Yöntem makalesi

Etkin Bir Yöntem Dediferansiye Yağ Hücreleri Elde

DOI:

10.3791/54177

⸱

15 Temmuz 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cell Regeneration and Transplantation, School of Medicine, Nihon University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DFAT hücre üretimi için koşulları değiştirdik ve burada bu hücrelerin üretimi için geliştirilmiş bir büyüme ortamının kullanımına ilişkin bilgi veriyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doku mühendisliği ve hücre tedavisi klinik büyük umutlar tutun. Bu bağlamda, bu tür mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), multipotent hücreler, hasar görmüş organ fonksiyonu geri yakın gelecekte tedavi edici kullanılabilir. Bununla birlikte, MKH'lerin ve amplifikasyon çevreleyen verimsizlik izole oldukça invaziv prosedürü dahil olmak üzere birçok teknik sorunlar, şu anda bu tedavi yöntemlerinin potansiyel klinik kullanımını engellemektedir. Burada, dediferansiye yağ hücreleri (DFAT), MSC-benzeri hücrelerin oluşumu için son derece etkili bir yöntem getirmektedir. İlginç bir şekilde, DFAT hücreleri adipojenik, osteojenik ve kondrojenik hücreleri dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerine ayırt edilebilir. diğer gruplar, daha önce olgun adipoz dokudan DFAT hücrelerini oluşturmak için çeşitli yöntemler sunulmuştur olmasına rağmen, bizim yöntem daha etkili DFAT hücreleri üretmek için izin verir. Bu bağlamda, ortaya DFAT kültür ortamı (DCM), FBS% 20 ile desteklenen,% 20 FBS ile takviye edilmiş DMEM den DFAT hücreleri üreten daha etkilidir. Ayrıca, hücre kültürü yöntemi ile üretilen DFAT hücreleri çeşitli doku tiplerine redifferentiated edilebilir. Bu nedenle, doku, farklılaşmadan çalışmaları için çok ilginç ve faydalı model sunulmuştur.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre tedavisi ve doku mühendisliği rejeneratif tıp 1-5 alanında sıcak konulardır. Bu tedavi yöntemleri çok ümit vericidir ederken, çeşitli teknik sorunlar şu anda bunların klinik kullanımını engelleyebilir. Bu bağlamda, iPS hücrelerinin üretiminde olduğu gibi, tüm doku mühendisliği tedavileri hasta güvenliğini korumak için dış gen iletiminin serbest hücreler üretmek gerekir. Buna göre, başarılı insan DFAT hücrelerini 6 üretmek için ilk grup oldu. Birçok diğer araştırma grupları beri daha da modelin yararlılığını vurgulayarak, memeli kökenli 7-9 DFAT hücrelerini oluşturmak için bir yöntem benimsemiştir.

Birkaç çalışma boyunca, hücre kültürü ortamının kalitesi hücre orta içeriğini ayarlayarak değiştirilebilir olduğunu bulduk. Bu bulgu DFAT hücresi üretiminin başarı oranında bir artışa yol açtı ve hücre kalitesini geliştirdi; Her iki kritik faktörlerverimli gelecekte yapılacak klinik araştırmalara üreten hücreleri. Bu bağlamda ve DFAT hücresi üretimi için bir usul (benzer bir orta hücre rekombinant insan insülini, serum albümini, L-glutamik asit, çok yağ asitleri içerir orta, ve kolesterol kök mezenkimal için DCM) geliştirilmiş bir DFAT kültür ortamı içinde ve çoğalma (DKM içeriği hakkında daha fazla bilgi istek üzerine mevcuttur) geliştirildi. Kullanılan bu yöntem, yüksek kaliteli DFAT hücreleri adipojenik, osteojenik ve kondrojenik hücreleri dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinin ayırt yeteneği ile üretilmiştir. Toplamda, bu valide hücre kültürü protokolü DFAT hücrelerinin kalitesini artırır ve hücre terapisi ve doku mühendisliği klinik uygulamaları geliştirmek için oldukça yararlı olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

insan deri altı yağ numuneleri Plastik Cerrahi, Üroloji, Çocuk Cerrahisi ve Nihon Üniversitesi Itabashi Hastanesi (Tokyo, Japonya) Ortopedik Cerrahi Anabilim ameliyat geçiren hastalarda elde edildi. Hastalar yazılı bilgilendirilmiş onam alındı ​​ve Tıp Nihon Üniversitesi Etik Komitesi çalışmayı onayladı.

