Method Article

Kütle Sitometri Analizi için Numune Hazırlama

DOI:

10.3791/54394

⸱

April 29th, 2017

 ,  , 
1Epigenetics and Molecular Carcinogenesis, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, kütle sitometrisi analizi için örneklerin toplanmasını ve işlenmesini açıklamaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kütle sitometrisi ağır metal etiketler, iyi sitometrisi geleneksel floresan bazlı akışıyla mümkün olanın ötesine parametreleri ve derin analiz için imkânlar artırılmıştır ölçüde olan bir yaklaşımla konjuge antikorları kullanır. Herhangi bir yeni teknoloji olduğu gibi, yüksek kaliteli veri güvenilir nesil sağlamaya yardımcı kritik adımlar vardır. kütle sitometri analizi için hücre örneklerinin işleme için birden çok teknikler içerir optimize edilmiş bir protokol burada sunulmuştur. Burada anlatılan yöntemleri kullanıcı ortak tuzaklardan kaçınmak ve yanlış verilere yol açabilir değişkenliği, minimize ederek tutarlı sonuçlar elde yardımcı olacaktır. Deneysel tasarım bilgilendirmek için, protokol ve araştırılmaktadır sisteminin biyolojide yeni bulgular ortaya çıkarmada bu etkinliği açısından isteğe bağlı veya alternatif aşamalar arkasındaki mantık kaplıdır. Son olarak, temsilci veri teknikleri présente beklenen sonuçları göstermek için sunulmuşturBurada d.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sitometri büyük hücre popülasyonları arasında, bir tek hücre düzeyinde birden, antikor hedefi ölçümünü sağlar. Geleneksel flüoresan bazlı akış sitometrisi olarak, ölçülebilir parametre sayısı parametreleri sayısı arttıkça daha karmaşık dengeleme hesaplamalar gerektirir birden florofor emisyon spektrumu arasındaki spektrum çakışmasının ile sınırlıdır. Bu kısıtlamalar, ağır metal-konjüge edilmiş antikorları tespit edilir ve büyük ölçüde eş zamanlı olarak toplanır parametre sayısını arttırmak ve her bir hücre için yüksek bir boyutsal protein bolluğu profilini elde etmek için bir uçuş (TOF) kütle spektrometresi zaman ile hesaplanır kütle sitometrisi tarafından ele alınmaktadır.

enstrümanın sitometrisi kütlenin çalışmaları bir temel anlayış kullanıcıya faydalıdır ve sorun giderme için gerekli olabilir. Daha kapsamlı bir ayar açıklaması ve kitlesel sitometrisi makinesini çalıştıran için,ilgili el yazması 1 'e bakınız. Kısaca, bir hücre numunesi, hücre yüzeyi markerleri sitoplazmik proteinleri, nükleer proteinler, kromatin bağlı proteinleri veya (Şekil 1i) 'in diğer epitopları hedefleyen metal konjuge bir antikor paneli ile etiketlenir. Sınıflandırılmış hücreler, bir otomatik numune alıcı ile makineye yüklenmiş, ya el ile enjeksiyon sureti ile bir zamanda bir ya da olduğu, 96 oyuklu bir plaka örnekler. Yüklü hücreler hücreler (Şekil 1ii) kapsül, sıvı damlacıkları spreyini üreten bir nebulizer aracılığıyla enjekte edilir. Hücreler, bir argon plazma lambasının iyonize böylece Bu sprey konumlandırılır. Bu iyonizasyon her bir hücre (Şekil 1iii) oluşturan bütün atomlardan müteşekkil bir partikül bulutu oluşturur. Bu partikül bulutu detektöre ettikçe, düşük atomik kütle atomu, bir dört kutuplu kütle filtre ile yüksek kütle iyonu ayrılır. Geri kalan, yüksek kütle iyonlarını dedektörü, abund devamHer bir izotopun formans (Şekil 1iv) ölçülür. detektör tarafından toplanan ham veriler, hücre olayları tanımlamak için kitle sitometrisi enstrüman yazılımı tarafından analiz edilir. Tanımlanan her bir hücre etkinliği için, her bir kanal tespit sinyali ölçülür ve bir çıkış .fcs dosyaya kaydedilir. ağır metal olarak birleştirilmiş antikorlarını tespit etmek için kullanılan seri kanal% 1'in altında en katılım% 0-4 arasında değişmektedir az spektral örtüşme sergiler. Çünkü kanallar arasında bu düşük çapraz konuşma, analiz 2 önce bir telafi matris veri dönüştürmek için genel olarak gereksizdir. Ancak, bakım, bu gibi, bir yüksek bolluk epitopa sahip bir antikor, bir düşük miktardaki bir antikor atanmış bir kanala sinyali katkıda bulunan bir kütle kanalına tahsis emin olmak için antikorların deneysel panelinin tasarımı sırasında alınmalıdır sinyal katkı alıcı kanalın bir yapay yüksek nüfus oluşturmak.

