Outer zar vezikülleri içinde Yönetmen Protein Paketleme Escherichia coli: Tasarım, Üretim ve Arıtma

Summary

Çeşitli uygulamalarda uygulama için gelişmiş enzim stabilitesi sağlayan enzim paketli dış zar veziküllerinin (OMV) üretimi, saflaştırılması ve kullanımı için bir protokol sunulmaktadır.

Abstract

dış membran veziküller (OMV) programlamak için sentetik biyoloji teknikleri uygulayarak giderek artan ilgi, geleneksel nanopartiküller sentezlemek için çok zor kanıtlamaktadır OMV'ye için bazı çok ilginç ve benzersiz uygulamalara yol açmaktadır. Bugüne kadar, bütün Gram negatif bakterilerin küçük moleküller, peptitler, proteinler ve genetik malzemesi içeren kargo çeşitli OMV Gösteren ambalaj üretmek için gösterilmiştir. onların çeşitli yük göre OMV hücre-hücre iletişim gen transferi ve bakteri OMV üretiminde hangi bağlı olarak hastalık oluşturma faktörlerinin teslimat kadar birçok biyolojik süreçlere de karışırlar. Sadece son zamanlarda bakteriyel OMV kontrol etmek ve OMV içine rekombinant proteinlerin doğrudan ambalaj tekniklerinin geliştirilmesi yoluyla geniş bir uygulama yelpazesinde kullanım için erişilebilir hale gelmiştir. overa geliştirilmiş Bu protokol, üretimi, saflaştırılması için bir yöntem, ve enzim paketlenmiş OMV kullanımını temin tarifrekombinant enzim, artan vezikülasyon ve gelişmiş enzim stabilitesi ll üretimi. Bu protokolün başarılı kullanımı aynı zamanda, bir rekombinant protein üretimi ve yeniden birleştirici protein ve bir dış membran ankraj protein arasında sentetik bağlantı oluşturma yoluyla OMV kapsüllenmesi için yönlendiren bir bakteri suşunun oluşturulmasıyla sonuçlanır. ilaç ilaç dağıtım, tıbbi teşhis ve çevresel iyileştirme: Bu protokol ayrıca gibi diğer benzersiz uygulamalar için kullanılmak üzere bu protokolü adapte göz önünde bulundurulması gereken bakteri kültürlerinin yanı sıra uygun işleme teknikleri ve şeyler OMV izole etmek için yöntemler göstermektedir.

Introduction

Enzim yüklü bakteriyel dış membran veziküllerinin (OMV) tasarımı, üretim ve saflaştırma için bir yöntem olup burada sunulmuştur. OMV, 30-200 nm ^1,2 büyüklükleri değişen proteoliposomes öncelikle tek katmanlı, küçük. Bugüne kadar incelenen tüm gram-negatif ve Gram-pozitif bakteriler, yüzey ^3,4 OMV veya hücre dışı vesiküller (EV), ya serbest göstermiştir. OMV üretildiği kesin mekanizma henüz tam olarak nedeni onları yanı sıra hizmet ettikleri farklı işlevleri salgılayan çeşitli bakteri nüfusa açıklanacaktır zorunda. OMV kompleksi arası iletimde, gen translokasyon çeşitli hizmet genetik malzemenin küçük moleküller, peptitler ve proteinler yükün geniş taşıma gösterilmiştir ve hastalık oluşturma ^5,6 çalışır.