1. Doku Hazırlanması

  1. laboratuvara ameliyathaneye gelen doku örneği getir.
  2. (-) 5 ml PBS ile adipoz doku Yıkama 1-2 g ve 50 ml bir tüp içinde bir kez oda sıcaklığında (RT) ve 10 cm plastik tabak numuneyi.

2. kollajenaz sindirimi

  1. (-) PBS numune kaldır, steril% 0.1 10 ml, ardından (a / h) bir doku örneği içeren çanak kolajenaz çözeltisi (kollajenaz tip II).
  2. Bu oluşan bir püre ulaşana kadar, yaklaşık olarak 15 dakika süre ile, cerrahi makas ile Doku kıymaEnsi.
  3. Daha sonra,% 0.1 kıyılmış doku bir karıştırıcıda yavaşça sallanarak 50 ml'lik bir tüp içinde 30 dakika boyunca (60 rpm) 37 ° C'de (ağırlık / hacim) kolagenaz çözelti sindirimi.
  4. 50 ml'lik bir tüp içine, 100 um'lik bir filtreden dijeste örnek filtre. Daha sonra, filtre ile% 2 FBS ile takviye edilmiş 10 ml DCM (Malzeme Tablo) geçmektedir.

3. Hücre İzolasyonu

  1. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 100 x g'de filtre hücreleri santrifüjleyin.
  2. DCM, bir 50 ml tüp içinde% 2 FBS ile takviye edilmiş, bu noktada, 5 ml hazırlanması.
  3. Sonra, 1000 ul pipet kullanarak yüzen yağ hücrelerini hazırlamak ve 50 ml'lik bir tüp içeren ortama hücreleri ekleyin.
  4. Daha sonra, hücreleri ile DCM orta karıştırmak için hafifçe 50 ml tüp sallayın.
  5. Daha sonra, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj tüpü.
  6. 18 G iğne ve 20 ml'lik bir şırınga kullanarak tüpün dibinde orta atın.
  7. Sonraki DCM s 10 ml ekleyinToplanan hücreler% 2 FBS ile upplemented.
  8. yavaşça 50 ml tüp sallayarak hücreleri ile DCM karıştırın.
  9. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 100 x g'de tüp santrifüjleyin.

4. Kaplama Hücreler

  1. 12.5 cm şişeye% 20 FBS ile takviye edilmiş, DCM ya da DMEM 41 ml ilave edilir.
  2. Daha sonra, 200 ul pipet şişeye yağ hücrelerinin 40 ul kullanılmıştır.
  3. Ardından,% 20 FBS ile takviye DCM veya DMEM ile şişeyi doldurmak. KRİTİK ADIM: Bu noktada, hücreler ortam boyunca yayılmasının sağlanması. Görme müstakil hücreleri kontrol ve sonradan düz tutmak için bir yuvarlak petri kapağına balon tutun.
  4. Son olarak, inkübatör içinde balon koyun ve 7 gün boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatörü içinde rahatsız bırakın.
  5. inkübasyon bir hafta sonra, şişeyi ters ve DFAT hücreleri kontrol edin. Bu nokta fibrobl başlangıcı 10 tarif edildiği gibi, DFAT hücre üretimi yeterliliğini değerlendirmekAST-benzeri hücreler (DFAT hücreleri) yağ hücrelerinden farklı bölgelerde yer almaktadır.
  6. DCM veya DMEM ekleme 5 mi önceki hücre kültür ortamının çıkarılmasını takiben şişeye% 20 FBS ile takviye edilmiştir. DFAT hücreleri orta değiştirdikten sonra başka bir hafta boyunca büyümeye izin verin.
  7. Bir hücre sayacını kullanarak, çeşitli hücre kültürü koşulları (DMEM vs DCM) kapsamında oluşturulan DFAT hücrelerinin sayısını saymak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, DFAT hücre üretme yöntemi ve araç takımı (Şekil 1) geliştirilmiştir. Bizim yöntem bize DCM ve% 20 FBS (Şekil 2A) ihtiva eden DMEM ortamı her ikisini de kullanarak DFAT hücreleri oluşturmasına olanak sağlar. Bu nedenle, biz DFAT hücrelerini üreten DCM ve DMEM verimliliğini karşılaştırıldı. Bağımsız olarak, adipositlerin sayısına (Şekil 2A ve B), DMEM karşılaştırıldığında, bu bağlamda, DCM, üç kat DFAT hücre ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