sitometri analizi kütle için numune kesin hazırlanması toplanan numunelerin tiplerine bağlıdır ve deney hipotezi test edilir. Bu farklı hücre tiplerini (insan embriyonik kök hücreler) ve birincil hücreler (fare meme tümörü epitel hücre izolatı) hasat etmek üzere iki protokol örneklerini temin etmektedir. Bir kitle sitometrisi Çalışmanın başlangıcında, her şeyden önce protokolleri ve antikorlar araştırmacının elinde iyi çalışıyoruz yararlanılacak sağlamak için küçük bir pilot deneyi yürütmek için tavsiye edilir. Özel konjüge antikorlar kullanılacak olan bu antikor, konjugasyon sırasında kısmi indirgeme reaksiyonu gibi antikor afinitesini bozmaya potansiyeline sahip, özellikle önemlidir; Bu nedenle, her bir özel antikorun veri doğruluğunu sağlamak için deneysel olarak doğrulanmış edilmesi gerekmektedir. bunlar ne ise hücre yüzeyi antikorları tespit sonrası epitoplarını tanıyacak tahlilinde kullanılabilir veya eğer diğer hususlar anlaşılması,ed hücrelerini canlı uygulanacak. Peptit-MHC 3, 4 boyanması ile oluştuğu bilinmektedir gibi bazı sabitleme hücre yüzeyi antikorlarıyla uygun boyama engelleyebilir. Canlı hücreler üzerinde hücre yüzey antikoru boyamasını gerçekleştirilmesi bazı antikorlar için gerekli olabilir, ama bu antikor bazlı barkod 6, 7, bir durum olduğu halde en çok barkod yöntemleri tespit 5 sonra gerçekleştirilir gibi antikor etiketleme önce barkod seçeneğine engeller olabilir.

hücre sayısının belirlenmesi analizi için hazırlanacak olduğunda, makine üzerine yüklenen hücrelerin sadece bir kısmı tespit edilecek biliyoruz ve veri üretmek için önemlidir. nebülizör torçta örnek spreyler, bu kayıp verimsizliklere esas kaynaklanmaktadır. Kesin yüzde kaybı% 50-85 arasında olabilir makine kurulumu ve hücre tipi ama sitometrisi kütlesine bağlıdır ve olmalıdeney tasarımı düşündü. Bu protokol, numune başına 2x10 6 hücreleri için optimize edilmiş ama daha küçük ya da daha büyük örneklerin işlenmesi için uyarlanabilir. Bu protokol, ancak örnek sayısı, bir deney içinde tutarlı tutulması önemlidir, 4 x 10 6, 1 x 10 6 örnek boyutları için, en az modifikasyon ile kullanılabilir. Hücre sayısındaki değişimler barkod ve antikor boyama yoğunluğunu etkileyebilir ve numuneler doğrudan karşılaştırılmalarını mümkün boyunca yaklaşık tutarlı tutulmalıdır.

tüm deneysel tasarımlar değilse böyle ölü hücre etiketleme ve DNA etiketleme gibi bazı uygulamalar ise, büyük çoğunluğunda yapılmalıdır. Sadece yüzey belirteçleri analiz eden deney ölü hücrelerin etiketlenmesi Rh103 kullanılarak elde edilebilir, ancak Rh103 bu boyama kaybına yol açtığı için geçirimli hale gereklidir deneyler için kaçınılmalıdır. geçirgenliği içeren deneyler için, sisplatin kullanılması tavsiye edilir 8 ve yukarı mümkün olduğunda, yarık PARP ve klivaj Kaspaz tanıyan bir antikor apoptotik ve ölü hücrelerin tespit etmek.

Çizgi örnekler, antikor tüketimini azaltmak etme süresini azaltmak ve ortadan kaldırabilen örnek-örnek değişkenlik 9. barkod süreci menşe örnek için her hücre atamak için kullanılan tüm hücreler, benzersiz bir numuneye özgü kod uygulanmasını içerir. örnekleri barkod sonra antikor boyaması, tüm örnekler eşit boyanmış sağlayan bir yönteme önce toplanmış olabilir. Deneysel hatayı en aza indirmek için, barkodun ihtiyatlı ve doğrudan birbirlerine karşılaştırılacak hiçbir örnekleri havuz. Şu anda (aşağıya bakınız) burada sunulmaktadır ikisi analizi 5, 6, 7, sitometrisi kitle için örnek barkod için çeşitli yöntemler de mevcuttur.

