Yöntem makalesi

Tek ya da Eşlik Kimya / Elektrik / Kesme Stres Uyaranların altında Hücresel Yanıtları incelenmesi için mikroakışkan Cihazlar Tasarımı

DOI:

10.3791/54397

⸱

13 Ağustos 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Agricultural Chemistry, National Taiwan University, 2Department of Physics, Fu-Jen Catholic University, 3Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akışkan bileşenlerle entegre edilmiş mikro fabrikasyon cihazlar, in vivo mikro ortamı taklit eden hücre çalışmaları için in vitro bir platform sağlar. Tek veya bir arada bulunan kimyasal/elektriksel/kesme gerilimi uyaranları altında hücresel tepkileri incelemek için polimetilmetakrilat bazlı mikroakışkan çipler geliştirdik.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroakışkan cihazlar pH, sıcaklık, tuz konsantrasyonu, ve diğer fiziksel ya da kimyasal uyarılara bir hassas ve kontrollü hücresel mikro çevrede oluşturma yeteneğine sahiptir. Bunlar genellikle çevresi gibi in vivo sağlayarak in vitro hücre çalışmaları için kullanılmıştır. bu olayların hücresel özellikleri ve işlevleri anlamada önemli olduğundan özellikle hücreleri kimyasal geçişlerini, elektrik alanlar ve kayma gerilmeleri cevabını kaç ilgi çekmiştir. Bu mikro-akışkan yongaları, cam substratlar silikon gofret, polidimetilsiloksan (PDMS) polimer, polimetilmetakrilat (PMMA) alt-tabakalar ya da polietilentereftalat (PET) alt tabakaların yapılabilir. Bu malzemelerin dışında, PMMA substratlar ucuz ve kolay bir şekilde lazerle ablasyonu ve yazma kullanılarak işlenebilir. Birkaç mikroakışkan cihazları, birden üreten kimyasal ve elektrik uyarılarının eşlik için tasarlanmış ve imal edilmiş olmasına rağmen, bunların hiçbiri kabul edildiYeterince tarama amacıyla özellikle deneysel tekrarlar, azaltılmasında etkili. Bu yazıda, tek veya eşlik eden kimyasal / elektrik / kayma gerilmesi uyaranlara altında, reaktif oksijen türlerinin üretimi ve göç, hücresel yanıtları araştırmak için iki PMMA esaslı mikroakışkan cips bizim tasarım ve imalat açıklar. İlk çip beş göreli konsantrasyonları üretir 0, 1/8, birlikte bu alanların her birinde içinde üretilen bir kayma gerilmesi gradyan ile kültür bölgelerinde 1/2, 7/8, ve 1. İkinci çip ancak her kültür alanı içinde oluşturulan beş farklı elektrik alan güçlü olan, aynı bağıl konsantrasyonlarını oluşturur. Bu cihazlar sadece hassas, kontrollü mikro-çevre hücreleri sağlamak değil, aynı zamanda büyük ölçüde deneysel verimi arttırmak değil.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vivo hücreler ekstrasellüler matriks (ECM), karbonhidratlar, lipidler ve diğer hücreleri dahil biyomoleküllerin çeşitli çevrili içinde. Bunlar çeşitli büyüme faktörleri kimyasal degradeler için ECM ile etkileşimler ve yanıtları mikro çevresel uyaranlara yanıt vererek işlerlik. Hücre ve reaktiflerin tüketimi büyüktür ve hücre ortamı (dışı dolaşım) statik yetiştiği Geleneksel olarak, in vitro hücre çalışmaları Hücre kültür tabaklarında yürütülmektedir. Son zamanlarda, akışkan bileşenleri ile entegre mikro fabrikasyon cihazlar daha kontrol edilebilir bir şekilde hücre çalışmaları için alternatif bir platform haline gelmiştir. Bu tür cihazlar hücreleri ve reaktifler tüketimini en aza indirirken, kimyasal ve fiziksel uyaranlar kesin bir mikro-ortam yaratma yeteneğine sahiptir. Bu mikro-akışkan yongaları, cam substratlar silikon gofret, polidimetilsiloksan yapılabilir (PDMS) polimerleri, polimetilmetakrilat (PMMA) alt-tabakalar ya da polyethylenetereftalat (PET) 1-3 alt tabakalar. PDMS tabanlı cihazlar uzun vadede hücre kültürü ve çalışmalar için uygun hale, şeffaf biyolojik olarak uyumlu ve gazlara karşı geçirgendir. PMMA ve PET yüzeyler, lazer ablasyon ve yazma kullanılarak işlenecek ucuz ve kolaydır.

