Yöntem makalesi

İnsan Tümör ksenogratflarının gelen Fare Hücrelerinin tükenmesi Anlamlı Hedef Hücre Alt Analizi geliştirir

13.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/54259

⸱

29 Temmuz 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1R&D Reagents, Miltenyi Biotec GmbH, 2In vivo Tumorbiology, Oncotest GmbH

Bu makalede

Özet

Insan tümör ksenograftlarının vaskülarize ve in vivo olarak büyüme aşamasında, fare kökenli hücreleri tarafından filtre edilemeyen bulunmaktadır. aşağı analizi sırasında bu kirletici hücrelerinin neden olduğu önyargı aşmak için, biz manyetik hücre sıralama tarafından tüm fare hücrelerinin kapsamlı tükenmesi için izin veren bir yöntem geliştirdi.

Özet

Kanser araştırmaları için in vitro hücre çizgisi modellerinin kullanımı yararlı bir araç olmuştur. Bununla birlikte, bu modeller güvenilir bir şekilde çeşitli deneyleri 1 hasta tümörleri taklit etmek için başarısız olduğu gösterilmiştir. Insan tümör ksenogrefleri tümör biyolojisi, ilaç keşfi ve metastaz araştırması 2-4 göre altın standardını temsil etmektedir. Tümör ksenograftlarının tümör hücre çizgileri, primer hastanın tümör 4 ya da seri transplante tümörlerin tümör dokusu gibi farklı malzeme türlerinden elde edilebilir. In vivo yayılır zaman ksenogreflenmiş doku sızmış ve fare kökenli hücreler tarafından vaskülarize edilir. Tümör varlık olarak birden fazla faktör, transplantasyon Aşılanmış malzeme, büyüme hızı ve bölgenin kökeni bileşimini ve tümör xenogreftler mevcut fare hücrelerinin miktarını etkiler. Bununla birlikte, bu faktörler sabit tutulduğu zaman bile, fare hücre kirlenme derecesi oldukça değişkendir.

Contaminating fare hücreleri önemli ölçüde insan tümör ksenograftlarının alt analizler bozar. Fare fibroblastlar yüksek kaplama etkinliklerinin ve çoğalma oranları gösterdiği gibi özellikle yavaş subpopülasyonunun çoğalan insan tümör hücreleri kültürleri büyümek eğilimindedir. Fare hücre DNA, mRNA türevi, ve protein bileşenlerinin kutuplanacağını, aşağı doğru gen ifade analizi, yeni nesil dizi, hem de proteom analizi 5. Bu sınırlamaları aşmak için, ksenogreflenmiş tümör dokusundan el değmemiş insan tümör hücreleri izole etmek için hızlı ve kolay bir yöntem geliştirdik. Bu prosedür, tezgah üstü, doku ayrıştırıcı ve manyetik hücre sıralama ile otomatik bir doku ayrışmasını birleştirerek Fare kaynaklı hücreler kapsamlı tükenmesi dayanmaktadır. Burada, insan hedef hücreler tümör tipinden bağımsız az 20 dakika içinde saflık daha yüksek,% 96 elde edilebilir olabilir göstermektedir.

Giriş

Katı insan tümörleri çok fizyolojik ve neoplastik hücre tipleri içerir. Onlar karmaşık biyolojik yapıları ile heterojen dokuları oluştururlar. Biyolojik tümör oluşumu, ilerlemesi gibi süreçler ve tedaviler doğru yanıtları henüz tam olarak anlaşılamamıştır. In vitro hücre kültürü modelleri incelemek ve tümör biyolojisi anlamak için yararlı bir araç temsil etmektedir. Ancak, yalnızca kısmen tümör dokularında bulunan yapıları ve süreçleri yansıtabilirsiniz. Güvenilir ve istikrarlı preklinik insan tümör modelleri anti-tümör ilaçların ve tedavilerin 4,6 gelişmesi yanı sıra tümör biyolojisi ve tümör hücreleri ve bunların çevre etkileşimini anlamak için bir önkoşuldur.

Birincil hasta tümörlerinden türetilmiş beşeri tümör ksenogreft modelinde ilaç 7 mikro çevresel yapılar, metastatik potansiyelin ve yanıtları yüksek histolojik mimari için kaynak dokuya ilişkileri etkileşimleri gösterir . Tümör ksenograftlarının nedenle, in vitro hücre kültürü modelleri ile karşılaştırıldığında en çok deneylerde daha geçerliliği gösteren kültürlenmiş hücreler veya hücre çizgileri daha yakından hasta tümörleri taklit türetilen bile. Bu özellikler onları klinik öncesi modellerde 4 altın standart olun. Kanser araştırmalarında uygulanması yanı sıra, fareler, insan hücreleri ksenonakli de sık bir hedef popülasyon, 8 stemness ve farklılaşma potansiyelini belirlemek için kök hücre araştırma kullanılır.

Bu, insan mikrovaskuleterini gösterilmiştir ve insan bağışıklık hücreleri, insan tümörlerinin 2,9 in vivo yayılması sırasında değiştirilir. Böyle transplantasyon tümör alt tipi, büyüme oranı ve bölgenin gibi faktörler önemli sızma küresel düzeyde etkileri yanı sıra bulundu fare hücre tiplerinin bileşime sahip. Bununla birlikte, bu faktörler sabit tutulduğu zaman bile, miktarı ve fare hücreleri bileşimi oldukça değişkendir.

ksenogreflenmiş dokuların Mansap analizleri genellikle fare kökenli hücreler tarafından zorlanmaktadır. xenografts insan tümör hücrelerinin primer kültürleri sık fibroblastlar tarafından büyümüş. In vitro olarak tümör hücresi hatlarının üretilmesini engelleyen Bunun yanı sıra, bu gibi ilaç sitotoksisite testi veya farmakokinetik gibi akış aşağı deneyler Fare hücreleri kirletici çoğu durumda imkansız kaynaklanan etkileri siliko düzeltme yana bastırılmaktadır. Bunun ötesinde, fare fibroblastlar ve insan tümör hücreleri arasındaki tek kısmen açıklığa cross-talk çalışmalarının 10 deneysel sonuçları üzerinde doğrudan etkisi vardır. Ayrıca, fare hücrelerini infiltre en yaygın öngörülemeyen varyasyon doğru moleküler aşağı analiz ağırlaştırmaktadır. NGS veya proteom doğrudan sıralama duyarlılığını azaltan bir insan tümör sinyalinin yerine ölçülen her bir fare kaynaklı sinyal analiz eder. Ayrıca mikroarray tabanlı ifade analizleri fare MBK tarafından meydanLeic asitler insan prob muhtemelen çapraz hibritleşme.

