Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Transkripsiyon Faktörleri ile fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama bir Hemogenic Programı tetikleyebilecek

6.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/54372

⸱

16 Aralık 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Developmental and Regenerative Biology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2The Graduate School of Biomedical Science, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 5Department of Pharmacology and Systems Therapeutics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Bu makalede

Özet

Burada açıklanan protokol, minimal bir transkripsiyon faktörü setinin aşırı ekspresyonu yoluyla fare embriyonik fibroblastlarında bir hemojenik programın indüksiyonunu detaylandırır. Bu teknoloji, hematopoez, hematolojik hastalık ve hematopoietik kök hücre nakli ile ilgili gelecekteki çalışmalar için platformlar sağlamak üzere insan sistemine çevrilebilir.

Özet

Bu protokol, transkripsiyon faktörlerinin (TF'ler) aşırı ekspresyonu yoluyla fare embriyonik fibroblastlarında (MEF'ler) bir hemojenik programın indüksiyonunu detaylandırır. İlk olarak, insan CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) çift transgenik farelerden elde edilen MEF'leri kullanarak bir raportör ekranı tasarladık. Bu farelerden elde edilen CD34 + hücreleri, H2B histonlarını GFP ile etiketler ve doksisiklin (DOX) eklendikten sonra etiketlemeyi durdurur. MEFS, aday TF'lerle transdüksiyona tabi tutuldu ve daha sonra hematopoietik veya endotel hücre kaderinin edinilmesini gösterecek GFP + hücrelerinin ortaya çıkışı için gözlendi. 18 aday TF ile başlayarak ve bir kombinatoryal eleme süreci boyunca, en yüksek GFP + hücre yüzdesini indükleyecek minimal bir faktör seti elde ettik. Gata2, Gfi1b ve cFos'un gerekli olduğunu ve Etv6'nın eklenmesinin optimal indüksiyonu sağladığını bulduk. Yeniden programlama işlemi sırasında farklı zaman noktalarında yapılan bir dizi gen ekspresyonu analizi, bu hücrelerin endotelyalden hematopoietik geçişe (EHT) uğrayan bir öncü hücreden geçiyor gibi göründüğünü ortaya koydu. Bu nedenle, bu yeniden programlama süreci, gelişimsel hematopoezi "bir tabakta" taklit eder, bu da hematopoezin in vitro olarak incelenmesine ve bu spesifikasyonun altında yatan mekanizmaları tanımlamak için bir platforma izin verir. Bu metodoloji aynı zamanda, hematolojik hastalıkların tedavisi ve incelenmesinde bir dizi uygulama için hastaya özgü hematopoietik kök hücrelerin (HSC'ler) alternatif bir kaynağı oluşturma umuduyla bu çalışmanın insan sistemine çevrilmesi için bir çerçeve sağlar.

Giriş

Hematopoiezis hematopoetik kök hücreler (HSC) bu tür Aort-Gonad-mesonephros olarak embriyonik hematopoetik siteleri ve plasenta 1,2 çeşitli mevcut hemogenic endotel kapalı tomurcuk karmaşık bir gelişimsel süreçtir. In vitro olarak kültürü HSCler yetersizlik bu işlemin derinlemesine analizi gibi, bu çalışmaların klinik uygulama önler. Bu sınırlamayı aşmak için, daha önceki çalışmalar elde girişiminde HSCler de novo da yeniden programlama ortamı 4,5 kullanarak pluripotent kök hücreler (PSC) 3 veya somatik hücrelerinde olduğu plastikliği ve yönlendirilmiş farklılaşma farklılaşması ile. Ancak bu çalışmalar, klinik güvenli engraftable hücreleri oluşturmak veya kesin gelişimsel hemopoeziste çalışma izin vermez "bir tabak."