OMV biogenez kesin mekanizmaları iyi karakterize ve bakteriyel türler arasında farklılık göstermedi değildir. thi rağmens aslında, ilgi bir protein ve bakteriyel dış zar için son derece fazla protein endojen ve daha sonra OMV ile sentetik bir bağ oluşturarak OMV bir rekombinant proteinin ambalaj etkinliğinin arttırılması için bir yöntem geliştirdik. Sentetik bağlantı ya da yapay olarak dahil afinitesi yokluğunda, rekombinant şekilde sentezlenmiş protein ile OMV arasında gözlenen paketleme verimliliği ⁷ çok düşüktür. Bu sonuç, iyi anlaşılmış değildir mekanizmalar yoluyla bakteriyel yüzeye ya da yönlendirilmiş paketleme ile OMV formasyonunun kesin bir anda rastgele olasılık kapsülleme yoluyla gerçekleşir OMV içindeki proteinler dahil edilmesi gibi beklenebilir. inci kıyasla yüksek verimde ambalaj bazı proteinleri ile bağlı protein yüksek bir başarı rastgele olasılık kapsülleme ama etkili paket dayanır periplazmik boşluk içinde ekspresyonu üzerinde, sadece yoluyla proteinlerin paketleme gözlenmiştir olduğutüm ^8-10'da paket yok. Ortak sentetik biyoloji tekniklerini kullanarak biz Escherichia coli (E.coli) aynı anda üretmek, paket ve kargo için bakteriler tarafından seçilir nasıl OMV oluşturulur ve nasıl ilgili güncel bilgi sınırlamaları ortadan OMV içine ilgi aktif bir enzim salgılaması için mühendis çalıştı ambalaj.

tercih edilen, sentetik bağlantı OMV içine yönsel ve paketlemeyi kolaylaştırmak için, bu başvurunun amaçları için, bir bölme proteini bioconjugation sistemi seçildi. Adından da anlaşılacağı gibi bölünmüş bir protein bioconjugation sistemi birbirleriyle etkileşim iki tamamlayıcı alt birim etki oluşur. Bu protokolün amacıyla seçilen bölünmüş protein domainleri Streptococcus pyogenes fibronektin bağlama proteini (FbaB) ¹¹ elde edilir SpyCatcher (SC) SpyTag (ST) etki gibi ifade edilir. Bu bölme, protein sisteminin bu w sıradışıTavuk, iki alt birimi yakınlık içinde isopeptide bağ spontan bir kovalent bağ oluşturma asit ve lizin amino asit kalıntıları, aspartik proksimal arasında oluşturur. Isopeptide bağı oluşumu şaperon protein, katalitik enzimlerin veya kofaktörlerin eklenmesini gerektirmez ve kolayca, oda sıcaklığında (RT) ve fizyolojik olarak ilgili ^{koşullar, 12,} geniş bir aralıkta meydana gelebilir.

Kavramının bir kanıtı olarak, Brevundimonas diminuta gelen phosphotriesterase (PTE) (EC 3.1.8.1) OMV ¹³ türetilmiş E. coli 'içine paketlenmiş seçildi. PTE binükleer Zn / Zn etkin bir yeri içerir ve Dialkilfosfatlar ve aril alkolleri ^14'e aryldialkylphosphates dönüştürme bir hidroliz reaksiyonu ile organofosfatlar ayrıştırma kabiliyeti yer alır. Organofosfatlar maruz kalma nöromüsküler kavşak makin de asetilkolinesteraz tarafından asetilkolin hidrolizini inhibe yoluyla uygun nörotransmitter fonksiyonu bozar¹⁵ derece tehlikeli g organofosfat türetilmiş bileşikler. Uzun süreli veya Organofosfatlar önemli maruziyet sık kontrol edilemeyen kasılmalar oluşur ve genellikle boğulma yoluyla ölüme neden olur. PTE paraokson doğru yüksek bir katalitik aktivite sergiler ise, çok güçlü bir insektisit, aynı zamanda diğer ilaç ve V / G tip kimyasal sinir ajanları ¹⁶ geniş bir hidrolize yeteneğine sahiptir. OMV ve paketlemeyi kolaylaştırmak için bir bakteriyel plazmid indüklenebilir bir promotör, bir periplazmik lokalizasyon sekansını ve SK gen dizisinin üst akışında bir kısa çoklu klonlama yerini içeren bir gen yapısı kodlayan tasarlanmıştır. OMV ambalaj periplazmik bölgeye PTE-SC füzyon proteinini hedefleyen genetik anahtarın oluşturulması için izin lideri ve SC sekansı arasındaki PTE geninin yerleştirilmesi. Burada tarif edilen çalışmalar PTE odaklanırken, enzim gen değiştirilebilir ve hali hazırda Fakültesi için diğer bir gen sekansı ile değiştirilebilirAlternatif bir enzim veya protein ilitate ambalaj.