farklı yaklaşımlar önerilmiştir ksenograft modelleri insan tümör hücrelerinin alt analizler fare hücreleri kirletici engelleri aşmak için. Birçok çalışmada alt analiz için arzu edilen hedef hücreler özel olarak insan tümör hücreleri üzerinde ifade işaretleri veya belirteçlerin birleşimlerin değerlendirilmesi yolu ile izole edilir. Bununla birlikte, insan tümör hücreleri pozitif tanımlanması için güvenilir bir belirteç olmaması sık büyük bir engel oluşturmaktadır. Bu tür insan karsinom üzerinde EpCAM bile geniş ifade belirteçler, sık sık tümör içsel ifade farkları 11 göstermektedir. Bu düşük ifade subpopülasyonunun, örneğin, tümör hücreleri, izolasyon sırasında epitel-to-mezenkimal geçiş kaybolur geçirmiş riskini artırır. Buna ek olarak, bir hedef hücreye bir seçim ajanı doğrudan bağlanma daha sonra analiz sonuçlarını etkileyebilir. fare hücrelerini tüketen girişimlerimurin CD45 ve MHC sınıf I epitop için spesifik antikorların bir kombinasyonu kullanılarak da 12 yapılmıştır. Bununla birlikte, bu markör kombinasyonu yalnızca fare hücrelerinin bir alt kümesini tespit eder. Başka bir yaklaşım yazılım tarafından analiz süreçleri geliştirmektir. Bununla birlikte, bütün bu yaklaşımlar da deney düzeneği herhangi bir ya da her türlü tümör taraf ve nakli yöntemi için uygun değildir.

Bu çalışmada kapsamlı fare zorlanma ve menşe doku bağımsız ksenogreflenmiş dokulardan fare hücreleri tüketen bir roman ve hızlı bir yöntem sunar. (Deri, akciğer, beyin, böbrek, iskelet kas dahil olmak üzere), ksenograftlarının nakli için birden fazla hedef organ ve dokularda gösterimleri olarak kapsamlı olarak, fare hücrelerinin tespit edilmesi için izin antikor kombinasyonu tespit mümkün. Bu antikorlar, süperparamanyetik partiküllere bağlı titre ve manyetik hücre sınıflandırma ile tükenmesi için optimize edildi. Sadece fareye özgüantikorlar, insan hedef hücreler "el değmemiş" kalmak kullanılır ve metot ksenonakledilmiş tümör dokusu ile sınırlı değildir. ksenogreflenmiş tümör örnekleri standartlaştıran ve insan tümör hücreleri kültürleri kolaylaştırır biz o kapsamlı kaldırma fare hücrelerini göstermektedir. Ayrıca, yeni nesil dizilemesi, insan tümör ksenograftlarının analizi önemli ölçüde geliştirilmiş olduğunu göstermektedir. İnsan dizisi, belirli bir seçim exome zenginleştirme sırasında gerçekleştirilen edilmiş olmasına rağmen bu etki gözlenmiştir gibi, tüm genom ve bütün transcriptome sekanslama etkileyen daha da belirgin olması beklenmektedir. Birlikte ele alındığında, bu yeni yöntem ile fare hücreleri uzaklaştırılması insan tümör hücrelerinin ekimi basitleştirmekte ve insan tümör ksenograftlarının alt analizler geliştirir.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri Regierungspräsidium Freiburg Referat 35 yerel etik ve yasal kurallara uygun olarak yapıldı.

1. Reaktif Hazırlama

NOT: Deneye başlamadan önce, ayrışma kiti aşağıdaki reaktifler hazırlamak:

  1. Enzim lH RPMI 1640 Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) veya Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM), 3 ml liyofilize toz, her şişe çözülür hazırlamak. 20 ° C için 6 aya kadar - tekrarlanan donmasını önlemek ve çözme uygun alikotları (örneğin, 200 ul) hazırlamak ve onları saklamak için.
  2. Enzim R RPMI veya DMEM ortamı 2.7 ml liyofilize toz şişesini çözülür hazırlamak. 20 ° C için 6 aya kadar - tekrarlanan donmasını önlemek ve çözme uygun alikotları (örneğin, 100 ul) hazırlamak ve onları saklamak için.
  3. v çözülür enzim A hazırlamak içinTampon A 1 ml liyofilize tozun ial vorteks olmayan kit ile birlikte. (. Örneğin, 25 ul) - 6 aya kadar 20 ° C'de tekrarlanan donma ve çözülme uygun alikotları hazırlamak önlemek ve onları saklamak için. İyice gerekli reaksiyon hacmi çekilmesi hemen önce bu süspansiyonu karıştırmak için emin olun.
  4. hücre ayırma işlemleri ve antikor boyama 250 ml tampon (1 x PBS,% 0.5 BSA ile) hazırlayın.
    Not: fare hücreleri çıkarılmasından sonra kültür hücreleri, 0.22 um'lik bir filtreden Tüm tamponlar ve enzim çözeltisi filtre zaman.

2. Tümör Ayrılma Protokolü

NOT: Bu çalışmada, küçük hücreli olmayan akciğer kanseri (NSCLC), hasta türetilmiş ksenograftlarda, böbrek kanseri ve mesane kullanılmıştır. Daha önce tarif edildiği gibi 13 6 haftalık dişi NMRI nu / nu farelerinin - tümörler 4, küçük hücreli olmayan akciğer kanseri ksenograftları (NSCLC), böbrek kanseri ve mesane implante tarafından oluşturulan Yukarı.
NOT: Bu protokol, tümör tipinin tamamen bağımsız olduğu için, protokol değişikliğe gerek olmadan hasta ya da hücre hattı kaynaklı tümör ve ayrıca insan ksenonakledilmiş doku diğer tip her türlü de kullanılabilir.

