiyelinin onay metilselüloz üzerine sıralanır. CD31 + / CD45- olmayan SP hücreleri. Buna ek olarak, olmayan hemogenic endotel hücreleri ayırt edilebilir (ve eğer istenirse, alınan) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

ŞEKIL 2 "src =" / files / ftp_upload / 54150 / 54150fig2.jpg "/>
YS ve AGM Dokuların Şekil 2. diseksiyonu. A) YS E10.5 embriyo gövde hem ön ayakları ve hindlimb tomurcukları altında yatay kesimler yaparak izole edilir) E8.5 embriyoların uzak disseke ve sonraki sindirim. B steril HBSS + içine bütün yerleştirilir. AGM sonra bacak tomurcukları ve ventral doku kullanarak forseps ayrılır. C) Parlak alan görüntüleri bir E10.5 embriyo (ölçek = 1 mm) hem YS ve AGM diseksiyonu göstermektedir. Büyük halini görmek için tıklayınız bu figür.

figure-results-2
Ayrımcılıkla Kapısı Hiyerarşi gösterilmesi Şekil 3. Temsilcisi ArsalarE8.5 YS'den FACS ile Hemogenic endotel hücre S (flk1 + / cKit + / CD45- SP hücreleri), HSPC (Flk1- / cKit + / CD45 + SP hücreleri) ve olmayan hemogenic Endotel Hücreleri (CD31 + / CD45- olmayan SP) veya E10.5 AGM. canlı ileri tarafından YS (paneller sola) veya AGM (sağ paneller) birinden hücrelerinin hücre ve çiftli ayrımcılık ve yan dağılım (gösterilmemiştir), A) yan nüfus takiben (SP) kapı çizilir ve doğrulandı Verapamil ile tedavi edilen negatif kontrol SP fraksiyonunun önemli bir azalma. olmayan SP nüfus SP bitişik hücrelerin yoğun küme olarak tanımlanır. . Sunulan araziler her 20.000 olaylar B) Sigara hemogenic endotel hücreleri olmayan SP fraksiyonu içinde CD31 + / CD45- hücreleri olarak tanımlanır görüntülenir ve 2 temsil edilmektedir - AGM elde edip olmayan SP hücrelerinin% 5 (gösterilmemiştir ) ya da YS (gösterilmemiştir). ayrımcı içinminate Hemogenic EC veya kız kapıları ya AGM (gösterilmemiştir) ya da YS (gösterilmemiştir) ek kızım kapıları çekilir gelen hemogenic endotelyal hücrelerin tanımlanması için CD45 + ve CD45- hücreleri. D) tanımlamak için SP fraksiyondan çizilir HSPC, C) CD45- fraksiyondan cKit + (cKit- genel) ve (Flk1- karşılaştırma) flk1 + hücreleri ayırt etmek. . E) HSPC cKit + ve Flk1- olarak CD45 + fraksiyondan tespit ve tipik olarak 20 temsil eder CD45- olayların% 3 - - YS veya AGM birinden Hemogenic AK ~ 1 tipik AGM sıralanır olsun CD45 + hücrelerin% 30 (gösterilmemiştir ) ya da YS (gösterilmemiştir). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 4. visuaMetilselüloz. A) metilselüloz üzerine kaplama 7 gün içinde sıralı bireysel hücrelerden Kolonileri formunda Hemogenic Endotel Hücreleri Kültür ve HSPC aşağıdaki Hematopoetik Farklılaşma katmanlara ayrılmasına. Çok soy hematopoetik potansiyeli farklı koloni morfolojileri 11. Gösterilmemiş B) sıralanmış hemogenic EC ve HSPC Genel Kurul'dan (ya da YS Faz mikroskobik görüntüleme,) çok soyundan Hematopoetik göstermek değerlendirilmesi ile tespit birden hematopoetik koloni tipleri gözlem ile teyit edilebilir metilselüloz kültür ortamı içinde 7 günlük bir kültürden sonra, koloni oluşumu. Sigara hemogenic Genel Kurul'dan EC (ya da gösterilmemiş YS) bu koşullar altında büyüme gösteren yok. yüksek büyütmede, klasik "kaldırım taşı" endotelyal hücre morfolojisi (beyaz ok) yapışan hücreler cul hematopoietik hücre kümeleri sebebiyet veren görülebilirhemogenic AT lar,; böyle endotel hücreleri sıralı HSPC (ölçek = 100 mikron) kültürlerinde görülmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