Mikroakışkan cihazlar hücreleri, farklı kimyasal ve fiziksel uyarıcılara maruz kalan bir sabit ve kontrollü mikro ortam hücreleri sağlamalıdır. Örneğin, mikro-akışkan fiş hücrelerinin kemotaksisini incelemek için kullanılır. Bunun yerine Boyden odası ve kılcal 4,5 bu minyatür akışkan cihazlar hücrelerin davranışlarını 1,6,7 çalışmak için kesin kimyasal degradeler oluşturabilir istihdam geleneksel yöntemlerin. Başka bir örnek elektrik alanları (EFS), bir fenomen adlı electrotaxis altında hücrelerin yönlü göç incelemektir. Hücrelerin Electrotactic davranışları, rejenerasyon 8, embriyonik gelişme 9 ile ilişkili olduğu bildirilmiştirve 10,11 yara iyileşmesi. Ve birçok çalışma, 14,15 lenfositlerin, kanser hücreleri 12,13 dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinin electrotaxis araştırmak için lösemi hücrelerini 11 yapıldı ve hücreler 16 kök edilmiştir. Geleneksel olarak, petri ve örtücü camlar EF'lerini 17 üretilmesi için electrotactic odaları oluşturmak için kullanılır. Böyle basit kurulumları orta buharlaşma ve kesin olmayan EF sorunlarını teşkil, ama onlar kapalı, iyi tanımlanmış akışkan kanalların 12,18,19 ve mikroakışkan cihazlar aşılabilir.

sistematik hassas, kontrol kimyasal ve elektriksel uyaranlar altında hücresel yanıtları incelemek için, aynı anda birden fazla uyaranlara hücreleri sağlayabilen mikroakışkan cihazlar geliştirmek için büyük kullanım olacaktır. Örneğin, Li ve diğ. Tek oluşturma veya kimyasal geçişlerini ve EF'lerini 20 coexisting için PDMS tabanlı mikroakışkan cihaz bildirdi. Kao ve diğerleri. devEF 6 akciğer kanser hücrelerinin kemotaksisini modüle benzer bir mikroakışkan çip eloped. Ayrıca, verimlilik, Hou ve ark artırmak için. tasarlanmış ve 8 farklı kombine uyaranlara olmanın (2 EF güçlü x 4 kimyasal konsantrasyonları) 21 ile hücreleri sağlamak için bir PMMA esaslı çok kanallı-çift-elektrik alan çip fabrikasyon. ayrıca boyunca artırmak ve kayma gerilmesi uyaran eklemek için, biz tek veya eşlik eden kimyasal / elektrik / kayma gerilmesi uyaranlara altında hücresel yanıtları incelemek için iki PMMA esaslı mikroakışkan cihazlar geliştirdi.

Lo ve ark. 22,23 tarafından bildirilen bu cihazlar in vivo dolaşım sistemini taklit eden sürekli akışkan akan tabi beş bağımsız hücre kültürü kanalları içerir. birinci çip (kimyasal kayma gerilimi çip veya CSS çip) beş göre 0 konsantrasyonları, 1/8, 1/2, 7/8 ve 1, kültür bölgelerinde üretilen ve bir kesme stresi gradyanı edilir süredenBeş kültür alanlarının her birinin içine ced. ikinci çip elektrot tek bir seti ve 2 şırınga pompaları kullanılarak (kimyasal-elektrik alan çip ve CEF çip) olmak üzere beş EF güçlü, bu kültür alanları içinde beş farklı kimyasal konsantrasyonlar ilave olarak oluşturulur. Sayısal hesaplamalar ve simülasyonlar daha iyi bir tasarım uygulandı ve bu yongaları işletmek ve bu cihazların içinde kültüre akciğer kanseri hücreleri reaktif oksijen türlerinin üretimi ile ilgili yanıtları gözlemlemek için tek veya eşlik eden uyaranlara (ROS) tabidir, göç oranı, ve göç yönü. Bu çipler zaman tasarrufu hücreleri çeşitli mikro-çevresel uyaranlara nasıl tepki araştırmak için, yüksek verim ve güvenilir cihazlar olduğu gösterilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Chip Tasarım ve İmalat

