Yöntem makalesi

Küçük RNA miktarının belirlenmesi Sigara kodlama için yüksek yoğunluklu lipoproteinler izolasyonu

DOI:

10.3791/54488

⸱

28 Kasım 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Center for Quantitative Sciences, Vanderbilt University School of Medicine, 3Department of Cancer Biology, Vanderbilt University School of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, yüksek yoğunluklu lipoprotein küçük RNA'ların izolasyonunu ve miktar tayinini açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

küçük kodlayıcı olmayan RNA'lar çeşitliliği (Srna) hızla genişlemektedir ve gen regülasyonu dahil olmak üzere biyolojik süreçlerde, rolleri, ortaya çıkmaktadır. İlginç olan, sRNAs ayrıca hücrelerin dışında bulunan ve sabit bir şekilde tüm biyolojik sıvılar içinde mevcut bulunmaktadır. Bu nedenle, hücre dışı sRNAs hastalığı biyomarkerler yeni bir sınıfını temsil eder ve büyük olasılıkla hücre sinyal iletimi ve hücreler arası iletişim ağları dahil olmaktadır. biyolojik olarak potansiyellerini değerlendirmek için, sRNAs plazma, idrar ve diğer sıvıları belirlenebilir. Bununla birlikte, tam endokrin sinyaller olarak hücre dışı sRNAs etkisini anlamak için, taşıyıcıları taşınması ve hücre ve dokular dışı Srna havuzları katkıda biyolojik sıvılarda (örneğin, plazma), onları korumak ve hücreler ve yetenekli dokular olduğunu belirlemek önemlidir kabul ediyor ve hücre dışı Srna kullanan. Bu hedeflere ulaşmak için, hücre-dışı taşıyıcıların yüksek derecede saf popülasyonlarının izole edilmesi için önemlidirSrna profil ve ölçümü için. Daha önce lipoproteinler, özellikle yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL), hücre ve HDL-miRNA'ların arasında işlevsel microRNA (MiRNA) önemli ölçüde hastalık değişmiş taşıma olduğunu göstermiştir. Burada, detay yoğunluk-gradyan Ultrasantrifügasyon (DGUC) ve hızlı protein-sıvı kromatografisi (FPLC) ile tandem HDL izolasyonunu kullanan yeni bir protokol yüksek ikisini de kullanarak, aşağı profilleme ve miRNA'ların dahil olmak üzere tüm sRNAs, ölçümü için son derece saf HDL elde etmek için -throughput sekanslama ve gerçek zamanlı PCR yaklaşımlar. Bu protokol HDL üzerinde sRNAs araştırılması için değerli bir kaynak olacaktır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekstrasellüler kodlamayan küçük RNA'lar (sRNAs) hastalığı biyomarkerlerin ve potansiyel terapötik hedeflerin yeni bir sınıfını temsil ve muhtemel hücre-hücre iletişimi 1 kolaylaştırır. Srna en çok çalışılan tip uzunluğu yaklaşık 22 NTS ve daha uzun habercisi formları ve primer transkript 2 işlenir mikroRNAlar (miRNA) 'dir. miRNA'lar transkripsiyonel-sonrası protein çevirisinin ve mRNA degradasyon 2 indüksiyonu bastırılması vasıtasıyla gen ekspresyonunu düzenlemek için gösterilmiştir. Bununla birlikte, miRNA'ların sRNAs birçok türleri sadece biri; sRNAs üst tRNA'ların (tRNA türetilmiş sRNAs TDR), küçük nükleer RNA (Srna türetilmiş sRNAs, sndRNA), küçük çekirdekçik RNA'lar (snoRNA türetilmiş sRNAs, snRNA), ribozomal RNA klivaj edilebilir (sRNAs RDR rRNA türetilmiş ) Y RNA'lar (yDR) ve diğer çeşitli RNA'lar 1. Bu yeni sRNAs birkaç örnek miRNA'ların benzer işlev bildirilmiştir; Ancak, biyolojik fugen düzenlemesi roller 3-6 olasılığı olmasına rağmen, bu sRNAs birçok nctions tespit edilmesi gerekmektedir. İlginç olan, miRNA'ların ve diğer sRNAs tükürük, plazma, idrar, safra içeren hücre dışı akışkanlar içinde stabil bir şekilde yer almaktadır. Ekstrasellüler sRNAs olasılıkla ekstrasellüler veziküllerin (EV), lipoproteinler ve / veya hücre dışı Ribonükleoprotein kompleksleri ile dernek aracılığıyla RNases korunur.