  1. (Yeni hücresel ayrıştırma tüpüne enzimi H 4.7 RPMI 1640 ya da DMEM mi, 200 ul enzim R 100 ul, ve enzim, 25 ul ekleyerek (1 g kadar) doku numunesi başına sindirim karışımı 5 ml hazırlanması C Tüp). iyice gerekli hacmin çekilmeden önce enzim R süspansiyonu karıştırmak için emin olun.
  2. anestezi altında servikal dislokasyon ile hayvanlar feda. % 80 h / h etanol ile az miktarda püskürtme ile fare dezenfekte.
  3. Bir doku kültürü kaputu forseps ve makas kullanılarak fare kanadını Hasat deri altı tümör. makas kullanılarak tümörün yerine açık cilt kesmek ve daha sonra forseps ve makas kullanılarak komşu sağlıklı dokudan tümör ayırın.
    NOT: amacı olarakDeneme aseptik koşullarda bu ve aşağıdaki adımları uygulayın. Bu çalışmada, tüm adımları hücrelerin kültive edilmesi için mümkün üzere aseptik şartlar altında, bir hücre kültürü kaputu gerçekleştirilmiştir.
  4. forseps ve bir neşter kullanarak uzak keserek (bu azalma canlılığı neden olur gibi) ve nekrotik alanlar (bu örnek şamandıra yapacak gibi) yağ kaldırarak sindirim tümör örneği hazırlayın. neşter ve forseps kullanılarak 4 mm - 2 parçalar halinde doku Kıyma.
  5. sindirim karışımı içeren C Tüp doku parçaları aktarın.
  6. C Tüp kapatın ve sıkıca kapalı olduğundan emin olun. başaşağı benchtop doku dissociator koluna üzerine takın ve doku parçaları rotor / stator bölgede yer olduğundan emin olun.
  7. "Yukarı" tuşuna basarak veya "aşağı" düğmesi modu görülünceye kadar ve daha sonra "start" düğmesine basarak modu "h_tumor_01" seçiniz.
    1. Eğer senbenchtop doku dissociator ısıtma fonksiyonunu şarkı, aynı zamanda ısıtıcı takmak için emin olun. Sonra klasör "Miltenyi" görünene kadar dokunmatik ekranda klasör simgesini tıklayarak (sert tümörler için) mod (orta tümörlerde) (yumuşak tümörlerde) 37C_h_TDK_1, 37C_h_TDK_2 veya 37C_h_TDK_3 çalıştırın.
    2. modunu seçmek için, yukarı veya 37C_h_TDK_2 vurgulanır ayrışma modunda kadar aşağı ok tıklayın. benchtop doku dissociator kolları cihazınızın ekranında pozisyonları olarak tasvir edilir. Numuneler dokunmatik ekranda bunları tıklayarak çalıştırıldığında pozisyonu seçin. Basın modunda çalıştırın ve adım 2.16 ile devam etmek için "start".
      NOT: Tümör tipine bağlı olarak başka ayrışma programı (adım 2.7.1 bakınız) uygun olabilir.
  8. Ekranda "programı Sonlandırma" gösteren bir pencere gözlemleyin. Programın sona ermesinden sonra, tezgah üstü doku dissociator C Tüp ayırın.
  9. 37 ° C'de 30 dakika boyunca örnek inkübeBir tüp rotator kullanarak, örneğin sürekli dönme altında ° C.
  10. inkübasyondan sonra benchtop doku dissociator koluna üzerine ters C Tüp ekleyin. Yine örnek malzeme rotor / stator bölgede yer olduğundan emin olun.
  11. Aşama 2.7.1 tarif edildiği gibi (sert tümörler için) ayrışma programı (yumuşak ve orta tümörlerde) h_tumor_02 ya h_tumor_01 çalıştırın.
  12. Programın sona ermesinden sonra, tezgah üstü doku dissociator C Tüp ayırın.
  13. sürekli dönme altında 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika boyunca örnek inkübe edin.
  14. kuluçkadan sonra benchtop doku dissociator koluna üzerine ters C Tüp takın. Yine örnek malzeme rotor / stator bölgede yer olduğundan emin olun.
  15. Aşama 2.7 de tarif edildiği gibi (sert tümörler için) ayrışma programı (orta tümörlerde) (yumuşak tümörlerde) h_tumor_03, h_tumor_02 ya h_tumor_01 çalıştırın.
  16. Tüp altındaki numune malzeme toplamak için bir sho gerçekleştirmek(10 sn 100 xg) rt santrifüj adım.
  17. hücrelerin yeniden süspanse edin ve 50 ml'lik bir tüp yerleştirilir 70 um nesh boyutu olan bir hücre süzgecinden için de geçerlidir. RPMI 1640 ya da DMEM, 20 ml hücre süzgeci yıkayın.
  18. 7 dakika boyunca 300 xg'de Santrifüj hücre süspansiyonu. Aspire tamamen süpernatanlarına.
  19. sayımı için olan 5 ml tampon içinde süspanse hücreleri. Manyetik hücre ayırma (bölüm 3) Mouse hücresi kaybı ile devam edin.

Manyetik Hücre Ayırma Teknoloji tarafından 3. Fare Hücre tükenmesi

Not: Aşağıda verilen manyetik etiketleme için hacimlerinin X 02-10 Haziran, tümör hücreleri veya kırmızı kan hücreleri de dahil olmak üzere 10 toplam 7 hücreleri için bulunmaktadır. Tümör boyutuna bağlı olarak daha düşük ya da daha yüksek hücre sayısı elde edilir. belirtildiği gibi daha az hücre olması halinde, aynı hacimler kullanın. Yüksek hücre sayıları kullanırken, buna göre (tüm reaktif hacimlerini ve toplam hacimleri büyütmek örneğin, 4 x 10 6 tümör hücrelerinin ya da 2 x 10 için 7 toplam hücre, gösterilen tüm reaktif hacimleri ve toplam hacimleri) iki katı hacim kullanın.

