Yöntem makalesi

Cam Yüzey fonksiyonlandırmalar aracılığıyla Hedefli Hücre İzolasyonu Bir Yöntem

DOI:

10.3791/54315

⸱

20 Eylül 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Liberal Arts & Sciences, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Biomedical Engineering, Illinois Institute of Technology

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, ilgilenilen belirli hücre tiplerini izole etmek için desthiobiotin, streptavidin ve APTES sisteminin özelleştirilebilir yüzey işlevselleştirmesini tanımlar. Ek olarak, bu makale bu sürecin uygulamalarını, optimizasyonunu ve doğrulanmasını kapsar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kişiselleştirilmiş tıbbın benimsenmesi ve ilerlemesinin önündeki sınırlayıcı faktörlerden biri, hastadan hastaya ifadedeki bireysel nüansları araştırmak için tanı araçları geliştirememektir. Bu boşluğu doldurmak için hücreleri ayırmaya çalışan mevcut metodolojiler, fizyolojik ifadenin bozulmasına neden olarak ayırma tekniğini bir teşhis aracı olarak işe yaramaz hale getirir. Bu protokolde, hücresel yakalama ve serbest bırakma için bir yüzeyin işlevselleştirilmesini ve optimizasyonunu açıklıyoruz. Bu işlevselleştirilmiş yüzey, biyotinile antikorları bir aminosilan (APTES), destibiotin ve streptavidin ile işlevselleştirilmiş bir cam yüzeyle bütünleştirir. Hücre salınımı, yüzey tarafından yakalanan hücrelerin geri çağrılmasına ve saflaştırılmasına izin veren biyotinin eklenmesiyle kolaylaştırılır. Bu salım, çok daha yumuşak bir salım paradigması ile sonuçlanan ikincil kısım desthiobiotin'in hedeflenmesi yoluyla yapılır. Sert reaktiflerdeki ve kesme kuvvetlerindeki bu azalma, hücresel ifadedeki değişiklikleri azaltır. İşlevselleştirilmiş yüzey, tek hücreli bir karışımda hücrelerin %80'ine kadarını yakalar ve çift hücreli bir karışımda %50'ye kadar yakalama göstermiştir. Bu teknolojinin ksenogreftlere uygulamaları ve kanser ayırma çalışmaları araştırılmaktadır. Plaka okuyucu ve ImageJ analizleri gibi yüzey doğrulama için miktar belirleme teknikleri de açıklanmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geçerli tezgah üstü hücre ayırma yaklaşımları (örneğin, floresan aktif hücre 1 sıralama, lazer yakalama mikro-diseksiyonu 2, bağışıklık manyetik boncuk ayırma 1) hazırlanması ve sıralama birkaç saat sürebilir. Bu büyük zaman ölçekleri fizyolojik tepki 3'ün temsilcisi değildir analizlerde ortaya çıkan fizyolojik tepki ve ifade düzeylerini etkileyebilir. Sistem hızla ve verimli bir şekilde, biyomedikal uygulamalar için, hücre İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi geliştirmek için hücre yüzeyi reseptörü seviyeleri bozmadan özel hücre tipleri izole ihtiyaç vardır. Bu nedenle, bir yaklaşım mantığı hücre izolasyonu için hafif bir yaklaşım geliştirmek için.

"Bir çip üzerinde laboratuvar" kavramı büyüklüğü daha hızlı (saat-to-dakika) hücre izolasyonu siparişlerin söz sunar ve en sık bir yüzey üzerine hücreleri yakalama ve hücreleri veya hücre içi conte serbest içerirFiziksel 4,5'ten aracılığıyla NTS veya kimyasal yöntemler 6. Bu yaklaşımlar, in vitro kültür 12,13 hücreleri sağlayarak bile RNA ifade 9-11 belirleme, protein 7,8 ifadesini tanımlayan ya da birkaç avantajı sunuyor olsa da, bu tekniklerin pek çok tür hücre reseptör profil nedeniyle olarak teşhis tercüme edilemez onların fizyolojik olmayan ortamlara. Böyle hassas fizyolojik veri oluşturmak olmaz bu kaldırma maddeleri kullanmayın hücre reseptör ölçümü teknikleri anlam ayrıca reseptör miktarları 14,15 etkileyebilir kollajcnazların gibi enzimatik kaldırma ajanlar. Hücre lizizi doğal yüzey reseptörleri arasındaki farkı önler, ve daha önce 16 içsel edilenler. Bu protokol, hücre izolasyonu için hızlı ve hassas bir yaklaşımı tarif eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cam Yüzey Temizleme ve Hazırlama Reaktifler

  1. temizlemek için% 50 güç, 5 dakika boyunca bir oksijen plazma sistemi bir cam yüzey üzerine koyun.
  2. APTES 50 ul ve konik bir tüp içinde etanol 2.45 ml ekleyerek, 2.5 ml% 2 yeniden (3-aminopropil) trietoksisilan (APTES) çözeltisi hazırlayın.

