Yöntem makalesi

RNA bağlama proteinlerinin tespiti ile İn Vitro RNA pull-down

DOI:

10.3791/54207

⸱

22 Temmuz 2016

 ,  ,  , 
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School, 2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore, 3Division of Bioengineering, School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir RNA açılan protokolü RNA bağlayıcı proteinlere (RBPS) ve kodlama yapmayan ve kodlama RNA arasındaki etkileşimin saptanması için optimize edilmiştir. androjen reseptörü (AR) için bir RNA fragmanı primer kahverengi adipositlerin lystate onun RBP almak için nasıl kullanılacağını göstermek için bir örnek olarak kullanılmıştır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA bağlayıcı proteinler (RBPS) adipoz gelişiminde ve fonksiyonunda bir düzenleyici bir tabaka olarak ortaya çıkmaktadır. RBPS, hedef mRNA stabilitesi ve dönüşüm etkinliğini etkileyerek transkripsiyon sonrası seviyelerde gen ifadesinin düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır. RNA açılan tekniği yaygın mekanizmasının RBPS 'hem de uzun kodlayıcı olmayan RNA'lar' (lncRNAs) işlevini yatan aydınlatmak için gerekli olan RNA-protein etkileşimlerini incelemek için kullanılmıştır. Ancak, adipositlerde yüksek lipid bolluk bu deneyi yapan bir teknik sorun teşkil etmektedir. İşte detaylı RNA açılan protokol birincil adiposit kültürü için optimize edilmiştir. androjen reseptörün (AR) 3 'çevrilmemiş bölge adiposit lystate gelen, onun RBP ortağı Hür proteini almak nasıl göstermek için bir örnek olarak kullanılan bir adenilat-üridilat zengin elementwas içeren (3'UTR) bir RNA fragmanı. Burada tarif edilen yöntem ile etkileşimini tespit etmek için uygulanabilirRBPS ve kodlayıcı olmayan RNA'lar, hem de arasındaki RBPS ve kodlama RNA.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RBPS hücrelerde, tek veya çift sarmallı RNA bağlanan ve RNA-protein komplekslerinin oluşturulması katılmak proteinlerdir. RBPS mRNA ve uzun kodlamayan RNA'lar (lncRNAs) de dahil olmak üzere RNA türlerinin, çeşitli bağlamak, ve post-transkripsiyonel seviyede nüfuzlarını olabilir. Hem RBPS ve lncRNAs adipoz geliştirme gibi yeni regülatörleri ortaya çıkan ve 1,2,3 işlev görmektedir. özel bir RNA molekülü ve bir ya da daha RBPS arasındaki etkileşimi saptamak için çoğu zaman gerekli olan, RBP- mekanizmasını ve hücresel yolların lncRNA-aracılı düzenlenmesinin anlamak için, ve bazen de bir RNA protein ortakları tam spektrum tespit etmek transkript. Ancak, den....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu çalışma kapsamında ilgi RNA AR 3'UTR'sinden bir parçasıdır.

Biotin-etiketli RNA hazırlanması 1.

  1. RNA elde edilmesi için, bir ticari kit kullanılarak ve imalatçının talimatları 11, aşağıdaki in vitro transkripsiyon ve ardından, PCR ile, T7-ar-oligo, yükseltmek.
    Not: PCR primerleri, Tablo 4'te listelenmiştir: T7-AR-F ve T7-AR-R.
  2. Spesifik olmayan bağlanma kontrol için, in vitro transkripsiyon ve ardından psiCHECK-2 plasmidinden PCR ile ateşböceği lusiferaz (FL) DNA, bir kısmi sekansını yükseltmek.
    Not: PCR primerleri, Tablo 4&....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu tanıtım deneyde, AR RNA fragmanı kendi bağlanma proteini Hur yakalamak için yem olarak kullanılmıştır. Hem Hur proteinine ilgili olmayan bir FL RNA yem ve konjüge edilmemiş boş streptavidin boncuk bir alikosu negatif kontrol olarak görev yapmıştır. RNA-protein etkileşimleri çekirdek veya sitoplazmada ya da oluşabilir ve bu açılan protokolü total veya parçalanmış (nükleer ve sitoplazmik) hücre lizatlarında, ya da uygulanabilir. Western blotting ile proteinlerin analizi 15 ul bölünmemiş.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

lncRNAs ve RBPS ancak bu moleküllerin moleküler mekanizmalar tam olarak anlaşılmamıştır, hastalık ve sağlıkta önemli roller üstlenir. lncRNA molekülleri ile etkileşime proteinlerin tanımlanması düzenleyici mekanizmaların tanıtılması yolunda önemli bir adımdır. RNA açılan deney sistemi ile RBPS zenginleştirilmesi, bir hücre lizatından proteinler seçici streptavidin manyetik taneleri bağlanmış biyo-küçültülmüş RNA yemler kullanılarak elde edilebilir, böylece kompleks etkileşim içinde çözeltisi yakalama dayanır. Böyle cıvı.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser Singapur NRF bursu (NRF-2011NRF-NRFF001-025) yanı sıra CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014) tarafından finanse edildi.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Bu çalışmada kullanılan başlıca malzemeler.
MEGAscript kit  Ambion
Biotin-14-CTP Invitrogen
NucAway döndürme sütunları Ambion
Dynabeads M-280 Streptavidin İnvitrojen
HuR (3A2) fare monoklonal antikoru (sc-5261) Santa Cruz Biyoteknoloji
Keçi anti-fare IgG-HRP (sc-2005)  Santa Cruz Biyoteknoloji
Hypure Moleküler Biyoloji Sınıfı Su (nükleaz içermez);HyClone
Fosfat Tampon Salin (1 kez; PBS)  HyClone
RNaz inhibitörü ve nbsp;Bioline
Proteaz inhibitörü ve nbsp;Sigma
Pfu Turbo DNA polimeraz Agilent Technologies
TRIsure  Bioline
NameCompanyKatalog NumarasıComments
>Bu çalışmada kullanılan başlıca ekipmanlar.
Sorvall Legend Micro 21R santrifüj Thermo Scientific
Sorvall Legend X1R santrifüj ve nbsp;Thermo Scientific
Bio-Rad T100 termal döngüleyici ve nbsp;Bio-Rad
Nanodrop 2000 Thermo Scientific
BOECO döndürücü Multi Bio RS-24 BOECO, Almanya
Protein jel elektroforezi ve lekeleme aparatı Bio-Rad
DynaMag-2 mıknatıs ve nbsp;Yaşam Teknolojileri

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huot, M. É, et al. The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis. Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).
  2. Sun, L., et al. Long noncoding RNAs regulate adipogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Düzeltme

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture
Posted by JoVE Editors on 8/20/2016. Citeable Link.

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

The author list has been updated from:

Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2

1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School

2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore

*These authors contributed equally

to:

Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2

1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School

2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore

3Division of Bioengineering, School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

*These authors contributed equally

Etiketler

In Vitro TranscriptionBiotinylated RNAStreptavidin BeadsCell Lysate PreparationWestern BlottingHuR ProteinAR 3 UTR

İlgili makaleler