somatik fibroblastlar p gelen Yamanaka ve arkadaşları tarafından kurulan yeni iş kaynaklı üretmek için pluripotent kök hücreler (iPSCs)Transkripsiyon faktörü (TF) yeniden programlama hücre kaderine 6,7 göre aşırı stratejileri için bir çerçeve rovides. Bu eser kolayca elde somatik hücre TF reprogramming yoluyla seçim hücre tipleri oluşturmak için çeşitli alanlarda araştırmacılara yol açtı. Burada anlatılan yeniden programlama stratejisinin amacı fare somatik in vitro insan hematopoez incelemek için hastaya özgü fibroblastlar yeniden programlamak için insan sisteme bu bulguları tercüme amacı ile TF tabanlı yeniden programlama yaklaşımını kullanarak hücreleri ve bir hemogenic süreci teşvik etmek hastalık modelleme, ilaç testi için hastaya özgü kan ürünlerini üretmek ve kök hücre nakli.

Bu fare sistemdeki uygun yeniden programlama sağlamak için ilk adım CD34 ifadesi, endotelyal progenitör hücrelerin ve HKH'lerin bilinen bir işaretleyici için bir okuma-out olarak görev yapan bir muhabir hattı geliştirmekti. Bunu yapmak için, huCD34-TTA teto-H2BGFP transgenik fare hattı g kullanılmıştırenerate çift transgenik fare embriyonik fibroblastlar (MEFS), şimdi CD34 promotör 8 aktivasyonu üzerine yeşil floresan 34 / H2BGFP, ifade etti. Bu hematopoietik tarifnamede ve gelişme sırasında farklı noktalarda gerekli olduğu bilinmektedir TFs çeşitli tarama sağladı. PMX retrovial vektörleri 18 TFs ile başlayarak 34 / H2BGFP MEFS AFT024 stromal hücreler HSC destekleyen tüm faktörler ve kültürlü transduced, (34 / H2BGFP fareler açıklanan literatür madencilik ve daha önce gelen HKH'lerin istinat GFP etiketin profil aracılığıyla belirlenir). muhabir aktivasyonu için TFs optimal set tespit edilene kadar 34 / H2BGFP aktivasyon algıladıktan sonra, TF sonradan yeniden programlama kokteyli çıkarıldı. Bu ilk taramayla sonra faktörler TFS kontrol ekspresyonunu sağlamak için DOX uyarılabilir pFUW vektör sistemine aktarılmıştır. Bu iki DOX kontrol sistemi (34 / H2BGFP hücreleri ve pFUW uyarılabilir vektörleri), gelen MEF'ler uyumlu olduğuvahşi tip C57BL / 6 fareleri gerekmiştir. Hemogenesis devam ve mültilineaj clonogenic atalarıdır oluşturmak için izin veren uygun bir mikro sağlamak için de gerekliydi.

Hematopoetik kök ve progenitör hücreler içine (HSPCs) somatik hücre yeniden programlamak için çalışırken Güncel çalışmalar başarı 9-11 değişik düzeylerde bir araya geldi. Bugüne kadar, fare ve uzun vadeli ve kendini sürekli yenileyen repopulating yeteneği ile insan transplante HSPCs hem nesil TFs aynı seti kullanılarak elde edilmemiştir. Bu protokol, biz tekrarlanabilir MEFS içinde hemogenesis ikna etmek için daha önce kurulmuş stratejinin ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Bu TFs (Gata2, Gfi1b cFos ve Etv6) en az bir setinin giriş göstermektedir gelişim hematopoez ve hematopoietik yeniden programlama klinik uygulamasının 12 incelenebilir hangi bir platform sağlar in vitro bir karmaşık gelişim programı tahrik edebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Etik bildirimi: Fare hücre hatları Sina Dağı'nda Tıp Icahn Okulu hayvan bakım yönergeleri izleyerek elde edilir ve herhangi bir ev sahibi kurum ile uyumlu yapılmalıdır.