şu anda mevcut Reagen ile38, antikor hedefi bolluğu ölçmek S-fazı 10 hücreleri tespit canlı ve ölü hücreler 8 ayırt ve çok sayıda numune bir çoğullamalı deneyde hipoksi 11 hücresel seviyelerinin ölçülmesi mümkündür ts. Büyük hücre popülasyonları için yüksek bir parametre, tek bir hücre veri toplamak için bu yeteneği yüksek ölçüde heterojen bir hücre popülasyonlarının iyileştirilmiş profil sağlar ve daha önce, yeni biyolojik anlayış, 12, 13, 14, 15, 16, bir dizi üretti. Yorumlanabilir bilgilere elde edilen kompleks veri Damıtma Kapsayan Ağaç Yoğunluk Normalize Olayların Gelişimi (maça) 17 ve vişne 18 de dahil olmak üzere bilgisayar algoritmaları kullanımını gerektirmiştir.

Bu makale erişilebilir bir sunarnasıl genel tasarım ve deney sitometri bir kitle yürütmek ve veri sitometrisi kitlenin temel analizini tanıtır için.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre Hasat

  1. Primer doku hasat hücrelerin
    Not: Primer doku hasat hücreleri için tarif edilen işlem, fare meme tümör dokusu için özel olarak uygulanabilir ve başka kaynaklardan, birincil dokular için uygulanabilir olmayabilir.
    1. 5 mg hiyaluronidaz ve doku gramı başına 10 ml DMEM / F12 ortamında 30 mg kolajenaz çözülmesiyle sindirim tamponu hazırlayın işlenecek. sindirim tampon sterilize filtre.
    2. Fare ve kayıt tümör ağırlığından birincil meme bezi tümörü izole edin.
    3. en az 5 dakika süreyle 10. neşter ile dokusunu inceltmek.
    4. sindirim tamponu (doku gramı başına 10 ml tampon) uygun hacme kıyılmış doku ekleyin.
    5. 37 ° C'de 1-3 saat boyunca 100 rpm'de sindirim tamponu içinde kıyılmış doku çalkalayın.
    6. 50 ml'lik bir tüp içine 0.4 um'lik bir filtre boyunca hücrelerin geçirilerek tek bir hücre süspansiyonu elde edilir.
    7. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin hücreleriC. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire.
    8. Yeniden süspanse 4 ml DMEM / F12 içinde topak, 5 ml yuvarlak tabanlı bir tüpe transfer.
  2. Doku kültüründen hasat hücrelerin
    1. Plakayı ya da oda sıcaklığında, kalsiyum ve magnezyum içermeyen fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yapışık hücre şişesi.
      Not: hasat hücreleri için tarif edilen teknik, insan embriyonik kök hücre (HESC) kültürü hücrelerinin yapışık özellikle geçerlidir. Bununla birlikte, tarif edilen protokol kalan diğer kültürlenmiş hücre çizgileri, yapışkan olmayan hatları ve primer hücreler geniş çapta uygulanabilir.
    2. yapışkan hücrelerden tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için optimize edilmiş bir ısıtılmış (37 ° C), tripsin ve diğer enzimatik sindirim reaktif ekleyin. Üreticinin protokolü takip edin.
      Not: tripsin ve diğer enzimatik ayrılma reaktif hücre işaretçileri etkileme potansiyeli vardır.
    3. 37 ° C'de inkübasyona bırakılır2-5 dakika hücreleri ayırmak için ° C. yüksek confluency kültürler için, hafifçe hücreleri ayırmak yardımcı olmak için plakayı dokunun.
    4. 5 mL'lik yuvarlak tabanlı tüp içine levhadan tamamen müstakil hücreleri aktarın ve yavaşça hücreleri ayırmak için 1 ml pipet kullanılarak pipetleyin.
      Not: Tüm adımlar, alternatif olarak, bir 96 yuvalı yuvarlak tabanlı plaka içinde gerçekleştirilebilir örneklerin çok sayıda işlem için. 96 oyuklu bir formatta örneklerinin işlemden geçirilmesi için tüm yıkamalar 250 uL'lik bir hacimde gerçekleştirilir. Toplam hacim 300 uL aşmayacak şekilde diğer adımlarda açıklanan miktarlar ayarlanabilir.
    5. (PBS içinde% 0.5 BSA ve% 0.02 sodyum azit) eşit hacimde yıkama tamponu ile enzimatik sindirim reaksiyon ajanı söndürüldü.