nedeniyle belirli gelişim pencereler boyunca sadece ortaya geçici ve küçük hücre popülasyonlarının okuyan doğasında teknik zorluklar henüz emekleme aşamasında olan bir alanda - hematovascular gelişme alanında pek çok yanıtsız soru vardır kalır. Yukarıda belirtilen tekniklerin hatta tek hemogenic endotel hücre hücreleri ve genellikle en laboratuarları mevcuttur reaktifler ve ekipman kullanılarak kritik gelişim zaman noktalarında embriyonik dokuda HSPC popülasyonlarının izole edilmesi için izin vererek bu zorlukların pek çok iyileştirme. Bizim protokol, daha sonraki analizlerde hemogenic endotel hücre fraksiyonu için kontroller, bağımsız analizler için kullanılabilir, ya da olabilir YS ve AGM olmayan hemogenic endotel hücre fraksiyonları, paralel izolasyonu sağlar.

Bu çok renkli FACS tabanlı yöntem kullanılarak hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu kilit nokta uygun spektral eşmpensation ve tek renkli kapılarının doğru çizimi. Bunun gibi, şiddetle lekesiz ve tek renkli kontrolleri, tüm deneysel çalışan dahil edilmesi tavsiye edilir, ve o - birlikte izotip-eşleştirilmiş kontrol antikorları ile tedavi örnekleri ile - başlangıçta uygun spektral tazminat ve kapıları çizimini kurmak için kullanılabilir. Ancak, spesifik olmayan boyama ve böylece lekesiz ve tek renkli kontrolleri FACS sıralayıcı ayarları optimize edildikten sonra kapıların rutin doğrulanması için yeterli Bu protokol ile düzeydedir.

Yanlış çizilmiş SP kapıları Bu raporda açıklanan yaklaşım ile özel bir endişe vardır. Daha önceki çalışmalar, multipotent kök hücreler FACS ile SP görünüşlerine fizyolojik temelini oluşturan, Hoechst Kırmızı 17 tercih edilen akışını sergilediklerini göstermiştir. Biz hemogenic endotel hücreleri göstermiştir ve HSPC benzer SP hücre fraksiyonu 5,11 içinde bulunur. kalsiyum kanal gibi ilaçlarönleyicisi Verapamil transmembran çoklu ilaç direnci taşıyıcılar çeşitli blokajı ile SP hücrelerinde bu Hoechst boya akış davranışını bloke eder. Hematopoietik kök ve projenitör hücrelerde, bu esas olarak ABCG2 / BCRP1 taşıyıcı 24 aracılığıyla gerçekleşir. Tipik haliyle verapamil SP>% 50 blokaj indükler, ancak görülen Verapamil ile Hoechst efflux genel derecesi ve daha sonraki blokajı bunun nedeni, muhtemelen ayırıcı Hoechst ile birden çok ilaca karşı dirençli taşıyıcı tipleri ekspresyonunu değiştirmek için, gelişim zamanlaması etkilenebilir gösterilmiştir Verapamil 5 akış yeteneği ve duyarlılık. Bu nedenle, güçlü Verapamil ile muamele önerilir Hoechst-lekeli negatif kontrol standart olarak uygun bir SP yolluk sağlamak için dahil edilebilir: Bir SP kapısı doğru çekildiğinde, SP hücrelerinin sayısında kayda değer bir azalma Hoechst ile boyanmış örneklerinde tespit edilmelidir Verapamil varlığı.