C57BL / 6 fareleri 1. Fare Embriyonik fibroblast (MEF) İzolasyon

  1. Zamanlanmış çiftleşme 13 ayarlayın. vajinal fiş görüntülenmiştir sonra, bu Günü'nü 0.5 düşünün.
  2. Fiş tarihinde takılı kadın ayırın ve gebelik onaylamak için Gün 10-11 onları kontrol.
  3. Gün 13,5-14,5 CO aracılığıyla servikal dislokasyon ardından 2 inhalasyon hamile dişi farelerin euthanize.
  4. ,% 70 etanol ile hamile kadın karnı emmek orta hatta aşağı steril makas ve forseps ile karın boşluğuna incelemek ve cerrahi embriyoların 14 içeren rahim boynuzları kaldırın. Kalan karın dokusu kesilerek hafifçe embriyolar dışarı atın.
    NOT: her tarafta 4 ile yaklaşık 8 embriyolar kurtarın.
  5. rahim h yerleştirinSteril soğutulmuş fosfat tamponlu tuz (PBS) 5-10 ml olan bir 10 cm tabak embriyoları içeren orns.
  6. Steril makas ve forseps ile rahim boynuzları boyunca bir kesi embriyolar taşıyan keseleri izole yapmak. PBS soğutulmuş steril 5-10 ml yeni 10 cm çanak keseler aktarın ve buz üzerinde yerleştirin.
  7. Steril soğutulmuş PBS 5-10 ml yeni 10 cm çanak içine keseler birkaç koyun. Steril makas ve forseps yavaşça embriyolar piercing önlemek için (çok derin kesmeden) keseleri açık kesti kullanma.
  8. göbek bağını keserek plasentadan embriyolar ayırın.
  9. soğutulmuş PBS 5-10 ml içeren yeni bir 10 cm'lik çanak embriyo transferine ve kalan disseksiyonların tamamlarken buz üzerinde bırakın.
  10. Steril forseps kullanarak embriyolar başını kesmek. Dikkatle karın açmak için dekapite alandan başlayarak steril makas ve forseps kullanarak embriyonun orta hatta aşağı kesti. Pozisyon t altında forsepso viseral organlar (kalp, karaciğer de dahil olmak üzere, ve akciğerler) ve 15 onları kazımak.
  11. tripsin 10 ml içeren 50 ml'lik konik tüp makas ve forseps ve transfer kullanarak küçük parçalar halinde kalan doku kesin.
  12. Pipet yukarı ve 20-30 kez 10 ml'lik pipet ile aşağı karıştırın ve doku ayırmak.
  13. arada bir dönen, 45 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde doku ve tripsin karışımı inkübe edin.
  14. Pipet yukarı ve aşağı doğru yaklaşık 5 dakika süre ile, 10 ml pipet ile karıştırılmaları için.
  15. % 10 fetal bovin serumu ile standart Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) (FBS), hacmi 3x tripsinize edilmiş hücre ekleme 10 ug / ml penisilin / streptomisin (P / S), ve 1 mM L-glutamin (L-GLUT) 'de 10 cm'lik kaplar (~ 10 mi) ve birleşik (yaklaşık 2-4 gün) kadar 37 ° C 'de kültür. 10 cm çanak başına 1-2 embriyolar hakkında Kültürü.
    NOT: plakalar kez Freeze hücreleri konfluent. Dondurulmuş hücreler çözündürüldü ve 2 kez daha geçirilmiştir edilebilir. Hücreler, diğer şekilde,çözüldükten sonra sonra bir kez daha dondurma öncesinde 2 defa bölünmüş, ve.