Sentetik bağlantı ikinci bir parçası olarak bir çok dış zar proteini (OmpA) Abone terminali peptid dizisi sunmak tercih edilir. değişebilir bağlantı proteininin tercih protein, periplazmik boşluk içinde sunulur permisif alan adına sahip sitotoksisite neden olmadan bir füzyon yapısı tolere esastır iken rekombinant olduğunda, OMV mevcut olduğu bilinmektedir, ve toplam etmez üretilmiş. OmpA yüksek bakteriyel dış zar ve daha sonra OMV ^17'de ifade edildiği bilinen bir 37.2 kDa transmembran Porin proteinidir. Küçük moleküllerin taşınması karıştığı, bakteri membranı ¹⁸ arasında, boyutu 2 nm <. Ana OmpA iki yapısal benzersiz etki, bir transmembran p varil motif ve peptidoglikan ¹⁹ ile etkileşim için bilinen periplasmically çözünebilir bir C-terminal bölümüne sahiptir. Mutant OmpA-ST füzyon designe olarakBuradaki D ompA C-terminal kısmı silinmiştir ve ST periplasmically bakan N- ya da C-ucu ile kaynaştırılır. OMPA periplazmik bölümünü silme dış membran ve hiper-vezikülasyon ⁷ giden membran istikrarsızlaştırma sonuçlanan peptidoglikan arasındaki etkileşimlerin sayısını azaltır. Genomik OmpA Brüt membran destabilizasyonuna azaltmak için, rekombinant şekilde eksprese OmpA-ST yapısına ek olarak muhafaza edildi.

Protocol

Plazmidler hazırlanması 1.

1. Bir (çapa-ST olarak bu protokolde anılacaktır) çiftdikgen bağlantı etki kaynaşmış plazmid (örneğin, pET22) çapa protein içeren (OmpA), epitop etiketi (örneğin saflaştırma ve tanımlama için 6xHis, myc veya BAYRAK etiketleri gibi) hazırlayın periplazmik lokalizasyon etiketi, antibiyotik direnci ve seçilen bakteri suşunun ⁷ göre çoğaltma uygun kökeni.
   1. Üreticinin protokolü takip edilerek, bir ticari olarak temin edilebilir DNA izolasyon kiti kullanılarak bir gece boyunca kültürden plazmid DNA ekstrakte edin.
2. Bir plasmid (ör pACYC184) (enzim-SC olarak protokolde adlandırılır) (PTE) bağlantı proteininin tamamlayıcı bioorthogonal bağlantı alanına birleştirilen OMV içinde paketlenmiş enzim / protein ihtiva eden hazırlama, epitop etiketi bağlantı proteini plazmid farklıdır periplazmik lokalizasyon etiketi, antibiyotik direnci ve uygun origçoğaltma seçilen bakteri suşu ⁷ dayalı.
   1. Üreticinin protokolü ⁷ izlenerek ticari olarak temin edilebilir DNA izolasyon kiti kullanılarak bir gece boyunca kültürden plazmid DNA ekstrakte edin.