  1. sayım için bir mikroskop ve uygun odasını kullanarak adımda 2.21 hücre süspansiyonu gelen bir kısım hücre sayısını belirlemek.
    NOT: Bu hücre süspansiyonu, insan tümör hücrelerinin heterojen bir karışım oluşur alanına hem de, kırmızı kan hücreleri de dahil olmak üzere, fare stromal ve kan hücreleri, 'de. Hücrelerin kompozisyonu güçlü nakli için tümör tipine ve bölgeye göre değişir.
  2. fare hücrelerinin çıkarılması bir lekesiz ve iki tek renk kontrolü boyama en akış sitometri analizi için uygun tüplere 100 ul alikotları çekilme sonra akım sitometri analizi yaparken. Daha fazla boyama adımlar (bölüm 4) kadar 8 ° C - 2 buzdolabında saklayın.
  3. 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin hücre süspansiyonu. süpernatant atın.
  4. 2 x 10 6 tümör hücrelerinin ya da 10 7 başına tampon 80 ul tekrar süspansiyon hücre peletToplam hücreler, fare hücreleri manyetik işaretleme ayıracı 20 ul ekle.
  5. İyice karıştırın ve buzdolabında 15 dakika boyunca inkübe edin (2-8 ° C). Manyetik etiketleme sırasında, uygun bir mıknatısın manyetik alanına yerleştirerek, manyetik ayırma için büyük ölçekli sütunları (LS sütunlar) hazırlamak üreticinin protokolüne göre (Malzeme ve Ekipman Tablo). tampon 3 ml sütun durulayın.
  6. 10 x 2 ila 6 tümör hücrelerinin ya da 10 7 toplam hücre kadar tampon kullanarak 500 ul numune ses seviyesini ayarlayın. (7 10 x 1, tümör hücrelerinin Yukarı veya 5 x 10 7 toplam hücreleri bir LS sütun üzerinde işlenebilir kadar. Daha fazla hücreleri ile çalışırken birden LS Kolonlar üzerine örnek bölünmüş).
    1. akım sitometri analizi, moleküler analizlere ya da kültürlerde kesirler karşılaştırırken, sıralanmamış örnek olarak 50 ul tablet çekin. daha sonra işlenene kadar 8 ° C - 2 bir buzdolabında saklayın.
  7. Daha önce hazırlanan kolona hücre süspansiyonu 500 ul uygulanır. , Etiketsiz hedef hücreleri içeren zenginleştirilmiş insan tümör hücrelerini temsil eden flow-through toplayın.
    Not: 3.5 bir kolona uygulanabilir adıma göre hazırlanmıştır hücre süspansiyonunun 2.5 ml'ye kadar daha yüksek hücre sayıları ile çalışırken.
  8. tampon maddesinin 2 x 1 ml sütun yıkayın. geçmesine hücreleri toplamak ve adım 3,6 akış-through ile birleştirir. en kısa sürede sütun rezervuar boş olarak 1 ml tampon hacimde ekleyerek yıkama adımları uygulayın.
    NOT: flow-through saflaştırılmış insan tümör hücreleri içerir.
  9. Ayrıca sütunda tutulan fare hücreleri toplamak için, ayırıcıdan sütunu kaldırmak ve uygun bir tüp üzerine yerleştirin. tampon 3 ml kolonuna ve hemen Pipet sıkıca sütuna iterek fare hücreleri temizlemek için dalgıç kullanın.
  10. 10 dakika boyunca 300 xg'de kesirler ve kontrol örnekleri aşağı doğru döndürün. aspire supeistenilen çıkış uygulamaya bağlı olarak, tamamen rnatant ve tampon, kültür ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri ya da sıvı nitrojen içerisinde pelet dondurma.

4. Alt Analizler

  1. Akım sitometri analizi için boyama
    NOT: Daha fazla aşağı analiz yapmadan önce, fare hücre tükenmesi prosedürü elde edilen hücrelerin bir kısmı analiz edilebilir akım sitometri (örneğin, saflık ve verim değerlendirmek).
    1. akış sitometrik analiz için, 10 dakika boyunca 300 x g'de, negatif ve pozitif manyetik hücre ayrıştırma yöntemi (bölüm 3) elde edilen fraksiyon olarak aşama 3.2 kontrol numuneleri ve 3.5 arasında en az% 10 döndürür.
    2. süpernatant atın. tampon 90 ul adım 3.2 boyama Kontrol numunelerinin hücre pelletini. tampon 80 ul Manyetik Hücre Ayırma prosedüründen elde edilen fraksiyonların yeniden süspanse edin.
    3. Tüm fare FcR Engelleme Reaktif 10 ul ekleyinörnekler. İyice karıştırın ve 2 de 5 dakika boyunca inkübe - bir buzdolabında 8 ° C'de.
    4. anti-insan EpCAM-PE 10 ul ilave edin ve anti-fare-APC kokteyl 25 ul (antikor 1:10 seyreltme eşittir) (1 antikor seyreltme eşittir: 4) 3. bölümde örnekler Anti 10 ul ekle tek bir renk kontrol numunesine -insan EpCAM-PE ve anti-insan EpCAM-APC 10 ul (1:10 antikor seyreltme eşittir) (antikor 1:10 seyreltme eşittir). Tüm örnekler karıştırın ve 2 'de 10 dakika boyunca inkübe - bir buzdolabında 8 ° C'de.
      Not: EpCAM bir tümör tipinin tümör hücresi markeri olarak uygun değildir. Bu çalışmada EpCAM ifadesinde kullanılan tümörler için biliniyordu.
    5. Örnekleri yıkayın 5 dakika boyunca 300 xg'de tampon her ve spin 1 ml ekleyin.
    6. Süpernatantı atın ve akım sitometri analizi için bir konsantrasyon hücre pelletini. ölü hücreler propidium iyodür (/ ml 1 ug) eklemek dışlamak için.
    7. Uygun bir f kullanarak akım sitometri analizi gerçekleştirmeküreticinin protokollerine göre düşük sitometresinde.
  2. İnsan tümör hücreleri yetiştirme
    Not: Ayrıca akış sitometrisi için, ayırma prosedüründen elde edilen hücreler kültürlendi ve in vitro olarak başka analizler için de kullanılabilmektedir.
    1. 5 x 10 5 hücre / ml 'lik bir konsantrasyona kadar bir kültür ortamı içinde bölümünde 3 kriteri fraksiyonu yeniden süspanse edin.
      Tümör tipi kaplama, uygun tohumlama yoğunluğuna bağlı olarak, ve yetiştirme koşulları farklı olabilir: NOT.
    2. % 0.1 jelatin ile kaplanmış 24 çukurlu bir levhanın çukurlarına hücre süspansiyonu 500 ul ekle.
    3. 37 ° C'de ve% 5 bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe hücreleri.
      NOT: Optimal kültür koşulları kullanılan tümör türüne bağlıdır. Bu nedenle, kullanılan tümör tipine uygun kültür koşulları geçerlidir.
  3. Kültür Hücrelerinin İmmünofloresan Boyama
    1. % 10 FCS ve% 0.1 ilave edilerek bloke etme çözeltisi hazırlayınTriton X-100 PBS 1x.
    2. Atın kültür ortamı. Hücreleri yıkamak için oyuk başına 1 x 500 ul PBS ilave edin. Oda sıcaklığında (RT), 2 dakika süreyle inkübe edin, daha sonra tamamen 1x PBS atın.
    3. % 4 PFA çözeltisi 300 ul ekleyerek hücreleri sabitleyin. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    4. PFA çözüm atın. Adım 4.3.2 de belirtildiği gibi sabit hücreler 3 kez yıkayın.
    5. kuyu başına engelleme 300 ul ekleyerek permeabilization ve engelleme gerçekleştirin. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    6. çözümü engelleme atın. Adım 4.3.2 de belirtildiği gibi hücreleri yıkayın.
    7. hücrelere çözüm engelleme seyreltilmiş primer antikor 300 ul ekleyin. 200: EpCAM antikoru 1:40 seyreltilir anti-insan, vimentin antikoru 1 seyreltilmiştir. 8 ° C - 2 gece boyunca inkübe.
      Not: EpCAM tümör hücreleri tarafından eksprese edilen tümör hücreleri ve / veya vimentin eksprese olabilir olarak kullanılan antikorlar, herhangi bir tümör tipi için uygun değildir. Kullanılan antikorlar ksenograft mo için uygun olduğundan emin olundel.
    8. Primer antikor çözüm atın. Adım 4.3.2 de belirtildiği gibi Hücreleri 3 kez yıkayın.
    9. hücrelere çözüm engelleme seyreltilmiş ikincil antikor 300 ul ekleyin. 400: Her iki antikor, bir anti-tavşan IgG-Alexe594 ve anti-fare IgG-Alexa488 1 seyreltilir. Oda sıcaklığında, karanlıkta, 1 saat boyunca inkübe edilir.
    10. ikincil antikor çözüm atın. Adım 4.3.2 de belirtildiği gibi Hücreleri 2 kez yıkayın.
    11. Her bir oyuğa DAPI çözeltisinin 300 ul (0.1 ug / ml) eklenir. Oda sıcaklığında, karanlıkta, 10 dakika boyunca inkübe edin.
    12. DAPI çözüm atın. Adım 4.3.2 de belirtildiği gibi Hücreleri 3 kez yıkayın.
    13. Her bir oyuğa 1x 500 ul PBS ilave edin. Uygun bir mikroskop kullanılarak floresan mikroskobu gerçekleştirin.
  4. Tüm exome Dizi
    1. sıvı nitrojen içinde aşama 3.9 Tüm exome sekanslama (WES) dondurularak topaklar üretilir. Mağaza ve -80 ° C'de örnekleri toplamak.
    2. Hücreleri topladıktan sonra, exome yakalama ve tüm exome seq gerçekleştirmekİlgili kitinin üreticinin talimatlarına uygun olarak uencing (Malzeme ve Ekipman Tablo).