2. Viral Üretim

  1. % 10 FBS, transfeksiyon için% 1 P / S, ve% 1 L-GLUT 10 mi DMEM ile 10 cm plakalar içinde 293T hücreleri genişletmek.
    1. 2 mi tripsin ile tripsinize 293T hücreleri, 5 dakika süreyle 37 ° C'de inkübe 300 xg'de 15 ml tüpler, döndürme hücreleri toplamak, ve uygun bir şekilde levha (10 cm tabak başına 10 mi).
  2. 6 ve kaplama 10 cm jelatin tohum (PBS içinde% 0.1 jelatin) plakaları: 24 saatlik bir transfeksiyon önce, 293T hücreleri 1 arasında birleşik 10 cm plaka ayrıldı.
    NOT: virüs başına 4 tabak gerekli olacaktır.
    1. jelatin kaplama plakaları için, kat 10 cm plakalar alt% 0.1 jelatin çözeltisi, en azından 2 ml ekleyin. En az 20 dakika süreyle 37 ° C'de inkübe edin. plakalara hücrelerin eklemeden önce aspire jelatin.
  3. 15 ml'lik bir tüp içinde, (84 ug plazmid ilave örneğin Gata2, Gfi1b, CFos veya Etv6 (pFUW-teto vect içine alt klonlandıveya 16) ya da FUW-M2rtTA 17), 84 ug psPAX2 ve 42 ug pMD2.G. Su ekleyin (H 2 O) 2 ml hacmi telafi etmek. Her faktör için bir tüp hazırlayın (örn. Gata2, Gfi1b, cFos, Etv6 ve FUW-M2rtTA).
  4. Seçilen genin 84 ug oluşan 2 mi karışımı içeren her tüpe 2M CaCI2 250 ul (Gata2, Gfi1b, CFos, Etv6 ya FUW-M2rtTA) + 84 ug psPAX2 + 42 ug pMD2.G + H2O .
  5. Pipet-yardım sokulan bir Pasteur pipeti kullanarak, serbest 2.25 ml DNA + H 2 O + 2 M CaCl2 karışımı içine kabarcıklar. kabarcıkları imal edilmektedir gibi, cam pipet karşı P1000 bir ucu ile yavaş yavaş çıkarır 2 100 mM N, N-bis (2-hidroksietil) yeniden süspanse 1 aşağı -2-aminoetan sülfonik asit (BES), tuzlu su ml Aynı anda mi.
  6. En az 15 dakika boyunca oda sıcaklığında kültürü kaputu tüpleri inkübe edin.
    NOT: 4.25 ml karışım (şimdi DNA + H 2 O + 2M CaCl2 + BES tuz) hafifçe bulanık bakacağız.
  7. Karışım, aspirat ortam dışı 293T plakaları kuluçkaya ve 10 ml DMEM +% 10 FBS + 1 mM L-glutamin + 25 nM chloroquine ilave olarak.
    NOT: Bu ortam P / S içermez.
  8. Inkübasyondan en az 15 dakika sonra (ya da 293T hücreleri üzerinde ortamının değiştirilmesi kadar) O + 2 M CaCI2 + BES tuzlu su karışımı, tüp başına 4 hücre plakaları eşit bir şekilde dağıtılmasına, 293T hücrelerinde damla damla 4.25 ml DNA + H2 ilave (plaka başına karışımının, yani biraz daha fazla 1 mi).
  9. 37 ° C'de gece boyunca plakaları (O / N) inkübe edin.
  10. 24 saat sonrası inkübasyon, 4 ml standart DMEM (adım 1.15 bakınız) bütün kalıplarda ortamı değiştirin.
  11. Şu andan itibaren bir 32 ° C inkübatör hücreleri tutun.
  12. 24 saat adımı 2.10 sonra, ayrı 50 ml tüpler içine medya toplamak. Standart DMEM 4 ml ile her plaka toplanan ortamı değiştirin.
    NOT: Toplanan medya 16 ml ilk tüp karışımı sonuçlarına göre 4 tabak.
    1. birFrangoulis inkübasyon 12 saat, aynı 50 ml tüpler içine tekrar medyayı toplamak ve standart DMEM başka 4 ml ile değiştirin.
    2. inkübasyon 12 saat sonra, ortam toplama ve aynı 50 ml tüpler ekle.
      NOT: Her tüp şimdi virüs içeren medya yaklaşık 48 ml içermelidir.
  13. 0.45 uM düşük-protein bağlayıcı filtre ile toplanan virüs birinci filtre toplanan medya zenginleştirilmesi için kullanılması.
  14. Viral konsantrasyon santrifüj tüplerine (bir seferde yaklaşık 16 ml) içine virüs içeren süzülmüş medyayı dökün.
  15. 25 dakika boyunca 4 ° C'de 4000 x g'de santrifüj ve akış-through çıkarın.
    NOT: Konsantre medya ve virüsün küçük hacimli filtre görünür olacaktır.
  16. Filtrede kalan konsantre edilir medya + virüs hacmine süzüldü virüs içeren ortam bir 16 ml ilave edilir ve tüp tersine çevirerek karıştırın.
  17. Sıkma tüpü yeniden 25 dakika karıştırıldı ve ıskarta akış yoluyla 4 ° C'de 4,000 x g'de.
  18. süzülmüş kalan EkleKonsantre medya + virüs hacmine toplama filtresinin içinde kalan ve tersini tüp karıştırın.
  19. (Filtre hacmine bağlı olarak) 10-20 dakika süreyle 4 ° C'de bir kez daha 4000 x g ve spin filtrede kalan konsantre edilir medya + virüs kalan hacim yaklaşık 1 mi olduğundan emin olun. Konsantre medya + virüsün daha fazla 1 mi filtrede kalırsa, 1 dakika için 4000 x g hızında tekrar santrifüj ve 1 mi filtrede kalan kadar yineleyin.
  20. 1.5 ml tüpler içinde konsantre edilmiş virüs 200 ul kısım ve -80 ° C'de dondurularak veya hemen kullanın.