Daha önce, bu lipoproteinlerin, yani, yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL) plazma 7 taşıma miRNA'lar bildirilmiştir. Bu çalışmada, HDL ardışık yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjleme yöntemi (DGUC), hızlı protein sıvı kromatografi (boyut dışlama kromatografisi, jel filtrasyon, FPLC) ve afinite kromatografisi (anti-apolipoprotein Al (apoA-l) imüno kullanılarak izole edildi ) 7. Gerçek zamanlı PCR bazlı, düşük yoğunluklu diziler ve bireysel MiRNA analizlerine kullanarak MiRNA düzeylerde HDL üzerindeki sayısal iyileşmesi izole edildisenin ve hiperkolesterolemik konular 7. Bu yaklaşımı kullanarak, biz miRNA'lar profil ve oldukça saf HDL hazırlıkları belirli miRNA'lar ölçmek için başardık. 2011 yılından bu yana afinite kromatografisi HDL saflığı artırır, ancak antikor doygunluk büyük ölçüde verim sınırlar ve maliyet açısından çok pahalı olabilir belirledik. Şu anda, bizim protokol aynı zamanda aşağı akım RNA izolasyonu ve Srna ölçümü için yüksek kaliteli, HDL örnekleri üreten FPLC, ardından DGUC bir iki adımlı sıralı tandem yöntemi önerir. Nedeniyle yüksek verimli örneğin sRNAs (sRNAseq), miRNA'lar sıralanması, ve diğer non-miRNA Srna sınıfların artan farkındalık son gelişmeler için, sRNAseq cari state-of-the-art miRNA ve Srna profilleme. Bu nedenle, bizim protokol miktarının miRNA'lar ve sRNAseq kullanarak HDL örneklerinde diğer sRNAs önerir. Bununla birlikte, HDL izole edilmiş toplam RNA da tek tek miRNA'lar ve sRNAs ölçmek veya gerçek zamanlı PCR kullanılarak sRNAseq Sonuçları doğrulamak için kullanılabiliryaklaşırsa. Burada toplama, arıtma, ölçümü, veri analizi ve oldukça saf HDL-sRNAs doğrulanması için detaylı bir protokol açıklar.

Bu yazıda genel amacı, insan plazmasından izole son derece saf HDL Srna ölçümü fizibilite ve süreci göstermektir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. HDL saflaştırma (~ 5.5 gün)