Sonuçlar

Farklı yaklaşımlar, örneğin, aşılanmış insan tümörlerinin fare hücreleri tanımlamak veya tüketmek Ancak, fare hücrelerinin sadece alt popülasyonlar önerilen kombine CD45 tespit ise, bu kombinasyonları kullanılarak tespit edildi CD45 ve MHC sınıf I karşı fare özgü antikorların bir kombinasyonu önerilmiştir ve MHC sınıf I, fare hücrelerinin yanı sıra nakli için hedef dokularda bulunan fare hücreleri kalan ifade (Şekil 1). Manyetik hücre sıralama için antikorların bu yeni kombinasyonu kullanarak, insan tümör hücreleri, tümör tipine (Şekil 2) bağımsız olarak izole edildi.

Manyetik Hücre Ayırma işlemi bazlı fare hücre çıkarılması elde edilen hücreler, insan tümör hücrelerinde (Şekil 4) saf kültürleri yol kültürlenmiş olabilir. Buna ek olarak, uygun bir fare hücreleri elde edilebilir ve kültürlerindeAynı örnek. Fare hücreleri çıkarılması yanı sıra, çöp fare hücre tükenmesi (MCD) (Şekil 3) üzerine uzaklaştırılmıştır.

gelişmiş moleküler aşağı analizlere kapsamlı fare hücrelerinin tükenmesi yanı sıra enkaz kaldırma kurşun. Bu üç farklı hasta türetilmiş ksenograft tümör modellerinde (- 9 Şekil 5) dökme tümör parçaları ve fare hücre tükenmiş numuneler üzerinde gerçekleştirilen bütün exome sekanslama (WES) elde edilen sonuçların karşılaştırılması ile gösterilmiştir. Veri ksenograft tümör örnekleri Wes gerçekleştirmeden önce fare hücreleri çıkarılması sadece belirgin bir şekilde (Şekil 5) okur toplam miktarı artar, ancak, aynı zamanda önemli ölçüde ev sahibi sayısı, insan referans genom, (Şekil 6B) eşlenmiş okur türetilmiş azalttığını göstermektedir. Bu yanlışlıkla eşlenen fare sık sık SNP arama müdahale okuma olarak, biz yanlış tahmin güçlü bir azalma gözlendiSNP MCD sonra (Şekil 7-8). Son olarak, biz kökenli türlerin bir sekans tabanlı atama tüm okur için mümkün değildi fare kaynaklı in silico çıkarılması, tamamen deneysel prosedür yerini alamadıklarını biyoinformatik yöntemlerle okur olduğunu gösterdi. Ayrıca, siliko prosedüründe olabilir gelişmiş kalite ve in vitro tükenmiş örneklerin birlikte yüksek okuma kapsama (Şekil 9) için doğru değil.