3. MEF yeniden programlanması

  1. Ön kaplama jelatin de tüm alanını kaplar temin PBS göz başına% 0.1 jelatin, 0.5 ml 6 oyuklu plakaları,. 37 ° C inkübatör içine yerleştirildi ve en az 20 dakika inkübe edilir. inkübasyondan sonra, plakaları kaldırmak ve jelatin aspire.
  2. oyuk başına 25,000 hücre olan bir yoğunlukta, standart DMEM ile levha MEF'ler (150,000 hücreve adım 3.1 jelatinize 6 plaka (lar)) 6-çukurlu plaka başına 37 ° C kuluçka makinesi içinde O / N oturmasına izin verin.
  3. Gata2, Gfi1b, cFos ve Etv6 bir karışımını (12.5 ul her biri) 50 ul M2rtTA karıştırma ve kalan 50 ul ile 100 ul virüs kokteyl hazırlayın.
  4. MEFS aspire medya ve 8 ug / ml hexadimethrine bromür ile 2 mL standart DMEM ekleyin.
  5. Virüs kokteyl 15 ul MEF plakaların her transdüksiyonu ve 37 ° C 'de O / N inkübe edin.
    NOT: Bu yeniden programlama sürecinin Gün 0'dır.
  6. Gün 1, inkübasyon 16-20 saat sonra, / ml DOX oyuk başına 1 ug ile desteklenmiş 2 ml taze standart DMEM ile medya değiştirin.
  7. Hidrokortizon (10 -6 M), 100 ng / kök ml hücre faktörü (SCF), 100 ng / ml fms ilgili tirosin kinaz 3 ligandı (Flt3L), 20 ng / ml Interleukin-3- (IL-ile takviye edilmiş, hematopoetik kültür ortamı hazırlamak 3), 20 ng / ml IL-6 (IL-6) ve 1 ug / ml DOX.
  8. 4. Gün Aspirat üzerindeHer e ortam de ve oyuk başına 1 ml PBS ile yıkama hücreleri.
  9. PBS aspire, kuyu başına% 0.05 tripsin 1 ml kullanarak hücreleri ayırmak ve hücreleri toplamak.
  10. Adım 3.7'de tarif edilen hematopoietik ortam 12 ml, 5 dakika, tekrar süspansiyon 300 x g hızında, bir hemositometre ile bir spin hücrelerin sayısı ve% 0.1 jelatin kaplı plakalar 6 oyuklu plaka başına 60,000 hücre plakasına (2 mi göz başına 10,000 hücre, oyuk başına ).
  11. kültür süresi (35 ila 36 gün) boyunca her 6 gün taze katkılı hematopoetik kültür ortamı ile değiştirin.
  12. Hemogenic endotelyal HSC benzeri belirteçler ve gen ifadesinin satın teyit etmek için immüno-lekeleme 12, FACS analizi 8,12, qRT-PCR, 12 ve mRNA sıralaması 12 yoluyla ara-madde hücreleri veya gelişmekte olan hematopoietik benzeri hücreleri ya da analiz edin.