  1. Beraberlik desenleri ticari yazılım 24 kullanılarak PMMA yüzeyleri ve çift taraflı bantlar üzerinde kesip çıkartılacak.
    1. Beş kültür alanlarında (Şekil 1A ve 1B) her ucunda değişen genişliğe sahip bir "Noel ağacı" desen çizmek, kimyasal konsantrasyonlar ve kayma gerilmeleri etkilerini incelemek için.
    2. Tuz köprüleri için iki tane daha akışkan kanalları (Şekil 2A ve 2B) ile "Noel ağacı" desen çizmek, kimyasal konsantrasyonlar ve elektrik alanların etkilerini araştırmak.
  2. Çizici PMMA levha veya CO 2 lazer Scriber içine ilgili dosyayı yükleyerek bir çift taraflı bant üzerinde bireysel bir desen.
    1. Lazer Scriber açın ve bilgisayara olan bağlantısını kontrol edin. desen açın ticari yazılımı kullanılarak kesilip edilecek.
    2. PMMA levha ya da bir çift taraflı bant o yerleştirinScriber aşamasında n üst. Kalibrasyon bar ve görünür He-Ne lazer kullanarak gerekirse CO 2 lazer odağı ayarlayın.
    3. PMMA levha veya banda ablasyon için Scriber içine desen yükleyin.
    4. , Desenli levha veya bant Pick up istenmeyen parçaları kaldırmak ve azot üfleme ile yüzeyi temizleyin.
      Not: PMMA tabakanın kalınlığı 1 mm, ve çift-taraflı bant olduğu 0.07 mm ya da 0.22 mm 'dir.

2. Chip Meclisi

  1. süper yapıştırıcı ile, üst vida konuları ve delikleri aynı hizaya getirerek çip en üst katmana (ortada vida dişleri uzunluk x genişlik x yükseklik = 10 mm x 10 mm x 5 mm) akrilik adaptörleri eklemek -En katmanı. Bu adaptörler giriş / çıkışları ve tuz köprüsü konnektörleri orta olarak hizmet vermektedir.
  2. Laminer akış kaput içinde mikroakışkan çip takılacak.
  3. Kimyasal kayma gerilmesi mikroakışkan çip (CSS chip) birleştirin.
    1. birttach tarif çift taraflı bant 2 adet kullanılarak tarif PMMA levhalar 3 yaprak. (Şekil 1A ve 1B).
    2. çip altına 0.07 mm kalınlığında çift taraflı bant bir parça daha ekleyin ve 10 cm çapında Petri kabı çipi takın.
    3. gece boyunca vakum odasında montaj çip koyun.
  4. Kimyasal-elektrik alan yonga (CEF chip) monte etmek için, kalınlığı bir çift taraflı bant PMMA levha takmak = 0.22 mm (Şekil 2A ve 2B).
    1. bant bu aynı parça kullanarak bir 10 cm çapında Petri kabı tarif PMMA levha ve çift taraflı bant takın.
  5. kaput içinde monte çip bırakın ve sterilizasyon için 30 dakika süreyle UV maruz kalmaktadır.
  6. plastik tüpler ve parmak sıkı fındık üzerinden iki 3 ml'lik şırınga girişleri bağlayın. Bir plastik tüp ve bir parmak sıkı somun vasıtasıyla atık tüpüne prizine takın.
    NOT: Otoklavkullanımdan önce, 15 dakika boyunca 121 ° C 'de, tüm borular ve fındık.
  7. Yavaş yavaş PBS ile Başbakan akışkan kanallarına şırınga pistonu bastırın. kabarcıklarını çıkarmak için ileri ve geri şırınga itin.
  8. % 5 CO2 altında 37 ° C'de gece boyunca bir inkübatör içinde cipsleri.
    Not: Bu iki adım çip içinde kalan kabarcıklar çip yıkayın ve kaldırmak amaçlanmaktadır.
  9. kuluçka çipi alır.
  10. CEF çip elektrik alanların oluşturulması için agar tuz köprüleri hazırlayın.
    1. Bir mikrodalga kullanılarak 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) tamponu içinde% 3 düşük erime noktası agaroz eritilir.
    2. çözüm aşamalı tuz köprüsü kanala agaroz enjekte edilir ve çözüm katılaşır önce elektrotlar eklemek.
    3. boru şeklindeki fındık içine gümüş / gümüş klorür elektrotlar yerleştirin.
  11. Dulbecco'nun Modifiye EagleR (enjektör pompaları şırınga bağlayın ve sürekli kültür ortamı akış17; 20 ul bir akış hızında, 10 dakika boyunca akışkan kanal içine ortamıdır, DMEM) / dakika PBS yerine.