figure-results-1
Deri, akciğer, beyin, böbrek, iskelet kas dahil olmak üzere birden çok organ, birçok organı 14. Screening boyunca tüm fare hücreleri tanıyan bir antikordan Kokteyli oluşturulması Şekil 1, gerçekleştirilmiştir. Bu organlar Ksenonakilden için ana hedef dokuları temsil eder. Böyle olanlar tanıma mou olarak kombinasyonlarSE CD45 ve MHC sınıf I epitoplar önce Ksenonakilden sonra fare hücreleri yok etmek üzere kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu markör kombinasyonu analiz edilen tüm dokularda, fare hücrelerinin sadece bir alt kümesini tanıdı. Önceki gösterimleri beş antikorların bir kombinasyonu, fare kökenli tüm hücrelerin kapsamlı saptanması için izin saptanmıştır. Bu panel, kırmızı kan hücreleri içeren ve kaynak doku bağımsızdır (A, B, ve veriler gösterilmemiştir). 14 modifiye. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Fare Hücrelerinin Şekil 2. Güvenilir ve hızlı tükenmesi Süperparamanyetik n antikor kombinasyonunun 15. Eşleniklerianoparticles manyetik hücre sıralama (Manyetik Hücre Ayırma) (A), insan tümör ksenograftlarının fare hücrelerinin tükenmesi için optimize edilmiş bir protokol geliştirmek için kullanılmıştır. Bu yeni protokol bağımsız tümör tipinin, en az 20 dakika içinde, fare hücreleri kirletici>% 99 ortadan kaldırılması için izin verdi. Manyetik Hücre Ayırma prosedüründen elde edilen hücre fraksiyonları pan-fare antikor kokteyli ve CD326 (EpCAM) karşı bir insan spesifik antikor (B) ile işaretlendi. 15 ila Modifiye. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
İnsan glioblastoma hücrelerinin Şekil 3. izolasyonu. Fare hücre tüketimi Seti yetişkin Mous insan glioblastoma hücreleri izole etmek için kullanıldıE beyin. enkaz nöral doku yüksek miktarda ayrışma sırasında sıklıkla üretilir. MKDB verimli hücre ayrıntı karşı hücre boyutu gösteren arsa tarafından görüldüğü gibi ölü hücreleri ve enkaz tüketir. Bu eşlenik kokteyl ile, kirletici fare hücrelerinin>% 99 ve enkaz>% 60 ortadan kaldırmak mümkün olmuştur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-4
Fare Hücrelerinin Şekil 4. tükenmesi insan tümör hücreleri 14 aşağı akış Kültürler kolaylaştırır. Fare fibroblastları sık nakledilen dokuların ayırmadan sonra insan tümör hücrelerinin ekimi engelleyebilir veya heterojen kültürlerine yol açar. Fibroblastlar ve böylece hedef c overgrowing, daha verimli genişletmek yükledikleriyle arşın. Bu çoğu durumda mümkün değildir fare hücrelerini kirletici kaynaklanan etkileri matematiksel düzeltme beri, in vitro hücre kültürü deneyleri (örneğin, ilaç sitotoksisite testi) 'de bozan. Fare hücre yok olmasından sonra negatif (B) ve pozitif fraksiyonlar (C) üç gün, sabit ve fare özgü fibroblast işaretleyici (Vimentin) ve insana özgü tümör markeri CD326 (EpCAM) boyanmış kültürlendi. Bir kontrol olarak, ayrılmamış Hücreler (A) ihtiva eden orjinal fraksiyon kültürlendi ve hem de boyandı. Sıralanmamış fraksiyon (A) fibroblastlar neredeyse büyümüş, oysa da kültür üç gün sonra, insan tümör hücrelerinin hemen hemen saf bir popülasyon, negatif fraksiyon (B) 'de görülmüştür. Hedef hücrelerin sadece küçük bir bölümü, olumlu bir fraksiyon (C) kayboldu. 14 modifiye.ge.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-5
5. Tüm exome Sıralama Tümör Örneklerinin (KGD) Önceki ve fare hücresi kaybı (MCD) 15 sonra Şekil. Biz üzerinde MCD etkisini değerlendirmek için insan böbrek, akciğer ve mesane kanseri türetilen üç farklı ksenograft modellerinde WES yapılan yeni nesil dizileme verilerinin kalitesi. Toplu tümörden ve fare hücre yok olmasından sonra izole edilmiş tümör hücrelerinden DNA'nın exome yakalama kiti uygulanması exome çekilen dizi kütüphaneleri oluşturmak için kullanılmıştır. Bir masaüstü sequencer enstrüman, bir masaüstü düzendir reaktif kiti 150 devir üzerinde sıralama için, 75-bp paired-end okur oluşturmak için kullanılmıştır. küme yoğunluğunda önemli bir artış (p <0.05) (A), hem de bir AVE% 33 (B) 'nin okuma sayısı oldukça rağbet arttıran geliştirilmiş örnek kalitesini gösteren fare hücrelerinden yoksun örnekleri için gözlenmiştir. Buna uygun olarak, MCD, enkaz ve ölü hücrelerin güçlü bir azalma Akışkan sitometri analizi ile kanıtlanabilir (Şekil 3). 15 ila Modifiye. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-6
Şekil 6. Fare Hücre tükenmesi (MCD) Kesinlikle yanlışlıkla Haritalı Fare Sayısı Tüm exome Dizileme (WES) 15 sonra okur azaltır. Protein kodlayıcı dizilerin hedef zenginleştirme için kullanılan yakalama oligonükleotidler insan genomu, ilk ön dayalı dizayn edildi gibi insan menşeli fr DNA fragmanlarının zenginleştirmeom fare ve insan hücrelerinin kanşımı bekleniyordu. Fare genomik DNA ile çapraz melezleşme olabilir yakalama oligonükleotidlerin sayısını değerlendirmek için, biz fare genomuna karşı her bir hızlı çekim exome probunun ŞOK arama yaptı. Nihai hizalama parametreleri olası çapraz hibridizasyon belirlemek için kullanıldı. (.. Hizalama uzunluğu, hayır uyumsuzlukların, hayır boşluklar) seçim eşikleri bağlı olarak, biz 5 bir çapraz reaktivite tahmin - fare transkript ile yakalama prob% 10 (veriler gösterilmemiştir). Adaptör kırpma (trimmomatic v0.32 16) sonra, insan ve fare genomları karşı tüm örnekler (bwa v0.7.12 17) okur eşlenen ve olası kökenli ilgili hizalama parametrelere göre belirlenmiştir (Linux kabuk, komut satırı Perl) (A). Toplu tümör örneklerinden türetilmiş okur% 12 arasında bir ortalama fare hücrelerine bağlanmıştır. Bu miktar, B (fare hücreleri önceden tükenmesi% 0.3 indirgenebileceği ). ortalama% 15 olarak fare türetilmiş toplu tümör örneklerinde okur ve toplam% 1,9 tekabül eden insan genomuna yanlışlıkla eşleştirilmiş okur izole tümör hücreleri, aşağı analizlere fare hücre tükenmesi güçlü bir olumlu etkisi de% 0.04 beklenebilir. Şekil 6B, dökme tümör, mesane kanseri ksenogref türetilen izole edilmiş beşeri tümör hücreleri için ayrıntılı bir okuma atama örnek teşkil etmektedir. 15 ila Modifiye. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-7
Şekil 7. MCD Kesinlikle Sahte Öngörülen SNP 15 sayısı azaltır. Fare etkisini belirlemek amacıyla insan genomu eşleştirilmiş okur, biz predicte sayısını tespitöncesinde ve MCD sonra ksenograft örneklerinde d SNP. Resim sağlıklı dokuya kıyasla için uygun olduğu gibi, bir SNP sıralı numune ve referans genom (hg19) arasındaki fark olarak tanımlandı. Yinelenen kaldırılması okuduktan sonra, SNP ve INDEL arama 18 yapılmıştır ve bir exome yakalama kiti ile hedeflenen bölgelere sınırlı idi. Tüm SNP 63 ±% 10 toplu tümör örnekleri artık 18 ± 1% izole insan tümör hücreleri (A) için spesifik olan, fare hücre tükenmesi sonrasında saptandı için öngördü. Eski esas olarak yanlış eşlenen fare neden olurken ikinci izole edilmiş beşeri tümör hücre numuneleri içinde daha yüksek okuma sayısı ve buna bağlı olarak daha yüksek yoğunluktadır nedeniyle tespit gibiydi okur. Bu etki, öngörülen indeller (B) görünür. 15 modifiye. Bu büyük halini görmek için tıklayınızrakam.