Metilselüloz 4. Plasental Toplama ve Koloni Oluşturan Birim (CFU) Tahliller

  1. Hamile C5 gelen plasenta teşrih7BL / 6 fareler daha önce E12.5 18 tarif ve buz üzerinde doku tutun.
  2. Plasenta ayrışmasını 19 Başlangıç olarak,% 20 FBS ile PBS içinde 2-5 ml% 0.2 kollajenaz tip plasental doku yıkama ve mekanik iğne ile plasenta ve PBS pasaj ile 5 ml şırıngaya takılan, bir 18G iğne ile ayırmak, en azından 3 kere.
  3. Mekanik ayırmadan sonra, 1.5 saat boyunca 37 ° C 'de kolajenaz çözeltisi 2-5 ml plasenta hücreleri tutun.
  4. 20-25 G iğne ile Passage hücreleri daha mekanik plasenta hücreleri ayırmak için 5 ml şırınga üzerine birkaç kez takıldı.
  5. 70 mikron hücre süzgeçler sayesinde tek hücre süspansiyonları Filtre.
  6. Bir hemasitometre ile hücre sayımı ve mitotik inaktivasyonu 20 2000 cGy de ışın tedavisi.
  7. 10 cm ila 100 ng / ml SCF, 100 ng / ml flt3L, 20 ng / ml IL-3, 20 ng / ml IL-6, ve 10 ng / ml trombopoietin (TPO) ile desteklenmiş hematopoietik kültür ortamı 10 ml tabak.
    Not: DOX bu aşamada gerekli değildir.
  8. bir sıvı-gaz ​​arabirimi oluşturmak ve bir kenara çanak ayarlamak için float izin çanak hematopoetik kültür ortamında doğrudan bir 0.65 mikron filtre yerleştirin.
  9. adımda 3,8-3,10 tarif edildiği gibi (adım 3.11 türetilmiş) gün 25 transduse MEFS ayrıştırmaları ve adım 4.6 plasental agrega 167.000 hücre ile dönüştürülmüş MEF'ler 33.000'i karışımı (1: 6 oranında).
  10. 300 x g'de 5 dakika boyunca adım 4.9 bir toplam 18,21, MEF aşağı ilk döndürme ve plasental hücre karışımı üretmek için. 200 ul nonbevelled pipet içine tek bir hücre süspansiyonu çizim, medya aspire ve P200 pipet kullanarak standart DMEM 30-50 ul pelet hücreleri tekrar süspansiyon.
  11. parafin film ile pipet tıkamak. 15 ml santrifüj tüpüne bloke ucu yerleştirin ve ucu kapalı sonunda 300 xg'de 5 dakika boyunca öylesine bir pelet formları aşağı doğru döndürün.
  12. 15 ml dikkatle tüp ve yerden ucu çıkarınP200 pipet ucuna ucu. parafin filmi atın ve adım 4,8 yüzen filtre üzerine hücre pelet a'ya.
    NOT: Filtre başına en fazla 3 agrega Levha.
  13. Kültür,% 5 CO2 ile 37 ° C, 4-5 gün boyunca kayan 0.65 um filtreler üzerinde toplar.
  14. hücreleri ayırmak için bütün plasenta ile yapılan protokolün aynısına (4.2-4.5 adımlar) Aşağıdaki, bir hücre kazıyıcı ile agrega (filtre başına en fazla 3) toplayın bunları birleştirmek, ve% 0.2 kollajenaz ile sindiremez.
  15. PBS 2-5 ml% 5'lik FBS ile takviye ile ayrışma sonrasında agrega yıkama ve 5 dakika boyunca 300 xg'de hücreleri aşağı doğru döndürün.
  16. FBS, P / S, ya da L-GLUT olmadan DMEM 500 ul agrega yeniden süspanse edin. Bu, 500 | il yeniden süspansiyon alın ve 10 dikkatle kabarcık oluşumunu önlemek, TPO ng / ml ile takviye edilmiş 3 mi,% 1 metilselüloz ortama ekleyin. 3 35 x 10 mm muamele edilmemiş kültür tabaklarında Bu karışımın Levha eşit hacimleriCFU 12 deneyleri.
  17. Bir kontrol olarak, kültür adımları 4,7-4,16 yukarıda tarif edildiği gibi de CFU tahlilleri programlandı MEF'ler 4-5 gün ve yeri karıştırılmadan plasental agrega ışınlanmış.