3. Hücre Hazırlama ve Deneysel Kurulum

Not: Pre-sıcak 1X PBS, kullanmadan önce, bir 37 ° C su banyosu içinde kültür ortamı (DMEM artı FBS) ve tripsin.

  1. Plaka 2 x 10 5 hücre akciğer kanseri CL1-5 DMEM artı% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile birlikte 10 santimetrelik bir petri tabağına 25,26. % 90 birleştiği kadar 37 ° C 'de% 5 CO2 altında bir inkübatör içinde inkübe hücreleri.
  2. orta aspire ve önceden ısıtılmış 1x bir kez PBS ile yıkayın hücreleri. hücrelere% 0.05 tripsin tampon maddesi 2 ml ilave edilir ve hücreleri ayırmak için 37 ° C 'de 2 dakika ile 3 bekleyin.
  3. 15 ml'lik steril bir santrifüj tüpüne aktarılır ve hücreler tüp içine kültür ortamı 6 ilave edin. Yavaşça karıştırma tüp ters bir hemocytomete hücre sayısını saymak için hücre ihtiva eden bir ortamda 5 ul almakr.
  4. 300 x tüp santrifüj 5 dakika boyunca örn. Kültür ortamının 1 ml 10 6 hücre askıya alma ve 1 ml şırınga içinde, hücre içeren ortam yerleştirin.
  5. prizden mikroakışkan çip içine hücre içeren orta aşılamak ve çözüm beş kültür alanlarında aracılığıyla tüm dağıtır emin olun. 2 saat boyunca 37 ° C 'de% 5 CO2 altında bir inkübatör içinde çip inkübe edin.

4. Deneysel Kurulum

  1. kuluçka çip alın ve şeffaf indiyum kalay oksit (ITO) cam ısıtıcı üstüne yerleştirin.
    NOT: İTO cam termal coupler geribildirim yoluyla 37 ± 0.5 ° C sıcaklığı korumak için bir oransal-integral-türev (PID) denetleyiciye bağlı İTO ısıtıcı ve çip arasındaki sıkı kenetlenmiş.
  2. Hücre göçü veya sabit bir XY takibi için bir ters mikroskop motorlu bir XY üst yonga ısıtıcı montaj koyunROS üretiminin ölçülmesi için bir ters flüoresan mikroskop.
  3. (Kültür ortamı içinde çözülmüş) göreli konsantrasyonları 0 ve 1 arasında bir kimyasal çözeltilerin 5 ml ile iki şırınga dolgu farklı kimyasal konsantrasyonları oluşturabilir ve istenen akış hızlarında çip içine pompalamak için: CSS çipte, 0.3 ml 'lik bir akış hızında 1 saat / dk; İlk 20 dakika boyunca 20 ul / dk'lık bir akış oranında CEF çip ve bir 120 dakika (toplam süresi = 2 saat) 20 ul / saat akış hızında.
  4. CEF çipte, dijital tek lensli refleks yoluyla, kültür alanlarında 2 için her 15 dk içinde görüş belli bir alanda (FOVs) içinde (DSLR) fotoğraf makinesi, hücre göçü, mikroskobun XY fotoğraf çekmek tekrarlamak için programı izlemek için hr.
  5. ROS üretiminin ölçülmesi için, flüoresan bazlı göstergesi 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diasetat (2'-7'-DCFDA) kullanın.
    1. Moleküler biyoloji sınıf di 10 mM 2'-7'-DCFDA stok hazırlamametil sülfoksit (DMSO). Sadece serumu (DMEM 5 mcM) olmadan DMEM DCFDA seyreltin. Potansiyel deasetilaz arka plan sinyallerini artırmak ve hücrelerde sinyalleri azaltabilir.
    2. CSS çip veya CEF çip EF uyarıcının 2 saat sonra kesilme baskısı uyaran 1 saat sonra, 20 ul / dk'lık bir akış oranı için de çip halinde 2'-7'-DCFDA (DMEM 5 uM) pompa ilk 20 dakika ve 20 dakika boyunca 20 ul / saat arasında bir akış hızı. Yıkama için, 20 dakika boyunca 20 ul / saat akış hızı ile yonga içine DMEM pompa.
    3. floresan şiddetleri analiz etmek için, kültür alanlarında bazı FOVs arasında, bir şarj-kuplajlı aygıt (CCD) kamera ile Fotoğraflar al.