Biz daha önce göstermiştir sıralanmış olduğunuE9.5 fare yolk kesesi SP hücrelerinin ~ 80 var - E9.5 unfraksiyone eşleştirilmiş sayısıyla karşılaştırıldığında zaman metilselüloz bazlı hematopoetik kültüründe HSPC oluşturmak için 90 kat daha fazla yetenek, sigara Hoechst bütün YS doku hücrelerini 5 boyandı. SP ileri karakterizasyonu erken hematopoetik ve E8.0 damar gelişimi sırasında fare sarısı kesesinde göstermiştir ki, VE-kaderin ve Flk-1 kayda değer ifadesi, ama kök (c-Kit) ve hematopoetik belirteçlerin düşük ifadesi var (CD45). Böylece, + / CD45- olmayan SP hücreleri baskın Flk-1 + / CD31 olarak tanımlanan bu gelişimsel timepoint, ilkel (non-hemogenic) EC, at. Endotel markör ifade azaltır ve CD45 ve c-kit sentezleme arttıkça, E9.5 ve E11.5 5 ila in vitro HSPC oluşturmak için artan bir yeteneği ile birlikte bu ifade profili geçer. Bu YS doku hematopoetik aktivite E9.5 ve E11.5 ve occurr arasındaki en belirgin hale, SP içinde yer alıyor anlaşılacağıendotel özellikleri ve hematopoetik kapasitesi kademeli edinme zamanlanmış zarara ing. Bu nedenle, SP fenotip doğuran çok ilaca direnç taşıyıcıları ifadesi hemogenic endoteli 5 önemli fenotipik işaretleyici vardır; Aslında, AGM olmayan SP hücreleri, kan-oluşturan potansiyeli 12 göstermezler. Bu nedenle, YS ve AGM hem Hoechst boyama ile SP başarılı izolasyonu (hücre hemogenic ayrımcılık sağlayacak bu bölüm içinde, belirli bir doku, hematopoetik kök hücre bölmesine ve hücrelerin daha sonra antikor boyama ile ilgili kriteri olacağı Flk sağlar -1 + / c-Kit HSPC karşılık + / CD45-) (Flk1- / c-kit + / CD45 +) toplulukları 5,11,12. Ayrıca, daha önce yapılmış yolk kesesi ve AGM dokuların SP içinde CD41 + hücrelerinin metilselüloz bazlı kültürde 11,12 multi-soy koloni oluşumu yeteneğine sahip olduğunu not etmiştir. Bu flk1 + c-Kit + CD45- SP hücresi gibi hemogenic endotel hücrelerini tanımlayanhematopoetik soy belirlenmiş bir belirteci olarak CD45 kullanarak yerine CD41 bizim flk1 ve CD45 bu ifadeyi bularak verilen tarafından s 5,11 neredeyse birbirini dışlayan olduğunu. Bu, her iki endotelyal sahip SP içindeki hücrelerin saf izole edilmesine izin verir (flk-1) ve hematopoietik geçiş endotel için gerekli özelliklere (c-Kit) sapı bu CD45'in yokluğunda belirlendiği gibi olduğu henüz bu değişikliğe uğramamıştır hücreler. Son zamanlarda Gomez ve arkadaşları tarafından rapor gibi CSF1R + (doku makrofaj) ve Csf1r- (HSC) fraksiyon içine Flk-1 / c-Kit + / CD45 + / SP hücreleri olarak tanımlanan HSPC nüfusun alt ayırmasına, dikkate almak yararlı olacaktır 25, bu doku makrofaj progenitör popülasyonları karşı gerçek HSPC büyük çözünürlük sağlayacak, ama bu tecrit biz CSF1R beri belirttiğimiz makrofaj atalarıdır 26 bir belirtecidir hemogenic endotel hücre fraksiyonu bütünlüğünü etkilemez gerektiği gibi.

HemogENIC endotel hücreleri YS ve (1 içeren - endotel hücrelerinin,% 3), AGM hem de nadir bir alt popülasyonu, ve bu nedenle çalışma büyük bir sorun daha sonra uygulamalar için yeterli hücre verim elde edilmiştir. Bu protokol, genellikle% 10-20, hatta en uygun koşullar altında sadece birkaç yüz hücre verebilir sıralama zaman ve birden çok embriyo elde edilen toplanmış dokulardan tipik hemogenic endotel hücre sıralama tarafından canlı kalan hücreler% 70-80 sonuçlanır metilselüloz üreten koloniler içine gömülü hücreler alınır. dokular hızla disseke ve toplanmış olmalı ve numuneler mümkün olduğunda buz üzerinde tutulmalıdır: sıralı hücre sayısını arttırmak için, güçlü araştırmacılar prosedürün her adımda boyunca doku ve hücre canlılığı sağlamak için adımlar tavsiye edilir. Numuneler hemen önce FACS sıralama taze hazırlanmış ve tarif olarak metilselüloz kültürü doğrudan yüksek serum içeriği veya içeren toplama tüpleri içine sıralanması gerektiğiniYukarıda d. canlılık Sorun devam ederse, toplama tüpleri daha da sıralı hücre yaşamını geliştirmek için serum ile ön kaplanabilir. hemogenic endotel hücre verimi düşüktür takdirde yetişkin kemik iliği ya da ticari olarak temin edilebilen florofor eşlenik boncuklar, burada tarif edilen embriyonik doku türevli tek renk kontrol yerine spektral telafisi için kullanılabilmektedir. kriteri hücreler kültür için kullanılacaksa, hemogenic endotelyal hücrelerin ve HSPC, doku kültürü oyuklarını doğrudan sıralanması. kriteri hücreler DNA ya da RNA-ilişkili gen ifade analizi, hemogenic olmayan hemogenic endotel hücreleri ve HSPC yöneliktir Eğer hücre kaybı en aza indirmek için Örnek lizis tamponu ihtiva eden toplama tüpleri içine, doğrudan düzenlenmiş olabilir.