2. APTES ve DSB fonksiyonlandırmalar

  1. yüzeylere APTES solüsyonu ekleyin. 8 kuyucuğu için kuyu başına Pipet 150 ul. 24 kuyucuğu için kuyu başına Pipet 100 ul. 60 x 15 mm cam yemekleri için 1.1 ml pipetle. buharlaşma ve APTES çözümünün dengesiz dağılımını önlemek için yüzeyleri örtün. APTES tabakanın eşit dağılımını oluşturur, oda sıcaklığında 50 dakika için bir platformlu sallayıcı üzerinde yüzeyleri yerleştirin.
    NOT: APTES yüzeyin birinci katmanını oluşturan bir aminosilan olduğunu. Farklı yüzey kullanıyorsanız, sezgisel yüzeyini kapsayacak şekilde gerekli çözelti hacmini belirler.
  2. yüzeyler çalkalayıcı üzerinde iken, fırın sıcaklığı seçin: Isı 55 ° C 8 kuyucuğu için 2 saat ve 24 kuyucuğu için. Isı, cam, 1 saat boyunca 90 ° C'ye kadar, sadece yemekler.
  3. etanol ile yüzeyleri durulayın.
    1. kullanılan yüzeyin dayalı başvurarak gerekli etanol miktarı yönetme. 8 kuyucuğu için her kuyuya 150 ul etanol ekleyin. her bir 24 yuvalı plakalar 125 ul etanol ekleyin. Cam yemekleri için 1.1 ml etanol ekleyin.
    2. boşaltma ve de köşesinde bir sabit noktadan sıvı çizerek yüzey durulayın. ucu doğrudan yüzeye işaret değil bu yüzden yaklaşık 70 ° açı pipet tutun. iki kat daha fazlasını kullanarak etanol durulayın.
      NOT: cam alt kuyu plakaların herhangi onları herhangi bir plastik varsa plastik eritmek ve çözgü başlayacak gibi, 65 ° C'nin üzerinde ısıtmayın yok.
  4. bir depodan tevzi% 100 azot gazı ile kurutun. o yüzeyleri yerleştirinven.
  5. 2462.5 dimetil sülfoksit (DMSO) 37.5 ul, 1.5 mg / ml DSB birleştirerek D-destiobiyotin (DSB) çözeltisi 2.5 mL hazırlayın ve 5 mg / ml 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid (EDC) 0.1 M, 4-morpholinoethanesulfonic asit hidratı (MES) (pH 6) tampon ul. Sonra her iki çözümü birleştirir.
  6. DSB EDC arasındaki reaksiyonu söndürmek için çözelti içine 15 dakika sonra, 2-β merkaptoetanol 1 ul ekle. Fırından cam yüzeyler işlevselleştirilmiş sıcak APTES çıkarın. soğutmak için cam yüzeyler için 5-10 dakika bekleyin.
  7. MES yüzeyde dayalı miktarları kullanılarak, durulama yüzeyi tampon ekleyin. 150 ul MES 8 kuyu plakaları için de her tampon ekleyin. 125 ul MES 24 kuyucuğu için her oyuğa tampon ekleyin. Cam yemekleri için 1.1 ml MES tamponu ekleyin.
  8. boşaltma ve de köşesinde bir sabit noktadan sıvı çizerek yüzey durulayın. ucu doğrudan işaret değil bu yüzden yaklaşık 70 ° açı pipet tutunyüzeye. MES tamponu ile iki kez daha durulanır.
  9. Onları inkübe izin yüzeylere DSB çözümü uygulayın. 8 kuyucuğu için kuyu başına 150 ul DSB çözüm ekleyin. 24 yuvalı plakalar için göz başına 100 ul DSB solüsyonu eklenir. cam tabaklar DSB çözümü için 1.1 ml ekleyin.
  10. Petri kabı içinde nemli bir kağıt havlu üzerine DSB kaplı cam yüzeyler yerleştirin. Kapak ve 18-24 saat süreyle 4 ° C buzdolabında kuluçkaya yatmaktadır.

3. Streptavidin Fonksiyonlandırma

  1. 1.0x fosfat tamponlu tuz (PBS) 1 ml her bir cam yüzeyi, üç kez yıkayın. boşaltma ve de köşesinde bir sabit noktadan sıvı çizerek yüzey durulayın. ucu doğrudan yüzeye işaret değil bu yüzden yaklaşık 70 ° açı pipet tutun. 0.4 mg streptavidin (Sav) stok solüsyonu sulandırmak / ml (önerilir).
    NOT: seyreltme ve durulama için bir araç olarak kullanılabilir, böylece PBS izotonik. PBS SA için bir çözücü olarak kullanılanh, ve bu nedenle, yüzeyi bağlanma Sav yeteneğini etkilemez.
  2. cam alt formları ince tabaka yüzey göre çözeltinin miktarını seçmek ve böylece yüzeylere eşit Sav çözeltisi 0.4 mg / ml uygulanır. 8 kuyucuğu için, oyuk başına 150 ul 0.4 mg / ml Sav çözeltisi ilave edilir. 24 yuvalı plakalar için, oyuk başına 100 ul 0.4 mg / ml Sav çözeltisi ilave edilir. Cam yemekler için, 1.1 ml 0.4 mg / ml Sav çözeltisi ilave edilir.
  3. Kapak ve nemi korumak için bir 14 cm Petri kabı plakaları taşıyın. 18-24 saat buzdolabında Petri kabı kuluçkaya yatmaktadır.
    NOT: Her yüzeyde APTES, DSB ve Sav tutarlı hacimleri kullanmak esastır.
  4. SAv kaldırmak için her cam yüzeyi PBS 150 ul ile üç kez yıkayın. boşaltma ve de köşesinde bir sabit noktadan sıvı çizerek yüzey durulayın. ucu doğrudan yüzeye işaret değil bu yüzden yaklaşık 70 ° açı pipet tutun.
  5. Bir kağıt havlu w Islakith de-iyonize su ve kuyu nem tutma plakaları çevreleyen 14 cm Petri kabındaki düz kağıt havlu yerleştirin. kuyu içeren Petri kabı örtün. kadar gerekli bir 4 ° C Biyogüvenlik düzeyi 1 (BSL-1) buzdolabında Petri kabı kuluçkaya yatmaktadır.