      NOT: Sodyum azid tehlikeli kimyasaldır. Uygun güvenlik önlemleri kendi üretim ve taşıma bakımından uyulmalıdır.
    6. 37 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire.
    7. süspanse edin1 ml serumsuz ortamdaki hücreler.
    8. bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne hücre süspansiyonu 10 uL transfer hücreleri sayın. tripan mavisi ve bir hemositometrede transfer veya otomatik hücre sayım sisteminde bilinen bir orana kısım seyreltin.
  3. S-faz nüfus Etiketleme
    NOT: S-fazı etiketleme olmayan gerçekleştirilecekse 1.4 kök devam edin.
    1. Her 2 x 10 6 hücre analiz edilmesi için serumsuz DMEM F12 veya diğer uygun ortam içinde 10 uM 5-İyodo-2'-deoksiüridin, 1 mL (DUK) hazırlayın.
    2. Her 2 x 10 6 hücre için serumsuz ortam içinde 10 uM Idu 500 uL ekleyin.
      Not: DUK etiketleme serum ihtiva eden ortam içinde yapılabilir olmakla birlikte, serbest protein, ölü hücrelerin uygun etiketleme önlenmesi, sisplatin ile reaksiyona girer. Serum içeren ortam etiketleme DUK sırasında kullanılan, ek bir yıkama aşaması serumsuz ortam sisplatin ölü / canlı sta öncesinde serum proteinleri uzaklaştırmak için gerekli olan biradencilik.
    3. Yavaşça 1 mL pipet ile pelet yeniden süspanse edin.
    4. hafif sallama ile 37 ° C'de 10 dakika süreyle inkübe edilir.
  4. Canlı / Ölü etiketleme
    1. Her bir örnek için serumsuz DMEM-F12 ya da hücre tipi, uygun ortam içinde 50 uM sisplatin 500 uL hazırlar.
      Not: DUK S-fazı nüfusun etiketleme değildir yapılacak ise, 4 x 10 6 hücre / mL'lik bir konsantrasyonda tekrar süspansiyon örnekleri. sisplatin ekleyerek tekdüze canlı / ölü etiketleme için çözümlerin daha çabuk karışmasını sağlayan önce hücrelerin tekrar asılı.
    2. Örnekler 2 x 10 6 hücre başına 50 uM sisplatin 500 uL ekleyin.
    3. sürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde 1 dakika için oda sıcaklığında (RT) inkübe edin.
    4. Yıkama tamponunun eşit bir hacmi ile sisplatin söndürün.
    5. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire.
    6. İki kez yıkayın numuneleri500 uL yıkama tamponu ile aşırı sisplatin kaldırın.
    7. İki kez 500 uL PBS ile yıkayın numuneler aşırı protein kaldırmak için.
  5. Numune sabitleme
    1. 500 ul PBS içerisinde yeniden süspanse örneği.
    2. % 2'lik bir nihai konsantrasyona PBS içinde% 4 PFA eşit miktarda ilave et; pipet karıştırmak için.
      Not: 6.9 arasında olan pH seviyesini ve 0.44 um filtre içinden geçmesi, toz,% 4 PFA taze hazırlayın. PBS içinde% 4 PFA, iki haftaya kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir. genellikle ölçülen kütle kanallarında parazite yol açabileceği metal kirleticiler içerir olarak, özel olarak, test edilinceye ampuller verilen önceden yapılmış formalin, kaçının. PFA alt konsantrasyonu yeterli olduğu ve antikor bağlanması ile tespit etkisini en aza indirmek için yardım ancak ampirik olarak test edilmelidir olabilir.
    3. sürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 15 dakika süreyle inkübe edilir.
    4. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle yüzer wi aspirethout topağına zarar.
    5. PBS ile yıkayın örnekleri PFA çözüm kaldırın.
      NOT: Bu adımda numuneler 4 ° C'de kısaca saklanabilir. 4 ° C'de uzun süreli depolama örneğinin bozulmasına neden ve azaltılmış lekeleme olabilir.

2. Barkodlama

NOT: Monoizotopik sisplatin barkodlama ve paladyum barkod kullanan için metodoloji aynı anda sunulurken, ya bağımsız kullanılabilir veya deney için gerekli değilse tamamen kaçınılmalıdır.