    NOT: Bu agregalar yalnız koloniler oluşturur yok.
  18. El,% 5 CO2 ile 37 ° C 'de kültür 10-14 gün sonra bir mikroskop altında hematopoietik kolonileri sayın.
  19. Cytospin 22 tek hücrelerin morfolojik fenotip gösteren koloniler aldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Hematopoiezis çeşitli embriyonik sitelerde başlayan karmaşık bir gelişimsel süreçtir. Hemogenic endotel hücreleri bu sitelerde ikamet ve hücre 23 tomurcuklanan yoluyla HKH'lerin doğuran. Bu süreç şu anda HSPC genişleme ex vivo olarak ya da kuşak de novo yoluyla, her nasılsa in vitro bu hücreleri elde etmek için bir metodoloji gerektiren, kültürde HKH'lerin veya hematopoetik öncülerini koyarak yeniden edilemez. Bu protokol MEFS TF aşırı ekspre...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Kolayca elde edilebilen somatik hücrelerden HSPC'lerin de novo olarak üretilmesi, hematopoezi in vitro incelemek için benzersiz bir yöntem ve bu teknolojiyi potansiyel olarak insan sistemine uygulama fırsatı sunar. Bu çeviri, bir tabakta insan hematolojik hastalığını incelemek için yeni bir araç oluşturacak ve aynı zamanda çok sayıda bozukluğu yeni terapötikler veya HSC nakilleri ile tedavi etmek için ilaç test platformları ve gen hedefleme fırsatları sağlayacaktır. Bu alanda, son çalışmalar HSPC'leri d...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, K.M. ve I.R.L.'ye (1RO1HL119404) bir NHLBI hibesi ile desteklenmiştir. Carlos-Filipe Pereira, Revson Kıdemli Biyomedikal Bursu'nun sahibi oldu. Materyaller ve protokoller konusunda yardım için Mount Sinai hESC/iPSC Ortak Kaynak Tesisine ve S. D'Souza'ya minnetle teşekkür ederiz. Ayrıca Mount Sinai Akış Sitometrisi, Genomik ve Fare tesislerine de teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DMEMInvitrogen11965-092
0.45 μ M filtreleriCorning430625
Amicon Ultra santrifüj filtrelerMilliporeUFC900324
Penisilin / Streptomisinİnvitrojen15140-122
L-Glutaminİnvitrogen25030-081
FBSGemini'nin Kıyaslaması100-106
PBSYaşam Teknolojileri14190-144
18 G iğnelerBD305195
20 G iğnelerBD305175
25 G iğnelerBD305125
Kollajenaz Tip ISigmaC0130-100MG
TrypLE ExpressInvitrogen12605-010
Miyelokült medyaKök Hücre TeknolojileriM5300
SCFAr-Ge D Sistemleri455-MC
Flt3LAr-Ge D Systems427-FL
IL-3Ar-Ge D Systems403-ML
IL-6Ar-Ge D Systems406-ML
TPOAR-GE D Sistemleri488-TO
DoksisiklinSigmaD9891-1G
Polibren (heksadimetrin bromür)SigmaAL-118
Durapore 0.65 & mu; M membran filtrelerMillipore DVPP14250
Metilselüloz ortamıKök Hücre TeknolojileriMetokült M3434
HidrokortizonKök Hücre Teknolojileri07904
C57BL / 6 farelerJackson Laboratuvarı000664
JelatinSigmaG-1890 100g
pFUW-tetOAddgenePlazmid #20321
Gata2OrigeneMR226728
Gfi1bOrigeneMR204861
cFos AddgenePlazmid #19259
Etv6OrigeneMR207053
psPAX2AddgenePlazmid #12260
pMD2.GAddgenePlazmid #12259
CaCl2SigmaC5670-100g
FUW-M2rtTAAddgenePlazmid #20342
35 mm x 10 mm kültür yemeklerThermo Scientific171099