4. Hücre Yakalama ve Yayın

  1. deney amaçlı hücrelerin T175 balonuna (ler) ile başlayın. balona (ler) den medya aspire. Oda sıcaklığı 5 ml PBS kalan medyayı yıkayın. balona (ler) den PBS aspire.
  2. hücre, T-175 balonuna, bu hücre ayrışma Çözüm olarak enzimatik olmayan kaldırma maddesi 10 ml ekleyin. şişeden hücreler kaldırabilmek için 6 dakika kuluçka makinesi içinde balon koyun.
  3. 6 dakika sonra, soğuk Hank Dengeli Tuz Çözeltisi 10 ml ekleyin (HBSS; Malzemelerin Listesi) kaldırma ajanı inaktive. Bir hemasitometre kullanılarak çözelti içinde hücrelerin sayısını saymak için hücrelerin 20 ul çıkarın.
    NOT: fonksiyon bağlıyakalama deneyde kullanılan yüzeyler laşma, gereken hücre sayısı değişir. fonksiyonelleştirilmiş 8 kuyucuğu için kuyu başına 300.000 hücre kullanın. işlevselleştirilmiş cam yemekleri için, 1,1 milyon hücreleri kullanır. fonksiyonelleştirilmiş 24 kuyucuğu için 125,000 hücreleri tavsiye edilir. hücre sayımı hakkında daha fazla bilgi eki bulunur.
  4. adımları tekrarlayın 4.1- 4.3 hücrelerinin bir şişe için, daha az hücre deney için gerekli daha varsa. çözeltide hücrelerinin toplam sayısını elde etmek için hücre süspansiyonları ve yeniden sayılması hücreleri birleştirin.
  5. Yoğunlaşan hücreler, bir tablet elde etmek için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj hücre süspansiyonu dönerler. Daha sonra, ml başına 1 x 10 6 hücre konsantrasyonu elde döndürülür hücrelerden süpernatanı havalandırın, ve hesaplanan hacim kazandırmak için hücre süspansiyonu ekleyin HBSS uygun miktarda Bul. Bu hacim Eki'nde denklemler kullanılarak hesaplanabilir.
  6. Pipet yukarı ve aşağı (çiğnemek) th tekrar süspansiyonçözelti e hücreleri ve antikor bağlanma azaltabilir çözeltide hücresel topaklanma azaltır. Ayrı kontrol ve deney çözümler hücresel çözüm bölün. bileşenleri ve hesaplamalar için ek Dosya görüntüleyin.
  7. Yan Dosya açıklandığı gibi ilgili hücre çözümleri biotinlenmiş antikorlar ekleyin. bir uç aşırı uç karıştırıcı üzerinde 4 ° C'de 30 dakika süreyle inkübe edilir.
    Not: MCF7GFP hücreleri, 0.5 mg / ml hIgG veya 0.5 mg / ml, HLA-ABC antikorlar için tavsiye edilir. RAW makrofajlar için, 1 mg / ml mCD11b seyreltme farklılıkları hesaba yarım ses seviyesinde tavsiye edilir. İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde (HUVECler), 0.5 mg / ml hCD31 önerilir.
  8. HBSS ile fonksiyonalize cam yüzeyi yıkayın. Bu deney için, 8 oyuklu plaka tavsiye edilir.
    1. 8 kuyucuğu için her kuyuya 150 ul HBSS ekleyin. HBSS kullanarak iki kez daha durulayın. boşaltma ve de köşesinde bir sabit noktadan sıvı çizerek yüzey durulayın.ucu doğrudan yüzeye işaret değil bu yüzden yaklaşık 70 ° açı pipet tutun. 4 ° C'de soğuk tutmak.
  9. kuyulara hücre çözümleri ekleyin ve hücreler çalkalayıcı üzerinde buz üzerinde inkübe için 45 dakika bekleyin. Ek açıklandığı gibi hesaplanan miktarlar kullanılarak steril HBSS biyotin çözüm olun.
  10. HBSS kullanarak cam kuyulardan hücre çözüm çıkarın.
    1. Yavaşça her kuyuya 150 ul HBSS pipetle. Sonra HBSS dışarı pipetle. boşaltma ve de köşesinde bir sabit noktadan sıvı çizerek yüzey durulayın. ucu doğrudan yüzeye işaret değil bu yüzden yaklaşık 70 ° açı pipet tutun.
    2. iki kez daha tekrarlayın. Yıkama işleminden sonra, ıslak hücreler tutmak için oyuklara HBSS ekleyin.
  11. her bir ilgili serbest bırakmak için 20 mM biyotin solüsyonunun 150 ul ekleyin ve daha sonra reaksiyon için izin vermek için 20 dakika beklemek.
  12. spesifik olmayan şekilde bağlanmış hücre hatırlamakHBSS ile yıkanarak s yukarıda belirtilen ve daha sonra floresan etiketli hücreleri kullanarak eğer, görüntüyü hücreleri floresan devam ettikçe. Ayrıca bir şişe içinde görüntü canlı hücreleri (bir kontrol olarak, bir gözdeki hücrelerin ile karşılaştırmak için). Yeşil floresan proteini (GFP) transfekte edilmiş hücrelerin kullanılması durumunda, uyarma 470 nm olacak ve emisyon 515 nm olur.