  1. Monoizotopik Cisplatin Barkodlanması
    NOT: Canlı / Ölü boyama kanalları bakım örtüşen itimat sisplatin barkodlama ve sisplatin canlı hücrelerde bu arka plan sisplatin Canlı / Ölü boyanma sağlamak için alınması gereken bu yana sisplatin barkod doğruluğu engel olabilecek bu şekilde en aza indirilir.
    1. PBS içinde 200 uM ila 1 mM monoizotopik sisplatin stok çözeltileri ile seyreltilir.
    2. e içinACH benzersiz sisplatin barkod bu barkod alan her 2 x 10 6 hücre için 500 ul PBS ile 1.5 ml tüp hazırlanır.
    3. Her benzersiz barkod 200 nM nihai konsantrasyona geçerli her Monoizotopik sisplatin eklemek hazırlamak için.
    4. 2 x 10 6 hücre başına 500 ul PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
    5. Her bir örnek için, karşılık gelen barkod çözeltisinin eşit hacim.
    6. sürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    7. Yıkama tamponunun eşit bir hacmi ile sisplatin söndürün.
    8. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire.
    9. iki kez 500 uL yıkama tamponu ile yıkayın örnekleri fazla sisplatin kaldırın.
  2. paladyum Barkodlama
    Not: Paladyum barkod reaktifleri, hazırlanan 5 ya da ticari olarak satın alınabilir.
    1. kısmi Geçicipermeabilization 19
      NOT: reaktif hücre zarlarını geçmek ve sağlam hücre etiket için palladyum şelasyon barkod kısmi geçirgenliği gerektirir.
      1. 500 uL PBS ile yıkayın örnekler.
      2. 500 uL PBS artı% 0.02 saponin ile yıkayın örnekler.
      3. kalıntı hacme yeniden süspanse pelet.
    2. Paladyum barkodu sistemi.
      1. 1 ml buzla soğutulmuş PBS artı% 0.02 saponin paladyum barkod reaktifi 100x stokunu.
      2. Hızla yeniden süspansiyon haline getirilmiş numune için seyreltilmiş barkod reaktifmi.
      3. sürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 15 dakika süreyle inkübe edilir.
      4. Yıkama örnekleri iki kez 500 uL yıkama tamponu.

3. Hücre Yüzeyi Boyama

NOT: Hücre yüzey boyama öncesinde tespit canlı hücreler üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu thei için afinite kaybeder antikorlar için gerekli olabilirtespit sonrasında R epitopu. Bazı hücre numuneleri, örneğin arka planı azaltmak için önceki antikor etiketleme lökositlerin Fc engellenmesi gibi ek bloke yararlanabilir. Optimum bloke ampirik olarak belirli bir numune tipi için belirlenmelidir.

  1. Hücre yüzeyi antikor boyama paneli hazırlayın.
    1. 1.5 ml tüp içine her numune başına 0.5 mg / mL, hücre yüzeyi antikorun 0.5 uL, ya deneysel olarak belirlenmiş miktarda bir araya getirin. örnek başına 10 uL hacmi getirmek için gerektiğinde yıkama tamponu ilave edin. Pipetleme ile karıştırın.
      NOT: titrasyon deneyi ile empirik deney öncesinde her bir antikor için seyreltme çalışma belirler.
    2. eşit biçimde, her bir numune için bir 1.5 ml tüp içine Bölünmüş hücre yüzeyi antikor havuzu lekelenmesine.
    3. Her numune için, 1.5 ml bir tüp içinde, yıkama tampon 500 ul hazırlayın.
  2. Tüm numuneler için normalize hacmindeki numunelerine Hücre yüzeyi lekelenmesi uygulayın.
    NOT: ens içinBirden fazla numune boyunca ure tutarlı Antikor etiketleme dikkatli bir numune hacmi ve antikor konsantrasyonunu kontrol etmek için son derece önemlidir. Aşağıdaki adımlar, antikor ilave edildikten sonra son numune hacimleri tek biçimli olduğu sağlayarak bu kıvam elde etmek amacı.
    1. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire.
    2. 50 uL 200 uL pipet seti ile, parçalara ayrılır, hücre yüzey antikoru havuzunun bir tüpe örnek pelet ve transfer kalan çözelti çıkarın.
    3. Pipet ucu içine hava çizmeden alikot tüp tüm sıvı kadar Pipet.
    4. Pipet pistonu tutan çekme önlemek için ise hava tampon ve pistonu serbest yıkama 500 uL hazırlanmış bir tüp içine ucu hareket eder.
    5. örnek üzere pipet ucu içeriğini geri eklenir ve yavaşça pipetleme ile sıvı içinde örnek tekrar süspansiyon.
    6. 1 için numune inkübesürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında h.
    7. iki kez 500 uL yıkama tamponu ile yıkayın örnekleri tüm serbest antikor, yıkanıp emin olmak için.
    8. 500 uL PBS ile yıkayın örnekler.
    9. 500 ul PBS içinde hücre pelletini.
    10. PBS içinde% 4 PFA eşit miktarda ilave et; pipet karıştırmak için.
    11. bir orbital çalkalayıcı üzerinde 10 dakika boyunca inkübe edin.

