Method Article

Trofoblast Kök Hücre içine Fare Embriyonik Fibroblastlar Doğrudan Dönüşüm Protokolü

DOI:

10.3791/54277

⸱

July 25th, 2016

 , 
1Department of Developmental Pathology, Institute of Pathology, University of Bonn Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, murin embriyonik fibroblastlarının, Tfap2c, Gata3, Eomes ve Ets2'nin on günlük aşırı ekspresyonu ile tamamen işlevsel ve stabil trofoblast kök hücrelerine doğrudan dönüştürülmesi için bir protokol sunuyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trofoblast kök hücreleri (TSCs) memeli gelişiminin ilk hücre kaderi karar bir sonucu olarak ortaya çıkar. Onlar kendini yenilemek ve plasentanın fetal kısmına hücre popülasyonu veren yükselişi kök vivo eşdeğer trofoblast soy tüm alt içine ayırt etmek yeteneğini koruyarak, in vitro kültüre edilebilir. Bu nedenle, TSCs in vitro ekstra embriyonik hücre kaderi kararı karşısında plasental gelişim ve embriyonik incelemek için eşsiz bir model sunuyoruz. itibaren blastosist aşamasına gelen DNA metilasyonu ve histon modifikasyonları oluşan ayrı bir epigenetik bariyer sıkıca her iki soy ayırır. Burada, tam aşırı ifadesi fare embriyonik fibroblastlar trofoblast anahtar düzenleyiciler Tfap2c, Gata3, Eomes ve ETS2 ve geçici bu soy engeli aşmak için bir protokol açıklar. uyarılmış trofoblast kök hücreler kendini yenilemek mümkün ve türetilmiş trofoblast kök hücreleri blastokist hemen hemen aynıdır imorfoloji, işaretleyici gen ifadesi ve metilasyon motifinin n terimleri. In vitro ve in vivo deneylerde Fonksiyonel bu hücrelerin trofoblast soy polyploid trofoblast dev hücrelerin üretilmesi ve blastosist enjekte edildiğinde plasentayı kimerize boyunca ayırt etmek mümkün olduğunu onaylayın. somatik doku trofoblast kök hücrelerin uyarılması, bu ekstra-embriyonik soyunun genetik ve epigenetik özelliklerini incelemek için yeni yollar açar ve ilgili embriyo zarar vermeden trofoblast kök hücre hatları üretme imkanı sunuyor.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son zamanlarda, kök hücreler dönüşüm trofoblast fare embriyonik kök hücre çeşitli yaklaşımlar karşılaştıran bir çalışma, tüm analiz sistemleri, soy dönüşüm eksik kaldığını ortaya koymuştur. Bunun yerine bu yüzden trofoblast kök denilen uyarılmış trofoblast kök hücreler (iTSCs) hücre benzeri hücreler kökenli 1 hücre kaderi bir hafıza istinat oluşturulmuştur. Burada, ITSC nesil farklı bir yaklaşım izledi. Fare embriyonik fibroblastlar (MEF'ler) 2 pluripotent kök hücrelerin doğrudan indüklenmesi benzer şekilde, iTSCs doğrudan farklılaşmış somatik dokudan dönüştürüldü. İlk olarak, biz MEFS aşırı eksprese zaman TSC kaderi uyaran 12 aday faktörler....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm fare deneyleri, hayvan koruma ve yerel kurumsal hayvan bakım komiteleri (Landesamt fuer Natur, Çevre und Verbraucherschutz, Kuzey Ren-Vestfalya [onay kimlik numarası onayı ile anlaşarak Alman hukukuna göre yapılmıştır: 84-02.04.2013 AZ .A428]).