Kimyasal Konsantrasyonlarına, Kesme Zoru ve Elektrik Alanlar 5. Hesaplamalar

  1. CSS çip ve CEF çipi hem de, beş kültür alanlarında kimyasal konsantrasyonlarının hesaplamak. Örneğin, concentr ve H2O 2 enjekteations 0 ve iki giriş 200 uM, 0, 25, 100, 175 ve 200 uM oluşturulacak konsantrasyonları.
    NOT: Tüm sıvılar bölünmüş akışı o düzgün ve eşit çatal etrafında üstlenerek, beş kültür alanlarında göreli konsantrasyonları sırasıyla, 0, 1/8, 1/2, 7/8, ve 1 bulunmaktadır.
  2. CSS yongası kullanılarak kültür alanlarının her birinde kayma gerilmesi (τ) hesaplamak figure-protocol-1 Q, akışkan viskoziteli η debisi, 27, H kanalının yüksekliği, w kanalının genişliğidir.
    NOT: Her girişine (S = 0.12 ml / dakika, her bir kültür alanı) Q = 0.3 ml / dk ile η = 0.0008 Pa s kültür ortamı, h = 1 mm, ve W = 1 ~ 4 mm için, kayma gerilmesi 0,0192 Pa 0,0048 Pa (4 mm genişliğinde bölge) (1 mm genişliğinde bölge) arasında değiştiği hesaplanmıştır.
  3. İçindeCEF çip, σ kültür ortamı elektriksel iletkenlik, ben akışkan kanal boyunca akan elektrik akımı olan E = I / (σA eff) (Ohm yasası) kullanarak kültür alanlarının her birindeki EF gücünü hesaplamak ve A eff kanalın etkin bir kesit alanıdır.
    Not: kullanma σ = 1.38 Ω -1 m-1 kültür ortamı ve A eff = 0.22 ila 2 mm (genişlik = 1 mm ve yükseklik = 0.22 mm), EF gücü E (mV / aa) = I (olarak hesaplanır A) 3.3 × 10 6 ×.
    1. Şekil 2D'de gösterildiği gibi, dört (8 + 35 + 8) segmentler ile bir (5 + 35 + 5) kademeli bir beş C-kesitli devreler gibi eşdeğer devre tedavi.
      NOT: Kirchhoff gerilim kanunu ve Ohm yasasına göre bu paralel devre analiz ederek, beş kültür boyunca akan akımlardırBen 1 alttan üste I 5 üzerinden gibi, ben (bölge 1) civarında 0.49 olarak hesaplanır, 0.25 I (bölge 2), 0.13 I (bölge 3), 0.08 I (bölge 4), ve 0.05 I (bölge 5), sırası ile, l), toplam akım (DC olduğu. 0.157 mA, 254 EF, 130, 67, 41 ve 26 mV / mm, uygulanan DC beş kültür alanlarında oluşturulur.
      Not: mikroakışkan ağ basitleştirilmiş elektriksel analiz için tüm akışkan segmentleri uzunluklarına orantılı direnç direnç olarak kabul edilmektedir.