5. Antikor Optimizasyonu: Antikor Titrasyon

  1. Adım 4.1- 4.3 açıklandığı gibi T75 veya T175 şişesi hücreleri kaldırarak başlayın.
    NOT: Bu miktarlar 24 kuyucuğu için kalibre edilir, ancak sezgisel test yoluyla herhangi bir cam fonksiyonelleştirilmiş yüzeyleri uygun şekilde değiştirilebilir. Temsili bir antikor titrasyonu, Şekil 1 'de gösterilmiştir.
  2. Hemasitometre kullanılarak hücre sayımı ve daha sonra 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 xg'de konik bir tüp hücre çözeltisi aşağı doğru döndürün. Ek olarak anlatılan hesaplamalar kullanılarak, ml başına 1 milyon hücre hücreleri sulandırın.
  3. 1 m bölmekantikor (Ab) çözümleri için farklı santrifüj tüplerine 500 ul altı farklı çözümler ml solüsyon başına illion hücreleri.
    1. 10 ug / ml, 1 ug / ml, 100 ng / ml, 10 ng / ml, 1 ng / ml antikor stok çözeltisi ile seyreltilir. Leke tampon maddesi (PBS +% 1 sodyum azid +% 1 BSA) 100 ul, ve hiçbir Ab kontrol hücrelerinin 500 ul kullanılarak kontrol oluşturun. Boş kontrol için (Resim Ab ve hücre yok), 300 ul PBS bir çözelti kullanır.
      NOT: DİKKAT: Sodyum azit son derece toksik, patlayıcı ve kullanırken son derece dikkatli olunmalıdır. Malzeme Güvenlik Bilgi Formu (MSDS) bakın ve uygun güvenlik ekipmanları kullanın.
  4. Bir araya getirin ve 30 dakika boyunca 4 ° C'de, son aşırı ucunda karıştırıcı içinde, hücre çözümleri Ab çözümler inkübe edin. HBSS ile üç kez fonksiyonelleştirilmiş 24 kuyucuğu durulayın. boşaltma ve de köşesinde bir sabit noktadan sıvı çizerek yüzey durulayın. pi tutunPette ucu doğrudan yüzeye işaret değil bu yüzden yaklaşık 70 ° açı.
  5. Uygun APTES içine her numune çözeltisinin Kısım 125 ul, DSB ve Sav iyi fonksiyonalize. 4 ° C'de ya da cam yüzeyi üzerinde, 45 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. spesifik olmayan bağlanmış hücreler uzaklaştırılmıştır HBSS ile üç defa yüzey durulayın. boşaltma ve de köşesinde bir sabit noktadan sıvı çizerek yüzey durulayın. ucu doğrudan yüzeye işaret değil bu yüzden yaklaşık 70 ° açı pipet tutun. Bu kontroller gibi, alt satır durulama yapmayın.
  6. , Iyi yıkanmış her HBSS 150 ul ekleyin buz üzerinde 24 kuyu tabak koymak ve sonra GFP hücrelerinin (Uyarım 485 nm / Emisyon 528 nm) floresan ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın.