anlatılan teknik, aynı embriyonik dokular başarılı (ve aynı anda) hemogenic olmayan hemogenic endotel hücrelerinin elde edilmesi, hem de HSPC ve olgun kan hücre fraksiyonları izin verir. Bu yaklaşım, daha fazla damızlık sağlarendotel hücreleri kan üretmek olarak meydana kritik geçişleri moleküler temellerinin y. Bu gelişme çalışmalarından elde edilen fi- pluripotent insan hemogenic endotel hücreleri ve HSPC döl üretimini optimize etmek için kullanılabilir ve potansiyel olarak otolog yaygın hematopoetik hastalıkların tedavisi için kök hücreleri olabilir.

Açıklamalar

Bu çalışma hibe HL128064 byNIH desteklenen, HL096360, EB017103 ve BT Yenilikler 15-RMB-YALE-04 KKH için, ve NICHD / NIH T32HD007094 hibe.

Teşekkürler

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DAPT (N-[N-(3,5-Diflorofenasetil)-L-alanil]-S-fenilglisin t-bütil ester)SigmaD5942TOKSİK tahriş edici: Kullanım sırasında göz koruması, maske ve eldiven kullanın.
Emici tezgah alt pediCovidien7134
#5 Düz ForsepsGüzel Bilim Aletleri11251-20
8,5 cm düz makasGüzel Bilim Aletleri14090-09
Isofluran (Isothesia)Henry Schein 50033TOKSİK inhalant: Çeker ocakta kullanın.
100x Penisilin Streptomisin Glutamin (10.000 U/ml Penisilin, 10.000 mg/ml Streptomisin, 29.2 mg/ml L-glutamin) Invitrogen10378016
Tip II KollajenazWorthingtonLS004174
Falcon 70 & # 956; M naylon hücre süzgeciCorningCLS431751
Anti-Fare CD45-FITCeBioscience11-0451-81
Anti-Fare CD31 - PEeBioscience12-0311-81
Anti-Fare Flk-1 PE-CY7BD Pharmingen561259
Hoechst 33342 (bisBenzimide H 33342 trihidroklorür)Sigma14533ZEHİRLİ: tahriş edici. Kullanım sırasında göz koruması ve eldiven giyin. Damıtılmış H2O'da 25 mg / ml'lik stok çözeltisi hazırlayın, alikotları -20 & # 176'da saklayın; Kullanıma hazır olana kadar C.
Verapamil HidroklorürSigma1711202 ZEHİRLİ: tahriş edici. Kullanım sırasında göz koruması, maske ve eldiven kullanın.   % 95 etanol içinde 5 mM (100x) stok çözeltisi hazırlayın. -20 & # 176'da saklayın; Kullanıma hazır olana kadar C 
Falcon 5 ml Yuvarlak Tabanlı Polistiren Test Tüpü, Hücre Süzgeci Çıtçıtlı KapaklıCorning352235
MethoCult GF M3434Kök Hücre Teknolojileri3434Üreticinin talimatlarına göre çözülme ve alikot
Modifiye Giemsa StainSigmaGS500TOKSİK: Metanol içerir - çeker ocakta kullanın ve kullanırken eldiven giyin. Damıtılmış suda% 0.02 çözeltiye seyreltin.
Cytospin SantrifüjThermo ScientificA78300003
Kırpılmış Huni Başlangıç KitiThermo Scientific3120110ile kullanım için sitohuniler, filtre kağıdı, cytoslides ve cytoclips içerir
- FITCBD Pharmingen553088
Anti-Mouse Gr-1-FITCeBioscience11-5931-85
Anti-Fare Ter-119-FITCeBioscience11-5921-85
Gibco Fetal Sığır SerumuThermo Scientific10437-077
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (4.5 g/L)Life Technologies 11965-092
Hank'in Tamponlu Tuz ÇözeltisiÖmrü Teknolojileri 14175-095
Fibronektin kaplı 24 oyuklu doku kültürü plakasıEMD Millipore PIFB24P05
IgG2A-PEBD Pharmingen553930
IgG2B-FITCBD Pharmingen556923
Cytospin santrifüj Anti-Mouse B-220