figure-results-8
Şekil 8. MCD Yüksek darbe Tahmin SNP 15 geliştirir. 19 örneklenmiştir POLA1 geninin protein kodlama ekson içinde SNP tahmin üzerine MCD (A) etkisi. yanlışlıkla eşlenen fare toplu böbrek kanseri xenograftlarının içinde yanlış tahmin SNP bir dizi neden okur da, bu SNP MCD sonra eksik. Buna ek olarak, MCD aynı zamanda yüksek etkili SNP tahmin geliştirdi. Örneğin, fare GRIA3 gen (B) 'nin başlangıç ​​kodonunun yanlış tahmin tahrip olmasına yol açmıştır dökme tümör numunesi insan referans genom, eşleştirilmiş okunur. 15 ila Modifiye. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

keep-together.within sayfa = "1">: fo s = "jove_content" figure-results-9
Fare-türetilmiş Silico tükenmesi Şekil 9. Tam ben n Vitro MCD 15 değiştirin Can not okur. Hesaplama sıralama verileri çıkarıldı fare kökenli olacağı tahmin okur ve SNP arama tekrarlandı. Bu yaklaşımla, SNP sayısı (Şekil 8 ile karşılaştırınız) önemli ölçüde SNP toplam sayısının% 8.5% 63 düşürülmüştür toplu tümör örnekleri için öngörülen. Ancak, siliko yaklaşımı bu tamamen geliştirilmiş örnek kalitesi ve okuma sayısında eşlik eden bir artış ve kapsama kabul edilir, özellikle in vitro MCD içinde yerini olamazdı. 15 modifiye."_blank"> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

Bu ksenogreflenmiş tümör dokusundan bakir insan tümör hücreleri izole etmek için hızlı ve kolay bir yöntem geliştirdik. Bu işlem otomatik bir doku ayrışmasını ve manyetik hücre sınıflandırma birleştirerek Fare kaynaklı hücreler kapsamlı tükenmesi dayanmaktadır. Ayrıca, tüm fare hücreleri ölü hücreler ve artıkların miktarı tükenmesi yanı sıra önemli ölçüde hedef hücre fraksiyonu azalır. Birlikte ele alındığında, bu yöntem önemli ölçüde moleküler alt analizler, insan tümör hücreleri yetiştirme artırır.

Alternatif yöntemlerin aksine, tümör hücresi spesifik belirteçler, fare hücreleri ya da algoritma kurulması bileşimleri değişen ayarlama bilgisine gerek yoktur. sunulan yöntem fare zorlanma ve tümör türü bağımsızdır. Bu nedenle, EpCAM 11 için gösterildiği gibi, ifade değişebilir tek insan spesifik belirteçler temelinde insan tümör alt popülasyonlarının izolasyonu sayesinde bir önyargı, önlemek olduğunuEd. Bundan başka, tümör madde ile sınırlı değildir, ancak fare hücreleri yerine belirli bir insan tümör alt popülasyonlarının hedef olarak ksenonakledilmiş doku türleri için kullanılabilir (veriler gösterilmemiştir).

fare hücreleri Kapsamlı çıkarılması özel fare kökenli hücreler üzerinde ifade yüzey epitopları hedefleyen ile kolaylaştırılır. Dışında bu çalışmada sunulan tümör ayrılma için köklü yöntemi, enzimlerin farklı türde kullanarak birçok prosedürler vardır. hücre yüzeyi epitoplarının korunması, bu yeni yöntem, aynı zamanda, insan tümör hücre popülasyonlarının hassas analizler için bir ön koşuldur. Nedenle, yumuşak enzimler tümör dokusunun sindirimi için kullanılan son derece önemlidir. Bu nedenle, bir fare hücre tüketimi, sadece belirgin bir fare hücre tüketimi işlemi sırasında hedeflenen epitopları etkilemez enzimatik sindirim işlemleri ile bir arada kullanılabilir. Şüphe durumunda bu sadece ilgili üretici tarafından kontrol edilebilir.

Bu yöntem aynı zamanda insan dolaşımdaki tümör hücreleri (KTC) için çalışır. Bununla birlikte, hedef hücrelerin frekansları genellikle gibi

fare hücreleri çıkarılması önemli ölçüde fare fibroblastlarının kültürü kaplamak kaçınarak, insan tümör hücrelerinin kültür artırır. Buna ek olarak, yeni nesil dizilemesi ile insan tümör ksenograftlarının analizi önemli ölçüde geliştirilmiş ve standartlaştırılmıştır. Hedeflenen insan dizi-spesifik seçim exome zenginleştirme sırasında gerçekleştirilen edilmiş olmasına rağmen bu etki gözlenmiştir gibi, tüm genom ve bütün transcriptome sekanslama etkileyen daha da belirgin olması beklenmektedir.