6. Hücre Optimizasyonu: Hücre Titrasyon

  1. adımlarda 4.1 -4.3 belirtildiği gibi hücreleri kaldırın.
  2. hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. böylece hücre aşağı spin4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 xg'de konik tüp dökülmesinden. ml başına 1 milyon hücre hücreleri sulandırın.
    NOT: hemasitometre kullanımına ilişkin daha fazla bilgi Ek bulunabilir.
  3. Pipet konik bir tüp içinde 1,6 milyon hücre stok ve yer için hücre çözeltisinden 1.6 ml. konik bir tüp içinde 800.000 hücre stok ve yer için hücre çözeltisinden hücreler 800 ul pipetle. Pipet konik bir tüp içinde 80,000 hücre stok ve yer için hücre stokunun 80 ul. Pipet konik bir tüp içinde 8.000 hücre stok ve yer için hücre stoktan 8 ul.
    NOT: Konsantrasyonları gerektiği gibi çoğaltmak, 8 kuyu plaka ölçülerine göre verilir. Plakası çıkışı bir örneği, Şekil 2'de gösterilmiştir.
  4. Dört stok çözelti alın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj içinde dönerler. HBSS 400 ul tüm stok çözümleri yeniden askıya.
  5. , 1.600.000 hücre stoku 100 ng / ml antikor 1.6 ul 0.8 μ800.000 hücre stokuna l ve diğer tüm stokları 0.5 ul. 4 ° C'de 30 dakika boyunca uçtan aşırı ucunda bir karıştırıcıda 30 dakika boyunca antikorun inkübe edin. HBSS ile üç kez fonksiyonlaşmış cam yüzeyi yıkayın.
    Not: işlevselleştirilmiş 24 plaka plaka okuyucu ölçümü için tavsiye edilirken işlevselleştirilmiş 8 oyuklu plaka, mikroskopi ölçümü için tavsiye edilir. 8000 hücre stoku için antikor konsantrasyonu çözelti içinde antikorların eksikliği vermeye yakalama yüzeyinin sınırlayıcı bir faktör izin vermek için, indirgenmiş değildi, ama daha çok yüzey yakalama özellikleri.
  6. Her bir oyuğa ve örnek solüsyonların 150 ul uygulanır. Soldaki kuyuların ilk sütuna 1,6 milyon hücre stoku uygulayın. soldan ikinci sütuna 800.000 hücre stok uygulayın. soldan üçüncü sütunda 80.000 hücre stok uygulayın. Nihayet son sütuna 8.000 hücre stok geçerlidir. çalkalayıcıda 4 ° C'de 45 dakika süreyle inkübe edin.
    NOT: 1,6 milyonHücre stok test edilecek en yüksek konsantrasyon olarak hizmet verir ve (600.000 hücre kuyu başına) hücre ayırma deneylerinde genellikle kullanılan tipik hücresel konsantrasyonu olarak 800.000 hücre stok deney için kontrol olarak hizmet vermektedir hücrelerin çift miktarı ki (oyuk başına 3.000.000 hücre) hücre ayırma deneyleri kullanılır. 80.000 hücre stoku hücre yakalama için daha düşük konsantrasyonlarda (oyuk başına 30,000 hücre) test etmek için bir on kat sulandırıldıktan olarak hizmet eder. yüz kat seyreltme hücresel ayırma alt sınırı (oyuk başına 3.000 hücre) kontrol etmek için bir test olarak kullanmak kadar 8.000 hücre stok vermektedir.
  7. HBSS ile üç kez durulayın. boşaltma ve de köşesinde bir sabit noktadan sıvı çizerek yüzey durulayın. ucu doğrudan yüzeye işaret değil bu yüzden yaklaşık 70 ° açı pipet tutun. Tüm yıkar toplayın.
  8. Görüntü bir floresan mikroskop hücreleri, 8 kuyu plakaları kullanıyorsanız, sur her fotoğraf çekmekYüz ve çalkalayıcı üzerinde 4 ° C de bir saat süre ile, her yüzeyine 150 ul biyotin uygulanır. Bir saat sonra, daha önce olduğu gibi HBSS ile 3 kez biyotin salma kuyu durulayın. hemasitometre ve görüntü bırakma kuyuları ile sayılması için kuyulardan tüm yıkar toplayın.
  9. 24 yuvalı plakalar kullanılarak ise, 1 saat süre ile biyotin salma uygun oyuklara ve HBSS ile gözlere 3 kez yıkayın 20 mM fazla biyotin solüsyonunun 150 ul uygulanır. Bir plaka okuyucusu kullanılarak 24 oyuklu plakalar nicelleştirmektedir. tüm toplanan kuyu yıkar hücreleri saymak için bir hemasitometre kullanın.

7. Görüntü Analizi

Not: FİJİ yazılım paketi (http://fiji.sc/Fiji) görüntü analizi için tavsiye edilir. Başlangıçta, görüntüler gri tonlama görüntüye dönüştürüldü ve parlaklık / kontrast hücrelerini ortaya çıkarmak için değişmiş oldu.