1. Medya Hazırlık

  1. Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM),% 10 (h / h) FBS, L-glutamin (2 mM), sodyum piruvat (1 mM), penisilin / streptomisin (1x): 293T orta hazırlayın.
  2. DMEM,% 10 (h / h) FBS, L-glutamin (2 mM), 1 x esansiyel olmayan amino asitler, penisilin / streptomisin (1x): MEF orta hazırlayın.
  3. TS orta hazırlayın (ağırlık / FGF4 / heparin o): Roswell Park Mem....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

4F transgen ifadesi aktive çanak, hücreler hızla morfolojisi (Şekil 2A ve B karşılaştırın) değiştirin. Gün etrafında 14-21 farklı transdiferensiye alanlar (iki örnek Şekil 2B ve C olarak verilmiştir) ortaya çıkar. Bu birincil koloniler tipik TSC morfolojisi eksikliği; ancak onlar sıkı kenarları ve iyi niyetli bir TSCs son derece anımsatan parlak sınırları ile alt-kültür, karakteristik epitel morfoloji ortaya (Şekil 2B) kez. Trofoblast tr.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan 4 faktörü (Tfap2c, Gata3, Eomes, ETS2) esaslı transdiferansiasyon protokolü sadakatle oluşturmak fare embriyonik fibroblastlar gelen iTSCs dönüştürülmüş güvenilir bir yöntem sunmaktadır. Dahası, yöntem olmasına rağmen embriyonik fibroblastlar 3 ile karşılaştırıldığında verimlilik bir damla ile, aynı zamanda doğum sonrası kuyruk fibroblastlar için geçerlidir. Genel olarak, birincil fibroblast kaliteli transdiferansiasyon sonuçları ve bakım kritik bir faktör erken geçiş hücreleri (geçit üç iki) k.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Doksisiklin hyclateSigma-AldrichD9891-10GSteril PBS'de çözün, 2 mg / ml stok çözeltisi hazırlayın. Alikotları -20 ° C'de saklayın; C
Klorokin difosfat tuzu Sigma-AldrichC6628-25GSteril hücre kültürü dereceli suda 25 mM stok çözeltisi hazırlayın. Alikotları -20 ° C'de saklayın; C
Polibren (Heksadimetrin bromür)Sigma-Aldrich107689-10GSteril hücre kültürü dereceli suda 8 mg / ml stok çözeltisi hazırlayın. Alikotları -20 ° C'de saklayın; C
insan rekombinant Fibroblast Büyüme Faktörü 4ReliaTech300-131LPBS'de steril% 0.1 BSA'da çözün, 25 ve mikro hazırlayın; g/ml stok çözeltisi. Alikotları -80 ° C'de saklayın; C
Heparin sodyum tuzuSigma-AldrichH3149-10KUSteril PBS'de çözerek 1 mg / ml stok çözeltisi hazırlayın. Alikotları -80 ° C'de saklayın; C
ProFeksiyon Memeli Transfeksiyon SistemiPromegaE1200
PBS, kalsiyum yok, magnezyum yokThermoFisher Scientific1419-094
DMEM (1x) + GlutaMAXThermoFisher Scientific31966-021
RPMI 1640, glutamin yokThermoFisher Scientific31870-025
İleri DMEM (1x)ThermoFisher Scientific12491-015
Tripsin-EDTA (% 0.05), fenol kırmızısıThermoFisher Scientific25300-054
Poli-L-lizinSigma-AldrichP4707
Fetal sığır serumuHiklonSH30071.03IR
Yüzey aktif madde içermeyen selüloz asetat-membran filtresiCorning431220
Esansiyel olmayan amino asitlerThermoFisher Scientific11140-035
Penisilin StreptomisinThermoFisher Scientific15140-122
Sodyum Pirüvat;ThermoFisher Scientific11360-039
L-glutamin ThermoFisher Scientific25030-24
2-MerkaptoetanolThermoFisher Scientific31350-010
Dimetil sülfoksit (DMSO), hücre kültürü sınıfıPanreac AppliChem GmbHA3672,0100
pLV-tetO-Tfap2cAddgene70269
pLV-tetO-Gata3Addgene70270
pLV-tetO-EomesAddgene70271
pLV-tetO-Ets2Addgene70272
pLV-tetO-mCherryAddgene70273
psPAX2Addgene12260
pMD2.GAddgene12259
FUdeltaGW-rtTA Addgene19780
Fareler B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7JAX Fareler6965
129S2SVCharles Nehri129

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538(2014).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Trophoblast Stem CellsMurine Embryonic FibroblastsDirect Cell ConversionLentiviral Vector TransfectionTfap2c Gata3 Eomes Ets2Induced Trophoblast Stem CellsPoly L lysine Coating293 T Cell TransfectionVirus Harvesting ProtocolColony Picking Technique

Related Articles