Kaynaklar

  1. Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
  2. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
  3. Papapetrou, E. P., Sadelain, M. Reconstructing blood from induced pluripotent stem cells. F1000 Med Rep. 2, (2010).
  4. Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
  5. Mitchell, R., et al. Molecular evidence for OCT4-induced plasticity in adult human fibroblasts required for direct cell fate conversion to lineage specific progenitors. Stem Cells. 32 (8), 2178-2187 (2014).
  6. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  7. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  8. Qiu, J., Papatsenko, D., Niu, X., Schaniel, C., Moore, K. Divisional history and hematopoietic stem cell function during homeostasis. Stem Cell Reports. 2 (4), 473-490 (2014).
  9. Riddell, J., et al. Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors. Cell. 157 (3), 549-564 (2014).
  10. Sandler, V. M., et al. Reprogramming human endothelial cells to haematopoietic cells requires vascular induction. Nature. 511 (7509), 312-318 (2014).
  11. Daniel, M. G., Pereira, C. F., Lemischka, I. R., Moore, K. A. Making a Hematopoietic Stem Cell. Trends Cell Biol. , (2015).
  12. Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
  13. Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab Anim (NY. 38 (9), 305-310 (2009).
  14. Jain, K., Verma, P. J., Liu, J. Isolation and handling of mouse embryonic fibroblasts). Methods Mol Biol. 1194, 247-252 (2014).
  15. Bryja, V., Bonilla, S., Arenas, E. Derivation of mouse embryonic stem cells. Nat Protoc. 1 (4), 2082-2087 (2006).
  16. Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (1), 157-162 (2009).
  17. Hockemeyer, D., et al. A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 3 (3), 346-353 (2008).
  18. Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
  19. Gekas, C., K, E. R., H, K. A. M. Isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta. J Vis Exp. (16), (2008).
  20. Lewis, I. D., et al. Umbilical cord blood cells capable of engrafting in primary, secondary, and tertiary xenogeneic hosts are preserved after ex vivo culture in a noncontact system. Blood. 97 (11), 3441-3449 (2001).
  21. Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
  22. Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
  23. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
  24. Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view. Genes Dev. 21 (23), 3044-3060 (2007).
  25. Butler, J. M., et al. Development of a vascular niche platform for expansion of repopulating human cord blood stem and progenitor cells. Blood. 120 (6), 1344-1347 (2012).
  26. Gori, J. L., et al. Vascular niche promotes hematopoietic multipotent progenitor formation from pluripotent stem cells. J Clin Invest. 125 (3), 1243-1254 (2015).
  27. Bar-Nur, O., et al. Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage. Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).
  28. Maza, I., et al. Transient acquisition of pluripotency during somatic cell transdifferentiation with iPSC reprogramming factors. Nat Biotechnol. 33 (7), 769-774 (2015).
  29. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  30. Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. "Epigenetic memory: phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
  31. Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372(2014).
  32. Vereide, D. T., et al. An expandable, inducible hemangioblast state regulated by fibroblast growth factor. Stem Cell Reports. 3 (6), 1043-1057 (2014).
  33. Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Rep. 9 (5), 1871-1884 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Transkripsiyon Fakt r A r EkspresyonuHemojenik Program nd ksiyonuHematopoetik Prek rs r H crelerEndotelyal Hematopoetik Ge iGata2 Gfi1b cFos Etv6CD34 tTA TetO H2BGFP FarelerMetilsel loz CFU AnaliziPlasental Agregat K lt rDOX nd klenebilir Sistem
Transkripsiyon Faktörleri ile fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama bir Hemogenic Programı tetikleyebilecek
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.