  1. Görüntüyü yükleyin ve "Tip" aşağı kaydırma sonra resim sekmesini tıklatarak ve ardından tıklayarak gri tonlamaya dönüştürmek4, 8 bit ".
  2. Görüntü sekmesini tıklatarak ve ardından "ayarlama" kaydırarak görüntü kontrastını arttırmak. "Parlaklık ve Kontrast" üzerine tıklayın ve sonra hücrelerin öne çıkması için kaydırma çubuklarını kullanın. floresan görüntüleri kullanarak, daha fazla tanımlanmış hücreleri yapmak için görüntüleri ters.
  3. ImageJ görüntüleri analiz etmek (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html) ITCN denilen üzerine bir eklenti yükleyin.
  4. Açık ITCN. Bir iletişim kutusu hücrenin boyutunu tahmin etmek birkaç parametre ile kullanıcıya sorar göründüğünde, öncelikle ilgi hücrenin minimum genişliğini ayarlayın. görüntü floresan ve hücrelerin karanlık ise "Algılama Karanlık Peaks" seçeneğini tıklayın.
  5. "Kont" düğmesine basın, sonra başlangıçta 2'de eşik değerini ayarlayın ve. Resmin Bir yeni sayılır versiyonu hücreleri sayılmış nerede belirleyen kırmızı noktalar ile görünecektir.
  6. tanımdan daha doğru hücresel veri almak için eşik ve genişliği parametre ayarlayınBir "hücre" boyutunu ng. Not: Sağdaki bir iletişim kutusu olacak sayılan hücrelerin sayısı. Değişen Parametreler sayılan hücrelerin farklı numarası verecektir.
  7. iyi bir tahmin hücrelerin sayısı için ulaşılıncaya kadar eşik ve genişlik parametreleri arasında yineleme devam ediyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu hücre yakalama (Şekil 3A) ve MCF7GFP hücrelerinin hücre serbest bırakın (Şekil 3C) ve canlı hücre kontrolleri (Şekil 4) göstermektedir, bu protokolü kullanarak. % 60 ve% 80 (Şekil 3C) serbest bırakıldı gibi hücre yakalama sayılabilir. Bu RAW 264.7 makrofajlar ve MCF7GFP hücre karışımına Bu yaklaşımını sonra ham makrofajlar% 50 yakalanmış (Şek. 3D) ve RAW makrofajlar% 80 20 mM biyotin (Şekil 3B...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre izolasyonu tekniklerindeki ilerlemeler vasküler biyoloji 19 hücre yenileyici biyoloji programlama ve anjiyojenik sinyalizasyon kök, nörobilim 18 yapı-işlev ilişkilerinin bilimsel çalışmaları teşvik edilir. Gerçekten de, birincil hücre kültürü 20 (ör HUVECler) vasküler biyoloji esas olarak hücre izolasyon teknikleri kullanılarak yapılır. Hücre izolasyonu da en son plazma zarı reseptörlerinin 3,14,15,19,21 kantitatif akışı (qFlow) sitometrisi analizi için kullanıl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amerikan Kanser Derneği'ne, Illinois Division'a (282802) ve Ulusal Bilim Vakfı CBET'e (1512598) finansman desteği için teşekkür ederiz. Ayrıca mikroskopi eğitimi için Illinois Üniversitesi Beckman Enstitüsü'nden Dr. Dianwen Zhang'a teşekkür ederiz. Son olarak, anlayışlı tartışmalar için Jared Weddell, Stacie Chen ve Spencer Mamer'e teşekkür etmek istiyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
(3-Aminopropil) trietoksisilan (APTES)Acros Organics919-30-2%2 APTES çözeltisi yapmak için kullanılır
Plazma Temizleyici PicoDienerModel 1Yüzeyleri temizler ve PDMS'nin cama bağlanmasına izin verir
d-Desthiobiotin (DSB)SigmaD20655Hücresel yakalama yüzeyinde serbest bırakma mekanizması olarak kullanılır. 
dimetil sülfoksit (DMSO)İngiliz İlaç Evleri (BDH)BDH1115-1LPDSB'yi çözelti
1-Etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid (EDC)Termo-Bilimsel5g: 22980 < br / > 25g: 22981Karboksilik asitleri aktive eder ve proteinlerin cam yüzeye bağlanmasını sağlar.
kaplamasız 8 oyuklu kültür lamıBD Falcon24 vaka: 354118