6. Veri Analizi

Not: Veri analizi ImageJ yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir.

  1. ROS üretimi analiz edin.
    1. ImageJ yazılımı çalıştırın. Bir floresan resim yüklemek için "Dosya" → Aç gidin analiz edilecek.
    2. im değiştirmek için "Resim" → "Tip" → "16-bit" gitgri ölçekli yaş.
    3. Bir hücreyi içine bir çokgen çizmek. Hücrenin ortalama floresan yoğunluğu ölçmek için → "Tedbir" "Analiz" gidin.
    4. Üç bağımsız deneyin en az 50 hücrelerinden yoğunluklarını toplamak ve ortalamanın standart hatası (SEM) ile, ortalama yoğunluğunu hesaplamak için 6.1.3 tekrarlayın.
    5. Her bir deney koşulu için 6.1.1-6.1.4 tekrarlayın.
  2. Hücre Göç analiz edin.
    1. ImageJ yazılımı çalıştırın. zaman = 0 alındığı bir resim yüklemek için "Dosya" → Aç gidin analiz edilecek.
    2. Bir hücreyi içine bir çokgen çizmek. (X 1, y 1) olarak hücrenin kütle merkezini ölçmek için → "Tedbir" "Analiz" gidin.
    3. 6.2.1- 6.2.2 = anda t almak başka bir görüntüden aynı hücrenin kütle merkezi (x 2, y 2) ölçmek için tekrarlayın.
    4. ve (mm / hr) göç oranını hesaplamakBu hücresi, figure-protocol-2 .
    5. Üç bağımsız deneyden en az 50 hücrelerinden göç oranlarını toplamak ve ortalama standart hata (SEM) ile ortalama göç oranını hesaplamak için 6.2.1-6.2.4 tekrarlayın.
    6. 6.2.2 ve 6.2.3 itibaren, kosinüs İçeride ISTV melerin RWMAIWi'nin olarak bu hücrenin göç Yönetme hesaplama veya figure-protocol-3 , Θ (pozitiften negatife) uygulamalı EF vektörü arasındaki açı ve hücrenin (Şekil 2G) son pozisyonuna baştan vektörü olduğu.
    7. Üç bağımsız deneyin en az 50 hücrelerinden geçiş Yönetme toplamak ve ortalamanın standart hatası (SEM) ile, ortalama geçiş Yönetme hesaplamak 6.2.6 tekrarlayın.
    8. SEM ile ortalama göç oranı ve her deneysel koşul için SEM ile ortalama göç Yönetme hesaplayın.
      NOT: Bir yönetme+1 Tüm hücreleri katoda doğru göç olduğunu gösterir ve bir -1 değeri tüm hücreleri anot doğru göç olduğunu gösterir. rasgele hareket eden hücreler, bir grup yönetme 0 civarındadır.
  3. Hücre Hizalama analiz edin.
    1. ImageJ yazılımı çalıştırın. Bir resim yüklemek için "Dosya" → "Aç" git analiz edilecek.
    2. bir elips olarak hücre tedavisinde ve bir hücrenin uzun ekseni belirtmek için bir çizgi çizin. Hat ve yatay EF yönü arasındaki β açıyı ölçmek için → "Tedbir" "Analiz" gidin.
    3. Üç bağımsız deneyden en az 50 hücrelerinden p toplamak için 6.3.2 tekrarlayın ve hesaplamak ortalama kosinüs β ortalama standart hata (SEM) ile.
    4. Her bir deney koşulu için 6.3.1-6.3.3 tekrarlayın.
      NOT: +1 p cos A tüm hücreleri uygulamalı EF paralel hizaya belirten ve 0 değeri tüm hücreleri perpendicularl hizaya olduğunu gösteriruygulamalı EF y.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kimyasal kayma gerilme (CSS) Çip