, In vitro dediferansiyasyon tavan kültürü olarak bilinen bir süreç geçmesi Olgun adipositler, daha ilkel bir fenotip dönmek ve proliferatif yetenekleri kazanmak olabilir. Bu hücreler dediferansiye yağ (DFAT) hücreleri de ifade edilmektedir. DFAT hücrelerinin multilinaj farklılaşması potansiyeli değerlendirildi. Analiz ve gen ekspresyon analizi DFAT hücreleri TSK 6 ile karşılaştırıldığında oldukça homojen olduğu saptanmıştır akım sitometrisi. Aslında, DFAT hücrelerinin hücre yüzeyi antijeni ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma kısmen Japonya Bilimi Teşvik Derneği'nin (ST261006IP, TM) İleri Araştırma ve Teknolojiden Start-up Oluşturma Programı (START Programı) ve Milli Eğitim, Spor, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı'ndan Özel Üniversitelerde Stratejik Araştırma Vakfı Programı (2014-2019) (S1411018, TM) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
CSTI303-MSC orta CSTI87-671Bu besiyeri metinde DCM olarak tanımlanır
PBS(-)Wako166-23555Mg2+ ve Ca2+
DMEM ortamıGibco11965-092
Fetal SığırSerumu Sigma172012
Kollajenaz tip IISigmaC-6885
MakasTakasago Medical Industry Co., LtdTKZ-F2194-1
ÇalkalayıcıTAITECBioshaker V.BR-36
Falcon Hücre Süzgeci 100 μ mSarı CORNING YAŞAM BİLİMLERİ & nbsp;DL 352360
Şahin 12,5 cm² Mavi Bacalı Vidalı Kapaklı Dikdörtgen Eğimli Boyun Hücre Kültürü ŞişesiCORNING YAŞAM BİLİMLERİ & nbsp;
18 G iğneNIPRO02-002
20 ml Şırınga NIPRO08-753
Z Serisi Sürgü SayacıBECKMAN COULTER383550
içermez 353107

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lanzoni, G., et al. Concise review: clinical programs of stem cell therapies for liver and pancreas. Stem Cells. 31 (10), 2047-2060 (2013).
  2. de Girolamo, L., et al. Mesenchymal stem/stromal cells: a new "cells as drugs" paradigm. Efficacy and critical aspects in cell therapy. Curr. Pharm. Des. 19 (13), 2459-2473 (2013).
  3. Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell. Rev. 7 (2), 269-291 (2011).
  4. Yan, J., Tie, G., Xu, T. Y., Cecchini, K., Messina, L. M. Mesenchymal stem cells as a treatment for peripheral arterial disease: current status and potential impact of type II diabetes on their therapeutic efficacy. Stem Cell. Rev. 9 (3), 360-372 (2013).
  5. Ringden, O., Keating, A. Mesenchymal stromal cells as treatment for chronic GVHD. Bone Marrow Transplant. 46 (2), 163-164 (2011).
  6. Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J. Cell. Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).
  7. Lessard, J., et al. Generation of human adipose stem cells through dedifferentiation of mature adipocytes in ceiling cultures. J. Vis. Exp. (97), (2015).
  8. Lessard, J., et al. Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling. PLoS One. 10 (3), 0122065(2015).
  9. Peng, X., et al. Phenotypic and Functional Properties of Porcine Dedifferentiated Fat Cells during the Long-Term Culture In Vitro. Biomed. Res. Int. 2015, 673651(2015).
  10. Kono, S., Kazama, T., Kano, K., Harada, K., Uechi, M., Matsumoto, T. Phenotypic and functional properties of feline dedifferentiated fat cells and adipose-derived stem cells. Vet. J. 199 (1), 88-96 (2014).
  11. Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

DFAT H creleriKollajenaz DigestyonuDoku zolasyonuH cre K lt r Y ntemiDCM BesiyeriAdipojenik DiferansiyasyonOsteojenik DiferansiyasyonKondrojenik DiferansiyasyonH cre Proliferasyonu

İlgili makaleler