96 vaka: 354108		İlk yakalama ve serbest bırakma miktar tayini deneyleri gibi Zeiss floresan mikroskobunu içeren hücresel deneylerde kullanılır
Cam tabanlı 24 kuyucuklu plakalarMatTekP24G-0-13-FAntikor ve hücresel titrasyon deneyleri gibi plaka okuyucuyu içeren hücresel deneylerde kullanılır
MerkaptoetanolScience Lab60-24-2EDC ve DSB arasındaki reaksiyonu söndürmek için kullanılır
4-Morfolinoetansülfonik asit hidrat
(MES Hidrat %99)		Fisher ScientificAC172590250EDC reaksiyonunda kullanım için 0,1 M MES Tamponu yapmak için kullanılır
Hassas Fırın ThermoScientific11-475-153PDMS ve APTES tabakasının kürlenmesinde kullanılır.
Titramax 1000 ShakerHeidolph13-889-420APTES'in yüzeylerde eşit dağılımını sağlamak için kullanılır.
1x Streptavidin 5 mg [e7105-5mg]Proteo Chem9013-20-1Biotin bağlayıcı protein. Tahrişe neden olabilir.
5 cm Cam TabakFisher Scientific08748AHUVEC çalışmalarında ve gelecekteki profil oluşturma çalışmalarında kullanılır.
14 cm Kapaklı Petri KabıSigma-AldrichZ717231İşlevselleştirilmekte olan numuneleri tutmak ve taşımak için kullanılır.
MCF7-GFP hücreleriHücre BiyolabsAKR211Sıvı nitrojen
RAW264.7 fare makrofajlarındaATCCTIB-71Illinois Üniversitesi'ndeki Smith laboratuvarından bize hediye edildi. Sıvı azot içinde saklanır.
TrypLELife Technologies12605036Oda sıcaklığında 100 ml içinde
saklanır Dulbecco' UIUC50003PC'dekiKimya Bilimleri Okulu'ndaTesisi Tedarikçi: Corning
Esansiyel olmayan amino asitler25-025-CI'dekiKimya Bilimleri Okulu'ndaki Hücre Ortamı TesisiTesis tarafından DMEM'e zaten eklenmiştir. Tedarikçi: Corning.
Hücre kazıyıcıFisher Scientific12-565-58Küçük 23 cm 50 paket
Hücre Ayrışma ÇözeltisiCorningMT-25-056CIHücre deneylerinde kullanım için hücreleri enzimatik olmayan bir şekilde kaldırmak için kullanılır
HemasitometreHausser02-671-54Hücre çözeltilerinin nicelleştirilmesi için hücreleri saymak ve etkinliği yakalamak ve serbest bırakmak için kullanılır.
BiotinAmresco58-85-5Hücreleri yüzeyden serbest bırakmak için kullanılır.
HBSSReçeteden OluşturulduN/AHücreleri süspansiyonda canlı tutmak ve spesifik olmayan bağlayıcı yüzeyleri yıkamak için kullanılır. Cold Spring Harbor Protokollerinden Uyarlanmıştır: 500  ml, 4  kullanın; g NaCl, 0.2  g KCl, 0.0402  g Na2PO4• 7H2O, 0.03  g KH2PO4 ve 0.5  g glikoz. Elde etmek için DI suyu ekleyin  500 ml, süzün ve ardından soğutun.
HLA-ABC AntikoruBioLegend311402MCF7gfp hücrelerini yakalamak için kullanılan antikor
hIgG AntikoruBioLegendHP6017MCF7gfp hücrelerini yakalamak için kullanılan antikor
MCF7 GFP hücreleri CellBiolabsAKR-211Luminal Meme Kanseri yeşil floresan proteini ile transfekte edilmiş seri.
Çeşitli KoniklerTermo-Bilimsel15mL: 12-565-268Çözeltileri ve alikotları saklamak için 50/15 ml plastik konikler.
Mini Tüp Döndürücüler (Uçtan Uca Karıştırıcı)Fisher Scientific05-450-127karıştırmak için antikoru inkübe etmek ve diğer hücresel çözeltileri karıştırmak için kullanılır
.
Zeba Tuz Giderme sütunlarıTermo-BilimselPI-87770Biyotinilasyon Kitinin kullanımından sonra yeni biyotinile edilmiş antikorları saflaştırmak için kullanılır. Şu adreste verilen talimatlar: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf
EZ Link Sulfo NHS Düşük Ağırlıklı Biyotinilasyon KitiTermo-BilimselAntikorları yakalama yüzeyi ile bütünleşmelerini sağlamak için biyotinillemek için kullanılır
Plaka OkuyucuBioTekSynergy HTX Çok Modlu OkuyucuTitrasyon deneylerinde floresan yoğunluğunu kantitatif olarak ölçmek için kullanılır.
içinde çözer saklanır s modifiye edilmiş Eagle medium Hücre Ortamı UIUC ,, Axiovert 200M (Floresan Mikroskobu) Zeiss N/A Zeiss Axiovert 200 M ters floresan mikroskobunu