Bir OMV Ambalaj E.coli Kültür 2. Nesil

1. Plazmid izolasyonu
   1. Enzim-SC oluşturmak ve bağlantı ST üreticinin protokolü ^7'deki gibi ticari bir plazmid izolasyon kiti kullanılarak ayrı bakım hücre çizgilerinden oluşturur kodlayan plazmidler saflaştınlır. 260 nm ve 280 nm 'de absorbans ölçülerek DNA konsantrasyonu ve saflık belirler.
2. Ko-transformasyon
   1. Protein ifadesi kolaylaştırılmış ticari olarak temin edilebilen bir E. coli suşu seçin.
      Not: BL21 (DE3) hücreleri burada kullanılmıştır. T7 lizojenin prot için T7 destekleyici ve T7 RNA polimeraz dayanır çapa ST yapının ekspresyonu için gerekli olanein ifadesi. Diğer bakteri suşlarının kullanımı T7 lizojenin geninin varlığını ya pET22 ⁷ dışında bir plazmidin kullanılması istenmektedir.
   2. daha sonra seçilen hücreler için imalatçının protokolü izlenerek ısı şoku transformasyonu ya da elektroporasyon ya ile kompetan bakteriyel hücreler içine transforme eş molar konsantrasyonlara saflaştırılmış plazmid DNA ile seyreltilir.
   3. , Üzerine antibiyotik içeren iki ampisilin (pET22) ve kloramfenikol (pACYC184) ile agar plakaları Luria-Bertani (LB) Levha dönüştürülmüş hücreler her ikisi de 25 ug / ml nihai konsantrasyonlarda mevcut.
   4. Her iki plazmit ihtiva eden tek klonları izole etmek için gece boyunca 37 ° C 'de kültür tabağına yerleştirin.
      NOT: Antibiyotik seçimi hayatta koloniler gelecekteki tüm OMV hazırlıkları için kullanılacaktır. Antibiyotikler (ampisilin ve kloramfenikol) selektif basıncı korumak ve her iki plazmidlerin varlığını sağlamak için tüm sıvı kültürlere ilave edilecektir.

3. OMV Üretimi

1. koloni Genişleme
   1. 2.2.4 anlatılan seçme plakaları tek bir koloni ile yukarıda belirtilen konsantrasyonlarda antibiyotik içeren bir kültür ortamı (tipik olarak Terrific Broth (TB) ve LB) (aşama 2.2.3) 5 ml inoküle.
   2. şaşkın kültürü şişeler içine bir gecede starter kültür 100 kat seyreltme: 1 gerçekleştirin.
      NOT: 250-500 ml arasında medya hacmi kullanın.
   3. kültür yeterli havalandırma elde sağlamak için 250 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de kültür muhafaza edin.
2. Her plazma indüksiyonu
   1. Bakteri kültürü birincil büyüme balonun aşılamadan sonra, bir OD 0.6-0.8 arasında ₆₀₀ büyüme yaklaşık 3 saat büyümeye olanak sağlar.
   2. PTE-SC yüklü veziküllerin son verimini artırmak için, 15 dakika boyunca 7.000 xg'de tüm kültür santrifüj. önceden ısıtılmış taze kültür ortamı hücre pelletini.
      NOT: Bu optuğratarak aşama PTE-SC indüksiyonu öncesinde kültür ortamı içinde mevcut olan herhangi bir boş OMV giderilmesine yardımcı olur.
   3. 0.22 um filtre kullanılarak su ve steril filtre L-arabinoz% 20 stok solüsyonu olun. 2-4 hafta boyunca 4 ° C'de saklayın, L-arabinoz çözeltisi.
   4. PTE-SC üretiminin başlatılması için bir son% 0.2 konsantrasyonuna kültür şişesine, L-arabinoz solüsyonu ekleyin.
      NOT: Bu önceki mutant OmpA-ST indüksiyon yoluyla artan vezikülasyon teşvik PTE-SC ile periplazmik boşluk önceden yüklemek için yardımcı olur.
   5. 0.22 um filtre kullanılarak su ve steril filtre içinde 1 M izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) çözeltisi olun.
      Not: IPTG kez hemen kullanılmıştır hidrate olması gerekir. IPTG alikotları 3-6 ay donmuş olarak saklanabilir ve kullanımdan önce, hemen çözülmüş olabilir.
   6. OmpA-ST üretimini başlatmak için 0.5 mM nihai bir konsantrasyona kadar ilave 3 saat inkübasyon döneminden sonra IPTG ekleyin.
   7. cul izinçalkalayarak 37 ° C 'de ilave bir 8-14 saat boyunca büyümeye Ture.