4. hücre geçirgenliği ve hücre içi boyanması

  1. Hücre permeabilization
    1. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire.
    2. Pelet ayrışmış kadar yavaşça girdap oluşturarak kalıntı hacim içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
      Not: MeOH birbirlerine yapışmasını hücreleri neden olur eklenmesi ve kısmen örnek kaybına neden olan bir ince film üretmek için önce hücreleri ayırmak için başarısızlık.
    3. Hemen 1 ml, 2 x 10 6 100% MeOH ilave </ Sup> hücreler ve karıştırmak için hafifçe pipet.
      Not: diğer geçirgenleştirilmesi yöntemleri MeOH ile ikame edilebilir ve bazı hücre tipleri için uygun geçirgenliği elde etmek için gerekli olabilir. hala tutarlı geçirgenliği sağlarken, bazı hücre kaynakları için bir% 0.1 Triton X-100, geçirgenliği için PBS çözeltisi içinde% 0.2 Tween-20 veya% 0.1 saponin, daha iyi bir hücre bütünlüğünü muhafaza edebilir.
    4. geçirgenliği için 4 ° C'de 24 saat, en fazla en az 1 saat süre ile veya en fazla inkübe edin.
      Not: MeOH örnekleri -80 ° C'de en fazla 1 aya kadar saklanabilir Bu adımda.
    5. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire.
    6. Her MeOH örnek permeabilize kullanılan ml yıkama tamponu 1 mL ekleyin. Yavaşça hücre pelletini.
    7. 500 uL yıkama tamponu ile iki kez örnek yıkayın.
  2. Hücre içi antikoru boyama paneli hazırlayın.
    1. 1.5 ml tüp içine her numune başına 0.5 mg / mL, hücre içi antikoru 0.5 uL, ya deneysel olarak belirlenmiş miktarda bir araya getirin. örnek başına 10 uL hacmi getirmek için gerektiğinde yıkama tamponu ilave edin. Pipetleme ile karıştırın.
    2. eşit biçimde, her bir numune için bir 1.5 ml tüp içine hücre içi antikoru havuzu bölme.
    3. Her numune için, 1.5 ml bir tüp içinde, yıkama tamponu 500 uL hazırlayın.
  3. Tüm numuneler için normalize hacmindeki numunelerine intraselüler boyama uygulayın.
    Not: dikkatle numune hacmi ve antikor konsantrasyonunu kontrol etmek için çok önemli olan çok sayıda numune tutarlı antikor etiketleme sağlamak.
    1. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire.
    2. 50 uL ayarlanmış 200 uL pipetle numunelere hücre yüzeyi antikor havuzunun bir tüpe örnek pelet ve transfer çözeltisi kalan kaldır.
    3. Pipetkadar alikot tüp içindeki sıvı tüm pipet içine hava çekmek olmadan.
    4. Pipet pistonu tutan çekme önlemek için ise hava 50 uL bir toplam numune hacmi için yıkama tamponu hazırlanması, tampon ve pistonu serbest yıkama 500 uL hazırlanmış bir tüp içine ucu hareket eder.
    5. örnek üzere pipet ucu içeriğini geri eklenir ve yavaşça pipetleme ile sıvı içinde örnek tekrar süspansiyon.
    6. sürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 1 saat için inkübe edin.
    7. Yıkama örnekleri iki kez 500 uL yıkama tamponu.
    8. 500 uL PBS ile yıkayın örnekler.