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Erdbruegger, U., Haubitz, M., Woywodt, A. Circulating endothelial cells: a novel marker of endothelial damage. Clin. Chim. Acta. 373 (1-2), 17-26 (2006).
  2. De Spiegelaere, W., Cornillie, P., Van Poucke, M., Peelman, L., Burvenich, C., Van den Broeck, W. Quantitative mRNA expression analysis in kidney glomeruli using microdissection techniques. Histol. Histopathol. 26 (2), 267-275 (2011).
  3. Chen, S., Guo, X., Imarenezor, O., Imoukhuede, P. I. Quantification of VEGFRs, NRP1, and PDGFRs on Endothelial Cells and Fibroblasts Reveals Serum, Intra-Family Ligand, and Cross-Family Ligand Regulation. Cell. Mol. Bioeng. 8 (3), 383-403 (2015).
  4. Cheung, L. S. L., et al. Detachment of captured cancer cells under flow acceleration in a bio-functionalized microchannel. Lab Chip. 9 (12), 1721-1731 (2009).
  5. Privorotskaya, N., et al. Rapid thermal lysis of cells using silicon-diamond microcantilever heaters. Lab Chip. 10 (9), 1135-1141 (2010).
  6. Park, K., Akin, D., Bashir, R. Electrical capture and lysis of vaccinia virus particles using silicon nano-scale probe array. Biomed. Microdevices. 9 (6), 877-883 (2007).
  7. Galletti, G., Sung, M., Vahdat, L. Isolation of breast cancer and gastric cancer circulating tumor cells by use of an anti HER2-based microfluidic device. Lab Chip. 14 (1), 147-156 (2014).
  8. Schudel, B. R., Choi, C. J., Cunningham, B. T., Kenis, P. J. A. Microfluidic chip for combinatorial mixing and screening of assays. Lab Chip. 9 (12), 1676-1680 (2009).
  9. Lien, K. Y., Chuang, Y. H., et al. Rapid isolation and detection of cancer cells by utilizing integrated microfluidic systems. Lab Chip. 10 (21), 2875-2886 (2010).
  10. Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a. PNAS. 107 (35), 18392-18397 (2010).
  11. Yu, M., Ting, D., Stott, S., Wittner, B., Ozsolak, F. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
  12. Sheng, W., Ogunwobi, O., Chen, T., Zhang, J. >Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab Chip. 14 (1), 89-98 (2014).
  13. Zheng, X., Cheung, L. S. L., Schroeder, J. A., Jiang, L., Zohar, Y. A high-performance microsystem for isolating circulating tumor cells. Lab Chip. 11 (19), 3269-3276 (2011).
  14. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantification and cell-to-cell variation of vascular endothelial growth factor receptors. Exp. Cell Res. 317 (7), 955-965 (2011).
  15. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Expression of VEGF receptors on endothelial cells in mouse skeletal muscle. PLoS One. 7 (9), e44791(2012).
  16. Ludwig, A., Kretzmer, G., Schügerl, K. Determination of a "critical shear stress level" applied to adherent mammalian cells. Enzyme Microb. Technol. 14 (3), 209-213 (1992).
  17. Ansari, A., Lee-Montiel, F. T., Amos, J., Imoukhuede, P. I. Secondary anchor targeted cell release. Biotechnol. Bioeng. 112 (11), 2214-2227 (2015).
  18. Drenan, R. M., Nashmi, R., Imoukhuede, P., Just, H., McKinney, S., Lester, H. A. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits. Mol. Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).
  19. Imoukhuede, P. I., Dokun, A. O., Annex, B. H., Popel, A. S. Endothelial cell-by-cell profiling reveals temporal dynamics of VEGFR1 and VEGFR2 membrane-localization following murine hindlimb ischemia. Am J Physiol Hear. Circ Physiol. 4 (8), H1085-H1093 (2013).
  20. van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).
  21. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantitative fluorescent profiling of VEGFRs reveals tumor cell and endothelial cell heterogeneity in breast cancer xenografts. Cancer Med. 3 (2), 225-244 (2014).
  22. BD Biosciences. CD Marker Handbook: Human and Mouse. , at: https://www.bdbiosciences.com/documents/cd_marker_handbook.pdf (2010).
  23. Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows. Biotechnol. Bioeng. 104 (2), 360-370 (2009).
  24. Processing Blood. , at: https://www.google.com/patents/US20140030238 (2014).
  25. Fukuda, S., Schmid-Schönbein, G. W. Centrifugation attenuates the fluid shear response of circulating leukocytes. J. Leukoc. Biol. 72 (July), 133-139 (2002).
  26. dela Paz, N. G., Walshe, T. E., Leach, L. L., Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. Role of shear-stress-induced VEGF expression in endothelial cell survival. J. Cell Sci. 125 (Pt 4), 831-843 (2012).
  27. Allard, W. J., et al. Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant Diseases Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant diseases.". Clinical Cancer Research. 10, 6897-6904 (2005).
  28. Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
  29. Chen, S., Weddel, J., Gupta, P., Conard, G., Parkin, J., Imoukhuede, P. I. QFlow Cytometer-Based Receptoromic Screening: A High-throughput Quantification Approach Informing Biomarker Selection and Nanosensor. Submiss. , (2016).
  30. Vasa, M., et al. Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease. Circ. Res. 89 (1), E1-E7 (2001).
  31. Hirsch, J. D., Eslamizar, L., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Anal. Biochem. 308 (2), 343-357 (2002).
  32. Wilchek, M., Bayer, E. A. Applications of Avidin-Biotin Technology: Literature Survey. Methods Enzymol. 152 (1), 183-189 (1987).
  33. Wu, X., et al. Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots. Nat. Biotechnol. 21 (1), 41-46 (2002).
  34. Lee-Montiel, F. T., Imoukhuede, P. I. Engineering quantum dot calibration standards for quantitative fluorescent profiling. J. Mater. Chem. B. 1, 6434(2013).
  35. Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof. , Available from: http://www.google.com/patents/US5512439 (1996).
  36. Naranbhai, V., et al. Impact of blood processing variations on natural killer cell frequency, activation, chemokine receptor expression and function. J. Immunol. Methods. 366 (1-2), 28-35 (2011).
  37. Yadav, A. R., Sriram, R., Carter, J. A., Miller, B. L. Comparative study of solution-phase and vapor-phase deposition of aminosilanes on silicon dioxide surfaces. Mater. Sci. Eng. C. 35 (1), 283-290 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Glass Surface FunctionalizationCell Capture ReleaseBiotinylated AntibodiesDesthiobiotin StreptavidinAPTES Surface TreatmentCell Isolation MethodFluorescence Imaging AnalysisFlow Cytometry DownstreamTumor Angiogenesis ScreeningPersonalized Medicine Diagnostics

İlgili makaleler