4. OMV Arıtma

1. Bozulmamış Bakterilerin uzaklaştırılması
   1. sağlam bakteri pelet 4 ° C'de 7,000 x g'de 15 dakika süre ile bakteriyel kültür ortamı santrifüjleyin.
   2. Hücre pelet rahatsız değil Durusu ve dikkatli olmak hücre topağı sonrası santrifüj üst kapalı, medya kaydedin.
   3. bir ek santrifüj döngüsü tüm bozulmamış bakteri süzün ve medyayı kaydetmek için emin olmak kültür ortamından kaldırılır sağlamak için tekrarlayın 4.1.1 ve 4.1.2 adımları.
2. Protein Agregaların çıkarılması
   1. Bundan başka kalıntı bakteri ve kötü büyük hücre malzemenin çıkarılması için 0.45 um zar filtre kullanılarak bakteriyel kültür ortamı saflaştırılması.
      Not: (örneğin, selüloz asetat (CA) veya poliviniliden diflorür daha yüksek geri kazanımlar ve düşük protein adsorpsiyonu için biyolojik açıdan uyumlu bir membran malzemesi kullanmaPVDF). 100 ml ve 100 ml daha fazla vakum filtre hacimleri daha az şırınga filtresi birimleri.
      1. şırınga filtresi için steril 10-50 ml şırınganın içine kültür ortamı çizin. şırınga Luer sonuna kadar 0.45 mikron filtre takın. pistonu basınız ve akış yoluyla yeni bir kap içinde toplamak.
      2. Filtreyi vakum steril filtrasyon aparatına kültür ortamı aktarmak için. Pompayı vakum veya emme oluşturmak için aspiratör batmaya birimi takın. Yeni geminin filtrelenmiş orta aktarın.
3. Ultrasantrifügasyon üzerinden OMV İzolasyonu
   1. santrifüj karşıt tüpleri dengelemek için dikkatli olmak santrifüj tüplerine süzülmüş kültür ortamı ekleyin.
   2. alet ve tüpler her iki eşleştirme mukabil rotor kullanılarak bir ultrasantrifüjdeki 4 ° C sıcaklıkta 3 saat ~ 150.000 x g'de topak kullanılmaktadır.
   3. hemen tamamlama o da OMV pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak, OMV pelet OMV tükenmiş kültür ortamı DurusuOMV kurtarma azaltarak pelet yumuşatır medyada kalmasını OMV pelet izin olarak f santrifüj.
      NOT: Bu pelet hafif kahverengi bakteri kültürü başlangıç ​​miktarına bağlı olarak ya da gözü tarafından görülemeyen olabilir olacaktır. santrifüj tüpünün üst doğrudan medya aspire da OMV kaldırıldı fazla medya son OMV örnek olacak daha saf pelet akılda tutmak bir seçenektir.
   4. OMV parçacıklar tamamen medyadan tükenmiş olduğunu doğrulamak için, daha sonra dinamik ışık saçılımı (DLS) test için santrifüj süpernatant kaydedin.
   5. Ekle, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübasyona izin OMV topak, pH 8.0, steril filtre edildi fosfat tamponlu tuz (PBS), pH 7.4 ve 100 mM N-sikloheksil-2-aminoetansülfonik asit (CHES), tampon 0.5-1 mi. pelet kuru değil emin olun.
      NOT: Çözelti iyonik kuvvet, pH ve sıcaklığın aşırı düşük OMV çözünürlük neden olabilir ve Birikmesi arttırabilirNavigasyon.
   6. Dikkatle çözünür hale olmuştur tüm pelet sağlamak için hafifçe karıştırarak, santrifüj tüpüne saflaştırılmış OMV çözümünü pipetlemeyin.