5. İridyum Etiketleme

  1. Fix numuneleri
    1. 500 ul PBS içinde yeniden süspanse örnekleri.
    2. PBS içinde% 4 PFA 500 uL ekleyin.
    3. sürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 15 dakika içinde en az inkübe edin.
  2. DNA iridyum etiketleme uygulayın
    1. 62.5 nM konsantrasyona PBS içinde% 4 PFA içinde 125 uM 500x iridyum interkalasyon reaktifi seyreltin.
    2. örnekler 500 uL 62.5 nM iridyum PFA solüsyonu ekleyin.
      NOT: overstaining önlemek için 2.000: permeabilize hücreleri kullanılarak deneyler için, bir son 1 seyreltme için 500x Ir191 / 193 stok seyreltin.
    3. sürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 15 dakika süreyle inkübe edilir.
      Not: güçlü Ir193 sinyalleri Pt194 kütle kanala katkı olumsuz barkod kalitesini etkileyebilir çünkü monoizotopik sisplatin barkodu performans daha uzun, 15 dakika boyunca iridyum ile örnekleri inkübe yoksa.
    4. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire.
    5. iki kez süzüldü, iyonu giderilmiş su içinde 500 uL% 0.1 BSA ile yıkayın örnekler.
      NOT: Bir kere mümkünse biz 24 saat içinde numuneleri çalıştırmanızı öneririz hazırladı. Hazırlanan numuneler, 4 ° C'de kısa süreli saklanabilirancak bakım bozulmasını önlemek için alınmalıdır. bu alet temizleme azalacaktır makinesinin püskürtme odası ve örnekleyici konileri birikimini azaltmak gibi son yıkama BSA'sız süzülmüş deiyonize su içinde yapılmalıdır mümkünse. HESC için, BSA boru yüzeyine yapışmasını örnek kaybını önlemek için de dahil olmak üzere iken, bu yıkama işlemi gerekmektedir.

6. Acquisition'ın Örnekleri hazırlayın

  1. hücre sayımı
    1. süzülmüş deiyonize su içinde 500 uL% 0.1 BSA içinde yeniden süspanse hücreleri ve 35 um hücre filtresi kapağı boyunca taze tüpe filtre.
      NOT: son yıkar için BSA seviyesini düşürmek Kitle sitometrisi püskürtücü kalıntısından azalır. Yapışmayan hücreler yıkanır ve süzülmüş deiyonize su içinde yeniden süspanse edilebilir.
    2. mikrosantrifüj tüpüne hücre süspansiyonu 10 uL transfer hücreleri sayın. bilinen bir orana kısım seyreltintripan mavisi (hücre görselleştirme yardım etmek için) ve bir hemositometrede veya otomatik hücre sayımı sistemine aktarılır.
    3. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire.
  2. Hazırlama ve yük örnekleri
    1. Kalibrasyon boncuklar buzdolabından çıkarın ve yeniden süspansiyon haline getirilmesi şiddetle çalkalanır hazırlamak.
    2. otomatik numune alıcı sitometri kütlesi kullanılarak örnekleri çalışan, daha sonra analiz edilecek olan arzu edilen hücre sayısını eklemek numune plakasının her oyuğuna kalibrasyon, boncuk tanelerin 50 uL ekleyin. kılavuzu enjeksiyon ile çalışan örnekleri örneklemek için kalibrasyon, boncuk tanelerin 50 mcL ise, süzüldü, iyonu giderilmiş su içinde numunenin seyreltilmesi karıştırın ve Kütle sitometrisi örnek enjeksiyon portuna yük örneği. Uygun numune seyreltme analiz edilen hücre tipine bağlı olarak değişebilir, ancak, 10 6 bir seyreltme 1 genel olarak uygundur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan protokol geniş yalnızca küçük değişiklikler ile kültürlenen ve primer hücre örneklerinin çeşitli uygulanabilir. örneğin barkod veya hücre yüzeyi boyama gibi bazı elemanlar, gerekli olmadığında deney gereksinimlerine bağlı olarak, bir modüler şekilde gerçekleştirilebilir. bütünüyle Kullanılan bu protokol ölü hücre dışlama, S-fazı nüfus tanımlanması için etiketlenmiş ve 38 kadar, antikor hedefi ölçümü için boyanmış numunelerin sitometri birden fazla mesaj göndermiş kütle haz...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan protokol başarıyla çeşitli kültürlenmiş hücre çizgileri (H1 ve H9 HESC, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) ve birincil doku örnekleri (fare kemik iliği, fare embriyonik karaciğer, fare yetişkin işlenmesi için kullanılan edilmiştir karaciğer, fare tümör). Bağımsız kaynağı, hücre durumunu muhafaza sitometrisi kütle analizi için uygun olmalıdır, ancak bir protokol optimizasyon gerektirebilir ise tek hücre halinde ayrılabilir bir doku. Bazı epitoplar kullanılan spesifik ayrışma, fiksasyon ve permeabili...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Barton laboratuvarındaki çalışma, Teksas Kanser Önleme ve Araştırma Enstitüsü'nden (CPRIT RP110471) bir hibe ile desteklenmiştir. Bu araştırma kısmen, Ulusal Sağlık Enstitüleri Moleküler Genetik Eğitim Programı 5 T32 CA009299'den Ryan L. McCarthy için bir eğitim bursu ile desteklenmiştir. Kütle sitometri makinesini koruyan ve çalıştıran çekirdek tesis, CPRIT hibesi (RP121010) ve NIH çekirdek hibesi (CA016672) ile desteklenmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
mTeSR1 orta kitKök Hücre teknolojileri05850Kullanmadan önce oda sıcaklığında ılık
DMEM F-12ThermoFisher11330-03237 ° C'de sıcak; ° C kullanmadan önce
AccutaseKök Hücre teknolojileri0792037 'de sıcak; ° Kullanmadan önce C
Sığır serum albüminiEquitechBAH62
fosfat tamponlu salinHycloneSH30256.01
SaponinSigma-Aldrich47036
Hücre Kimliği Pt194Fluidigm1 'de Sağlanır; mM
hücre kimliği pt195fluidigm1 'de sağlanır; mM
hücre kimliği pt196fluidigm1  mM
CisplatinEnzo Yaşam BilimleriALX-400-040-M25025 'ye kadar çözünür; mg / mL DMSO
Cell-ID 20-plex Pd Barkodlama KitiFluidigm201060
5-İyodo-2'-deoksiüridinSigma-AldrichI712574 'ye çözünür; 0.2 'de mg / mL; N NaOH
Rodyum 103 intercelating ajanFluidigm201103A
MetanolFisherBP1105-4-20 'de soğutun; ° C kullanmadan önce
Sodyum AzideSigma-AldrichS2002
5 mL yuvarlak tabanlı tüplerFalcon352058
5 mL 35 & # 956; m filtre kapağı tüpleriFalcon352235
EQ dört elemanlı kalibrasyon boncuklarıFluidigm201078
Hyaluronidaz Tip I-SSigma-AldrichH3506
Clostridium histolyticumSigma-AldrichC9891'den
Tek Kullanımlık Neşter #10Sigma-AldrichZ69239
kollajenaz