CSS çip, iki çift taraflı bantlar ile birlikte bağlı üç PMMA levhalar, kalınlık 1 mm, her biri, kalınlığı 0.07 mm (Şekil 1A ve 1B) her biri yapılır. "Noel ağacı" yapısı 0 beş nispi konsantrasyonları üretir 1/8, beş kültür alanlarında 1/2, 7/8, ve 1. hacim akış hızını, akışkan viskozitesi ve akışkan kanalın boyutu ile ilgili bir büyüklüğü ile, bir üçgen, bir kay...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PMMA esaslı cips daha karmaşık yumuşak litografi gerektiren PDMS tabanlı çipleri ile karşılaştırıldığında daha ucuz ve daha kolay yöntemlerdir lazer ablasyon ve yazma kullanılarak imal edilir. mikroakışkan çip tasarladıktan sonra, imalat ve montaj sadece 5 dakika içinde yapılabilir. dikkat deneyi gerçekleştirirken ödenmesi gerektiğini bazı kritik adımlar vardır. İlk "birleştirme" bir konudur. Adaptör çipin en üst tabakaya düzgün yapıştırılmış olmalıdır. Çok fazla uygulandığı takdirde tutkal akışkan kanallarına...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Tayvan Bilim ve Teknoloji Bakanlığı tarafından Sözleşme No. kapsamında mali olarak desteklenmiştir. MOST 104-2311-B-002-026 (K. Y. Lo), hayır. MOST 104-2112-M-030-002 (YS Sun) ve Ulusal Tayvan Üniversitesi Kariyer Geliştirme Projesi (103R7888) (KY Lo). Yazarlar ayrıca hücre kültürü odasının kullanımı için Ulusal Tayvan Üniversitesi Gelişmekte Olan Malzeme ve Gelişmiş Cihazlar Merkezi'ne teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)Gibco11965-092Hücre kültürü ortamı
TripsinGibco25300-054hücreyi çanaktan ayırın
Fetal sığır serumu (FBS)Gibco10082147Hücre kültürü ortamı
10 cm hücre kültürü Petri kabıNunc150350Hücre kültürü
Bright-Line  HematitometreSigmaZ359629Hücre Sayma Ekipmanı
PMMAÖzelleştirilmişÖzelleştirilmiş Mikroakışkançip
AdaptörüÖzelleştirilmişÖzelleştirilmiş Mikroakışkançip
0.07 / 0.22 mm çift taraflı bant 3M8018/9088Mikroakışkan çip
Düşük erime noktalı agarozSigmaA9414Tuz köprüsü
2 '-7'-diklorodihidrofloresan diasetatSigmaD6883Hücre içi ROS ölçümü
İndiyum kalay oksit (ITO) camMerck300739Isıtıcı
Oransal-integral-türev kontrolör ve nbsp;JETEC Elektronik A.Ş.TTM-J4-R-ABSıcaklık kontrolörü
Termal bağlayıcıTECPELTPK-02ASıcaklık kontrolörü
CO2 lazer çiziciLazer Araçları ve Teknik A.Ş.ILS2Mikroakışkan çip imalatı
Şırınga pompalarıNew EraNE-300Çipe ortam ve kimyasalların pompalanması
Güç kaynağıMajor Science MP-300VDoğru akım sağlama
Ters mikroskopOlympusCKX41Hücre göçünün izlenmesi
Ters floresan mikroskopNikonTS-100Hücre göçünü ve floresan sinyallerini izleme
DSLR fotoğraf makinesiCanon60DParlak alan görüntüleri kaydetme 
CCD kameraNikonDS-Qi1Floresan görüntülerin kaydedilmesi 
süper yapıştırıcı3M Scotch7004Adaptörlerin PMMA alt tabakalarına takılması
AutoCADAutodesk Inc.Mikroakışkan çiplerin tasarlanması
DMSOSigmaD8418DCFDA
ImageJÇözünmesi Ulusal SağlıkEnstitüleri Floresan yoğunluklarının ve hücre göçünün ölçülmesi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, (2008).
  2. Terry, S. C., Jerman, J. H., Angell, J. B. Gas-Chromatographic Air Analyzer Fabricated on a Silicon-Wafer. Ieee T Electron Dev. 26, 1880-1886 (1979).
  3. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
  4. Adler, J. Chemoreceptors in bacteria. Science. 166, 1588-1597 (1969).
  5. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
  6. Kao, Y. C., et al. Modulating chemotaxis of lung cancer cells by using electric fields in a microfluidic device. Biomicrofluidics. 8, 024107(2014).
  7. Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab Chip. 5, 611-618 (2005).
  8. Al-Majed, A. A., Neumann, C. M., Brushart, T. M., Gordon, T. Brief electrical stimulation promotes the speed and accuracy of motor axonal regeneration. J Neurosci. 20, 2602-2608 (2000).