5. OMV Karakterizasyonu

1. OMV boyut dağılımı ve parçacık konsantrasyonunu belirlemek için her enstrümanın özgü sağlanan üreticinin protokolleri takip piyasada mevcut DLS veya nanopartikül izleme yazılımı kullanın.
   NOT: Burada, OMV boyut dağılımı ve konsantrasyon NanoSight LM10 Nanopartikül İzleme ve NTA 2.3 Analiz yazılımı kullanılarak tespit edildi.
   1. yazılımını açın.
   2. mikroskop açın ve mikroskop ve nanoparçacık izleme ünitesi üzerindeki tüm yüzeyleri temizleyin.
   3. ~ Bir hava enjekte olmadan tüm görüntüleme penceresi kapak emin olarak 1 ml steril bir şırınga ile montaj Luer aracılığıyla parçacık izleme cihazının bakma penceresi ile doğrudan OMV numune 0.5 mi sisteme kabarcıklar ekleyin.
   4. Yeri to mikroskop sahnede birimi, izleme ve lazeri açın nanoparçacık.
   5. Yazılımda "yakalama" tıklayın.
   6. mikroskop odağı ayarlayın ve yazılım penceresindeki önizleme ekranı şimdiki parçacıkları görselleştirmek için sahne.
   7. parlak parçacıklar açıkça karanlık bir arka plan görsel kadar "Kamera Shutter" ve "Kamera Gain" ayarlayın.
   8. 60 sn yakalama süresini ayarlayın.
   9. "Kaydet" i tıklayın.
   10. , Giriş numune / cihaz sıcaklığı istendiğinde, örnek etiket ve bir kullanıcı belirlenen klasöre çalıştırmak her tamamlanmasından video verileri kaydetmek.
   11. (Algılama Eşiği, Blur, Min Parça Uzunluğu Min Beklenen Partikül Boyutu) oto modunu algılamak ve tıklayın tüm analiz parametrelerini tutmak "Süreç Sırası."
       NOT: Her bir parametre ince ayar analiz sonuçlarına bağımsız olarak ayarlanabilir nasıl kılavuzuna başvurun.
   12. Telaffuz parçacık boyutu dağılımı ve parçacık / myazılım tarafından tespit edildiği üzere l konsantrasyonu.
       Not: Tipik bir OMV hidrodinamik boyutu aralığı ~ 10 x 10 ⁸ bir parçacık / ml konsantrasyonu ile 30-200 nm arasındadır.
2. OMV Protein İçeriği belirlenmesi
   1. OMV saflık, enzim üretimi, ve SK-ST çapraz bağlama verimliliği ⁷ değerlendirmek için standart SDS-PAGE ve Batı benek protokolleri kullanarak.
      Not: çapraz bağlama verimliliği% 100 ⁷ olmayacaktır.