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. J Vis Exp. , e4398(2012).
  2. Leipold, M. D. Another step on the path to mass cytometry standardization. Cytometry A. 87, 380-382 (2015).
  3. Newell, E. W., et al. Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization. Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).
  4. Leong, M. L., Newell, E. W. Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).
  5. Zunder, E. R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nat Protoc. 10, 316-333 (2015).
  6. Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry A. 87, 369-374 (2015).
  7. Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).
  8. Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry A. 81, 467-475 (2012).
  9. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3, 361-368 (2006).
  10. Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81, 552-566 (2012).
  11. Edgar, L. J., et al. Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry. Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).
  12. Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
  13. Horowitz, A., et al. Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry. Sci Transl Med. 5, 208ra145(2013).
  14. Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry. Cell Stem Cell. 16, 323-337 (2015).
  15. Han, L., et al. Single-cell mass cytometry reveals intracellular survival/proliferative signaling in FLT3-ITD-mutated AML stem/progenitor cells. Cytometry A. 87, 346-356 (2015).
  16. Bendall, S. C., et al. Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development. Cell. 157, 714-725 (2014).
  17. Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).
  18. Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).
  19. Behbehani, G. K., et al. Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining. Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).
  20. Finck, R., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83, 483-494 (2013).
  21. Chester, C., Maecker, H. T. Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data. J Immunol. 195, 773-779 (2015).
  22. Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data. Methods. 82, 55-63 (2015).
  23. Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).
  24. van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizaing Data using t-SNE. J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).
  25. Kling, J. Cytometry: Measure for measure. Nature. 518, 439-443 (2015).
  26. Gregori, G., et al. Hyperspectral cytometry. Curr Top Microbiol Immunol. 377, 191-210 (2014).
  27. Chattopadhyay, P. K., et al. Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments. Cytometry A. 81, 456-466 (2012).
  28. Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).
  29. Frei, A. P., et al. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nat Methods. 13, 269-275 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mass CytometrySample PreparationCell StainingCisplatin LabelingAntibody CocktailIridium LabelingSPADE AlgorithmFlow CytometrySingle Cell AnalysisCell Permeabilization

Related Articles