  9. Nuccitelli, R. Endogenous electric fields in embryos during development, regeneration and wound healing. Radiat Prot Dosim. 106, 375-383 (2003).
  10. McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: Current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
  11. Tai, G., Reid, B., Cao, L., Zhao, M. Electrotaxis and wound healing: experimental methods to study electric fields as a directional signal for cell migration. Methods Mol Biol. 571, 77-97 (2009).
  12. Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
  13. Yan, X. L., et al. Lung Cancer A549 Cells Migrate Directionally in DC Electric Fields With Polarized and Activated EGFRs. Bioelectromagnetics. 30, 29-35 (2009).
  14. Li, J., et al. Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices. Lab Chip. 11, 1298-1304 (2011).
  15. Lin, F., et al. Lymphocyte electrotaxis in vitro and in vivo. J Immunol. 181, 2465-2471 (2008).
  16. Zhang, J., et al. Electrically Guiding Migration of Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2011).
  17. Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nat Protoc. 2, 1479-1489 (2007).
  18. Sun, Y. S., Peng, S. W., Cheng, J. Y. In vitro electrical-stimulated wound-healing chip for studying electric field-assisted wound-healing process. Biomicrofluidics. 6, 34117(2012).
  19. Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, (2012).
  20. Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
  21. Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, 052007(2014).
  22. Lo, K. Y., Wu, S. Y., Sun, Y. S. A microfluidic device for studying the production of reactive oxygen species and the migration in lung cancer cells under single or coexisting chemical/electrical stimulation. Microfluid Nanofluidics. 20, 15(2016).
  23. Lo, K. Y., Zhu, Y., Tsai, H. F., Sun, Y. S. Effects of shear stresses and antioxidant concentrations on the production of reactive oxygen species in lung cancer cells. Biomicrofluidics. 7, 64108(2013).
  24. Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensor Actuat B-Chem. 99, 186-196 (2004).
  25. Chen, J. J. W., et al. Global analysis of gene expression in invasion by a lung cancer model. Cancer Res. 61, 5223-5230 (2001).
  26. Shih, J. Y., et al. Collapsin response mediator protein-1 and the invasion and metastasis of cancer cells. J Natl Cancer I. 93, 1392-1400 (2001).
  27. Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal Chem. 76, 5257-5264 (2004).
  28. Fried, L. E., Arbiser, J. L. Honokiol, a Multifunctional Antiangiogenic and Antitumor Agent. Antioxid Redox Sign. 11, 1139-1148 (2009).
  29. Chisti, Y. Hydrodynamic damage to animal cells. Crit Rev Biotechnol. 21, 67-110 (2001).
  30. Davies, P. F., Remuzzi, A., Gordon, E. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Turbulent fluid shear stress induces vascular endothelial cell turnover in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 2114-2117 (1986).
  31. Zoro, B. J., Owen, S., Drake, R. A., Hoare, M. The impact of process stress on suspended anchorage-dependent mammalian cells as an indicator of likely challenges for regenerative medicines. Biotechnol Bioeng. 99, 468-474 (2008).
  32. Chin, L. K., et al. Production of reactive oxygen species in endothelial cells under different pulsatile shear stresses and glucose concentrations. Lab Chip. 11, 1856-1863 (2011).
  33. Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116(2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Microfluidic DevicesPMMA SubstratesLaser AblationChemical GradientsElectrical FieldsShear StressCellular ResponsesReactive Oxygen SpeciesCell MigrationExperimental Throughput

İlgili makaleler