Enzim Ambalaj 6. Doğrulama

1. PTE Aktivite Deneyi
   1. ya da bir küvet içinde, 25 ° C'de, uygun bir tampon maddesi, örneğin 100 mM CHES tamponu (pH 8) 'de, tüm enzimatik testleri gerçekleştirmek veya 96/384 oyuklu bir plaka içerisinde multiplekslenmektedir.
   2. 1 5 ul ekleyin: Ches 90 ul ve saflaştırılmış OMV 5 ul CHES tamponunda paraoksonun 1000 seyreltme (~ 36 kat kültür ortamında bulunan OMV konsantrasyonuna göre konsantre).
      Dikkat: Paraokson bir toksik pestisit olduğunuve üretici ve kurumsal kurallarımıza göre ele alınması gerekir.
   3. 405 nm'de düzenli aralıklarla absorbans okumaları (~ 2 saat, toplam reaksiyon süresi boyunca her 20 sn) alın (ε = 18.1 mM ^{-1 cm-1)} ve 348 nm (isosbestic nokta s = 5.4 mM ^{-1 cm-1)} en kromojenik paraokson arıza ürün, p-nitrofenolu reaksiyon ilerlemesini izlemek.
      Not: pH değeri 8 den P-nitrofenolu baskın protonu giderilmiş formu 405 nm'de doğru izlenmesi için izin mevcuttur. Tüm diğer karmaşık ya da daha düşük pH değerli solüsyonlarda p-nitrofenolu birden formları, mevcut olacak şekilde 348 nm isosbestic noktasını kullanmak gerekmektedir.
   4. Her bir örnek, paket verimliliği, toplam PTE üretiminde PTE nispi miktarı karşılaştırma aşamasında 6.1.3 İlerleme eğrileri doğrusal kısmının eğimi belirleyerek başlangıç ​​reaksiyon hızları hesaplanır.
   5. Standart enzimatik gerçekleştirinTahlil protokolleri K _M, V _max belirlemek ve OMV k _kedi PTE kapsüllü.
      NOT: Lineweaver-Burk analizi bu kinetik parametrelerin belirlenmesi için kullanılabilir nerede y kesişim = 1 / V _maks ve eğim = K _M / V _max ^20.
2. Transmembran Yüzey / Ürün Difüzyon.
   1. hacimce Aşama 0-3 ile% CHES tamponu, Triton X-100'ün artan konsantrasyonları kullanılarak 6.1 de tarif edildiği gibi aynı kinetik deney analizi yapın.
      Not: çözündürülmüş OMV fonksiyonlarına Triton X-100 eklenmesi OMV içeriği, reaksiyon çözeltisine serbestçe erişilebilir olduğu için izin lipid çift bozabilir.
   2. Hesaplamak ve aktivitesi enzim göre enzim aktivitesinde çok az bir değişiklik (başlangıç ​​hızı) ile gösterilen alt-tabaka / ürün transmembran geçişini kontrol etmek için her bir Triton X-100 seviyesinde İlk hızlar, karşılaştırmaN Triton X-100 bulunmaması. enzim aktivitesinde bir artış, Triton X-100'ün varlığında görülürse alt-tabaka serbest OMV nüfuz etmez olasıdır.
   3. enzim aktivitesi doğrulamak için Triton X-100'ün varlığında deneyi serbest enzim aktivitesi (Bölüm 6.1'de yukarıda anlatıldığı gibi) yüzey aktif maddeler ile inhibe değildir.
      NOT: aktivitesi büyük ölçüde Triton X-100 gibi saponinler veya çeşitli polisorbat gibi alternatif katkı etkilenirse / ara yüzey aktif OMV membran rüptürü için daha uygun olabilir.

7. OMV Depolama

1. Dondurucu
   1. doğrudan sıvı azot içine saflaştırılmış OMV Yeri ~ 100 ul alikotları ek emin tam şişeleri batığın veya numune kendisi ile herhangi bir sıvı azot temas olmaması alikotları dondurma.
      NOT: Arıtılmış OMV tampon doğrudan donduruldu olabilir purificat sırasında OMV pelet çözülmesi için seçildi⁷ Gerekirse ek dondurarak saklama koruyucuları ile iyon süreci.
   2. -80 ° C'de ek dondurulmuş alikotları saklayın.
   3. RT emin örnekleri ısıtmak için değil varlık onları yerleştirerek adım 7.1.1 dondurulmuş alikotları çözülme.
   4. Bu şekilde depolama için tüm örnekler hazırlamak önce aşamasından önce başlangıç ​​hızları karşılaştırarak 6.1 ve enzim aktivitesi sonrası dondurularak çözülme önemli bir kayıp olmadığını doğrulamak için dondurulduktan sonra tarif edilen enzim tahlili gerçekleştirmek.
      Not: enzim aktivitesinde bir azalma dondurma nedeniyle gözlenmesi halinde saklayın 4 ° C'de OMV arıtıldı.
2. liyofilizasyon
   1. Piyasada mevcut liyofilizasyon donanımları ²¹ kullanılarak anında dondurulmuş saflaştırılmış OMV alikotları liyofilize.
   2. Mağaza hafta veya aylarca, -80 ° C'de, oda sıcaklığında alikotları liyofilize edildi.
   3. Liyofılizasyon öncesinde şekilde liyofilize OMV saf suyun aynı hacimde ekleyin ve t rehidrate, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletilmiştirO örnek. Gerekli emin olunca girdap ya da OMV ses dalgalarına maruz değil hafifçe karıştırın.
   4. önce seyreltme / çözündürme gerekli olmadığı yerlerde işaret-bakım uygulamaları için doğrudan liyofilize OMV tozu ekleyin.