Kaynaklar

  1. Hirschi, K. K. Hemogenic endothelium during development and beyond. Blood. 119 (21), 4823-4827 (2012).
  2. Boisset, J. C., et al. et al. In vivo imaging of haematopoietic cells emerging from the mouse aortic endothelium. Nature. 464 (7285), 116-120 (2010).
  3. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
  4. Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464 (7285), 112-115 (2010).
  5. Nadin, B. M., Goodell, M. A., Hirschi, K. K. Phenotype and hematopoietic potential of side population cells throughout embryonic development. Blood. 102 (7), 2436-2443 (2003).
  6. Nakano, H., et al. Haemogenic endocardium contributes to transient definitive haematopoiesis. Nat Commun. 4, 1564(2013).
  7. Li, Z., et al. Mouse embryonic head as a site for hematopoietic stem cell development. Cell Stem Cell. 11 (5), 663-675 (2012).
  8. Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
  9. Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
  10. de Bruijn, M. F., Speck, N. A., Peeters, M. C., Dzierzak, E. Definitive hematopoietic stem cells first develop within the major arterial regions of the mouse embryo. Embo J. 19 (11), 2465-2474 (2000).
  11. Goldie, L. C., Lucitti, J. L., Dickinson, M. E., Hirschi, K. K. Cell signaling directing the formation and function of hemogenic endothelium during murine embryogenesis. Blood. 112 (8), 3194-3204 (2008).
  12. Marcelo, K. L., et al. Hemogenic endothelial cell specification requires c-Kit, Notch signaling, and p27-mediated cell-cycle control. Dev Cell. 27 (5), 504-515 (2013).
  13. Tavian, M., et al. Aorta-associated CD34+ hematopoietic cells in the early human embryo. Blood. 87 (1), 67-72 (1996).
  14. Wang, L., et al. Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties. Immunity. 21 (1), 31-41 (2004).
  15. Kelly, M. A., Hirschi, K. K. Signaling Hierarchy Regulating Human Endothelial Cell Development. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (5), 718-724 (2009).
  16. Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).
  17. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  18. Takahashi, M., Osumi, N. The method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system. J Vis Exp. (42), (2010).
  19. Bohnsack, B. L., Lai, L., Dolle, P., Hirschi, K. K. Signaling hierarchy downstream of retinoic acid that independently regulates vascular remodeling and endothelial cell proliferation. Genes Dev. 18 (11), 1345-1358 (2004).
  20. Coffman, R. L., Weissman, I. L. B220: a B cell-specific member of the T200 glycoprotein family. Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).
  21. Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. J Immunol. 151 (5), 2399-2408 (1993).
  22. Kina, T., et al. The monoclonal antibody TER-119 recognizes a molecule associated with glycophorin A and specifically marks the late stages of murine erythroid lineage. British Journal of Haematology. 109 (2), 280-287 (2000).
  23. Jackson, K. A., et al. Regeneration of ischemic cardiac muscle and vascular endothelium by adult stem cells. J Clin Invest. 107 (11), 1395-1402 (2001).
  24. Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors. Blood. 99 (2), 507-512 (2002).
  25. Gomez Perdiguero,, E,, et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
  26. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Akış SitometrisiFloresanla Aktifleşen Hücre AyıklamaDoku DiseksiyonuKollajenaz SindirimiHücre BoyamaYan Popülasyon AnaliziCD31 CD45 MarkörlericKit Flk1 GrafiğiMetilselüloz Deneyi
Fare Embriyonik Hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.