Ayrıca, sunulan yöntem sahih kolaylaştırırksenonakledilmiş insan tümörlerinin içinde tümör alt popülasyonlarının te moleküler çalışmalar. Iki farklı alt popülasyonlannda insan tümör hücrelerini sıralama birinci aşamada ilgili bir örnek, fare hücrelerinin çıkarılması ve daha sonra, insan dökme tümör hücreleri 20 çıkar, tümör alt popülasyonunun doğrudan molekül karşılaştırmasını sağlar. Bu fare-türevli moleküllerin çapraz melezleşme etkilenmez tümör hücresi alt tipleri arasındaki diferansiyel gen ekspresyonu daha güvenilir bir tespit edilebilir.

Açıklamalar

David Agorku, Stefan Tomiuk, Stefan Wild, Silvia Rüberg, Lisa Zatrieb, Andreas Bosio ve Olaf Hardt, Miltenyi Biotec GmbH, Almanya'nın çalışanlarıdır veya çalışanlarıydı. Kerstin Klingner ve Julia Schüler, Almanya'daki Oncotest GmbH'nin çalışanlarıdır.

Teşekkürler

Janina Kuhl, Nadine Chelius, Petra Kussmann, Lena Willnow ve Dorothee Lenhard'a mükemmel teknik yardımları için minnettarız.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Tümör Ayrışma Kiti, insanMiltenyi Biotec130-095-929, H, R ve A enzimlerini içerir; Sulandırma talimatları için veri sayfasına bakın
RPMI 1640BiowestL0501-500
gentleMACS C-TüplerMiltenyi Biotec130-096-334
gentleMACS Isıtıcılı Octo DissociatorMiltenyi Biotec130-096-427
MACS SmartStrainer (70 & mikro; m)Miltenyi Biotec130-098-462
Petri kabı 100 mmÇeşitli
NeşterÇeşitli
Fare Hücresi Tükenme KitiMiltenyi Biotec130-104-694
PBSPEBkullanım 1x PBS
EDTASigma-Aldrich3610PEB tamponunda 2 mM'lik nihai konsantrasyon kullanın
BSAMiltenyi Biotec130-091-376veya PEB tamponunda 5 mg/L BSA kullanın
MACS LS sütunlarıMiltenyi Biotec130-042-401
QuadroMACS AyırıcıMiltenyi Biotec130-090-976
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
PreSep filtreleri (70 ve mikro; m)Miltenyi Biotec130-095-823
MACSmix Tüp DöndürücüMiltenyi Biotec130-090-753
CD326-FITC, insanMiltenyi Biotec130-080-301immünofloresan boyama için 1:40 kullanın 
anti-Vimentin antikoruabcamab92547
keçi anti-fare IgG-Alexa488Yaşam TeknolojileriA11029
keçi anti-tavşan IgG-Alexa594Yaşam TeknolojileriA11012
DAPISigma-AldrichD95420.1 & mikro nihai konsantrasyona seyreltin; 0.1 M sodyum bikarbonat içinde g / ml 
İç Leke KitiMiltenyi Biotec130-090-477Bu kitten InsideFix, immünofloresan boyama sırasında sabitleme adımı için kullanılabilir 
FBSÇeşitli Triton
X-100 Sigma-Aldrich93418
FcR Engelleme Reaktifi, fareMiltenyi Biotec130-092-575
JelatinSigma-AldrichG2500-100g
Nextera Hızlı Yakalama Zenginleştirme KitiIlluminaFC-140-1000
MiSeq Reaktif Kiti v3IlluminaMS-102-3001
tamponu için çeşitli ,

Kaynaklar

  1. Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69 (8), 3364-3373 (2009).
  2. Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
  3. DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
  4. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
  5. Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci Rep. 3, 3494(2013).
  6. Sausville, E. A., Burger, A. M. Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development. Cancer Res. 66 (7), 3351-3354 (2006).
  7. Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clin Pharmacol Ther. 85 (2), 217-221 (2009).
  8. Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
  9. Merk, J., Rolff, J., Becker, M., Leschber, G., Fichtner, I. Patient-derived xenografts of non-small-cell lung cancer: a pre-clinical model to evaluate adjuvant chemotherapy. Eur J Cardiothorac Surg. 36 (3), 454-459 (2009).
  10. Baiocchi, M., Biffoni, M., Ricci-Vitiani, L., Pilozzi, E., De Maria, R. New models for cancer research: human cancer stem cell xenografts. Curr Opin Pharmacol. 10 (4), 380-384 (2010).
  11. Gires, O., Stoecklein, N. H. Dynamic EpCAM expression on circulating and disseminating tumor cells: causes and consequences. Cell Mol Life Sci. 71 (22), 4393-4402 (2014).
  12. Zhang, C. C., et al. Synergistic effect of the gamma-secretase inhibitor PF-03084014 and docetaxel in breast cancer models. Stem Cells Transl Med. 2 (3), 233-242 (2013).
  13. Boven, E., et al. Phase II preclinical drug screening in human tumor xenografts: a first European multicenter collaborative study. Cancer Res. 52 (21), 5940-5947 (1992).
  14. Agorku, D., Hardt, O., Bosio, A. Depletion of mouse cells from human tumor xenografts significantly reduces bias in molecular analysis and improves culture of target cells. Abstract 95. , AACR. (2014).
  15. Agorku, D., et al. Next-generation sequencing of human tumor xenografts is significantly improved by prior depletion of mouse cells. Abstract 1455. , AACR. (2015).
  16. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  17. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  18. Koboldt, D. C., Larson, D. E., Wilson, R. K. Using VarScan 2 for Germline Variant Calling and Somatic Mutation Detection. Curr Protoc Bioinformatics. 44, (2013).
  19. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
  20. Aloia, A., et al. The sialyl-glycolipid stage-specific embryonic antigen 4 marks a subpopulation of chemotherapy-resistant breast cancer cells with mesenchymal features. Breast Cancer Res. 17 (1), 146(2015).

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

İnsan Tümör HücreleriFare Hücre BoşaltımıManyetik Hücre AyırmaDoku DisosyasyonuHücre İzolasyonuAkış SitometrisiTezgah Üstü Doku Disosiyasyon CihazıPB Tamponu
İnsan Tümör ksenogratflarının gelen Fare Hücrelerinin tükenmesi Anlamlı Hedef Hücre Alt Analizi geliştirir
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.