Results

Bu protokol ayrıntılı OMV ambalaj stratejisi için gerekli olduğu gibi, iki yeniden birleştirici proteinin aynı anda sentezlenmesi, farklı yollar bir numara ile gerçekleştirilebilir. Burada, bir iki vektör sistemi çoğaltma ve ayrı olarak uyarılabilir gen kasetlerinin uyumlu kökeni ile kullanılmıştır. PTE-SC sentezlenmesi için bir arabinoz, indüklenebilir gen kaseti ve bir enzim geninin klonlanmasını kolaylaştırmak için benzersiz sınırlama sitelerinin bir dizi ardından periplazmik lokaliza...

Discussion

Temsilcisi göstermek için bu protokol işlevleri, ilgili bir enzim üretimi ve E. coli OMV içine paketlenmiş olan bir paketleme tekniği yöneliktir. birçok karmaşık tekniklerle de protokol aşağıda ayrıntılı olarak bazıları, farklı özel uygulamalarda, kullanım için uyum için değiştirilebilir olan birden çok alan vardır. OMV paketleme ve enzim kapsülleme mekanizması özel ihtiyaçlarına göre adapte edilebilir olsa da başarısı için kritik olan bu protokol kapsamında birkaç adım vardır. sağlam bir bakteri ve hücresel en...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
IPTG	Herhangi Bir Daima		taze veya alikot hazırlayın ve dondurun.
L-arabinoz	Herhangi biri		önceden hazırlanabilir ve 4 ° C'de saklanabilir.
Ampisilin:	Herhangi Bir		Ekleme, ortam otoklavlanmaktan yeterince soğuduktan sonra kullanımdan hemen sonra.
Kloramfenikol	Herhangi bir		Ekleme, ortam otoklavlanmaktan yeterince soğuduktan sonra kullanımdan hemen önce.
TB/LB Kültür Ortamı	Diğer herhangi bir		büyüme ortamı muhtemelen benzer şekilde çalışacaktır.
Triton X-100	herhangi biri		.
Şaşkın kültür şişeleri	Herhangi Bir		Bölmeler daha yüksek havalandırma seviyelerini teşvik eder.
CHES	Fisher Bioreagents	BP318-100	Paraokson bozunması için kullanılan optimal tampon (pH > 8).
Paraoxon	Chem Service	N-12816	Dikkatli kullanılması ve uygun şekilde atılması gereken çok toksik bir maddedir.
Şırınga Filtresi 0.45 ve mikro; m	Thermo Scientific	60183-221 (30 mm)	Filtre çapı numunenin hacmine bağlı olacaktır. Düşük protein bağlayıcı membran kritiktir.
Çalkalayıcı inkübatör	New Brunswick	Excella E24	Tekrarlanabilir bakteri üremesi için hassas sıcaklık ve karıştırma şarttır.
Sorvall Kültür Santrifüjü	Thermo Scientific	RC 5B PLUS	7.000 x g kapasiteli büyük hacimli (500 ml) kültür santrifüjü.
Sorvall Ultrasantrifüj	Thermo Scientific	WX Ultra 90	Merkezkaç kuvveti ve ge yeteneğine sahip; 150.000 x g.
Ultrasantrifüj Rotor	Thermo Scientific	AH-629	Uygun rotor ve tüplerin kullanıldığından ve her şeyin uygun şekilde dengelendiğinden emin olun.
Ultra Şeffaf Ultrasantrifüj Tüpleri (25 x 89 mm)	Beckman Coulter	344058	Kullanmadan önce herhangi bir stres kırığı olmadığından ve tüplerin önceden dengelendiğinden emin olun.
Spektrofotometre	Tecan	Infinite M1000	Enzim kinetik deneyleri için gereklidir.
DLS/parçacık izleme	NanoSight	LM10	OMV boyut dağılımı ve konsantrasyon tayini için gereklidir.
BL21 (DE3)	NEB		Uygun bakteri ekspresyon suşu.
pET22	EMD Millipore	69744-3	Bunların yerine başka plazmitler de kullanılabilir.
pACYC184	NEB		Bunların yerine başka plazmitler de kullanılabilir.
Jel Ekstraksiyon Kiti	Qiagen	28704	Örnek kit.