  1. Yoğunluk-Gradient Ultrasantrifügasyon (DGUC, ~ 5 gün)
    1. Taze toplardamar kanından izole plazma 9 ml 100x, anti-oksidanlar, 90 uL ekleyin.
    2. Aşama 1.1.1 (0,0278 g / ml KBr plazma) plazma 9 mL 0.251 gr KBr eklenerek 1.025 g / mL, 1.006 g / ml arasında KBr plazma yoğunluğunu ayarlar. tüm tuz, oda sıcaklığında çözülür ve tüpler ultrasantrifüjdeki ve tüm kabarcıklar üste çıkar sağlamak transfer edilene kadar plazma sallayın.
    3. Bend ucundan 90 ° 1 cm 18 G iğne ucu, konik tarafı yukarı bakacak. Bir şırınga ve 18-gauge iğne kullanılarak, dikkatli bir plazma (Tablo 1) üzerinde bindirme çözüm # 1 3 mL yerleştirin.
      NOT: bükük iğne tüm VLDL / IDL, LDL sağlar ve HDL kalıbı ile karışmadan kaldırılır.
    4. tüp ve dikkatli bir şekild üstüne menisküs 3 mm boşluk - 2 bırakarak üstünde kabarcıklar çoğunluğu, kaldırLly SW-40Ti kova tüpleri yerleştirin.
    5. dengesine (kapakları) her kova tartılır ve tam tersi kova (kova + kapak) ile denge: # 5 ve # 3 # 6 # 4, # 2 # 1.
      NOT: Bu kovalar dengeli ve her zaman uyumlu olması gerekir.
    6. (Malzeme Listesi) ultrasantrifüjdeki rotor yerleştirin. bir # 4, ara fren 4 ° C'de 24 saat boyunca 274.400 x g'de santrifüjleyin.
    7. Dikkatle kovalar rotor kova ve tüpler kaldırın.
    8. Dikkatli bir şırınga ve bükülmüş iğne kullanarak bindirmenin üst tabakadan 2 mL çıkarın. Bu 4 ° C'de saklanabilir VLDL / IDL kısmını oluşturmaktadır ° C veya -80 ° C.
    9. VLDL / IDL fraksiyonu çıkardıktan sonra, numune (plazma) kalan 7 mL toplamak ve bir 15 ml konik tüp içine yerleştirin. Bindirme çözüm # 2 (Tablo 1) ile 9 mL numune hacmi getirin.
    10. 1.080 g 1.025 g / ml örnek yoğunluğunu ayarlayın / KBr ile ml kullanarak9 ml numune ya da 0,0828 g yaklaşık 0.746 gr KBr / numunenin ml KBr. Tüm KBr (yaklaşık 20 dakika) içinde çözülür ve sağlanması kabarcıklar üstüne yükselir ise tüp ultrasantrifüjdeki aktarmak kadar yavaşça örnek sallayın.
    11. Şırınga ve iğne ile, dikkatli bir şekilde örnek (Tablo 1) bindirme çözeltisi 3. 3 mL yerleştirin. tüpün üstüne menisküs 3 mm boşluk - 2 bırakın.
    12. tüpün üst kısmında kalan kabarcıkların çoğunluğu kaldırmak ve dikkatle SW-40Ti kova dolu ultrasantrifüjdeki tüpleri yerleştirin.
    13. dengesine (kapakları) her kova tartılır ve tam 1.1.5 gibi, karşıt kova + kapaklı denge.
    14. ultrasantrifüjdeki Rotoru yerleştirin (Malzeme listesi bakınız). bir # 4, ara fren 4 ° C'de 24 saat boyunca 274.400 x g'de santrifüjleyin.
    15. Dikkatle kovalar rotor kova ve tüpler kaldırın.
    16. Dikkatle bir şırınga kullanarak bindirmenin üst tabakadan 2 mL çıkarın ve olmaknt iğne. Bu 4 ° C'de saklanabilir LDL fraksiyonu olacaktır ° C veya -80 ° C.
    17. LDL fraksiyonu çıkardıktan sonra, numune (plazma) kalan yaklaşık 7 ml toplamak ve yeni bir 15 ml konik tüp içine yerleştirin. 1.080 g / ml solüsyon # 4 (Tablo 1) 9 mL kadar örneği (plazma) hacminin getirin.
    18. 1.30 g 1,080 g / ml örnek yoğunluğunu ayarlayın / KBr örneğin her mL için KBr 9 mL örnek (plazma) içinde 3.33 g KBr kullanarak ya da 0.37 g ml. Kaya veya hafifçe tüm KBr (tuz) eriyene kadar numuneyi ajitasyon ve tüp ultrasantrifüjdeki aktarın.
    19. Şırınga ve iğne ile, dikkatli bir şekilde örnek (Tablo 1) bindirme çözeltisi 5. 3 mL yerleştirin.
    20. tüpün üstüne menisküs 2- 3 mm boşluk bırakarak, tüpün üstünde kalan kabarcıkların çoğunluğu kaldırmak ve dikkatle SW-40Ti kova dolu ultrasantrifüjdeki tüpleri yerleştirin.
    21. (Her kova tartılırdenge üzerine kapaklar), ve tam ile 1.1.5 gibi karşıt kova + kapaklı denge.
    22. ultrasantrifüjdeki Rotoru yerleştirin (Malzeme listesi bakınız). Bir 4. fren 4 ° C 'de 48 saat boyunca 274.400 x g'de santrifüjleyin.
    23. Dikkatle kovalar rotor kova ve tüpler kaldırın.
    24. Dikkatli bir şırınga ve bükülmüş iğne kullanılarak bindirme üst tabakasının yaklaşık 2 mL çıkarın. Bu, 4 ° C ya da -80 ° C'de muhafaza edilebilir HDL fraksiyonu vardır.
      NOT: DGUC HDL ardından yüksek tuz çözüm kaldırmak için diyalize edilebilir.
    25. kapalı bir diyaliz kovanı (10.000 mw cut-off) toplanan HDL fraksiyonu koyun ve 1 L 1x PBS gecede dialyze, diyaliz. Değişim diyaliz tamponu (1x PBS) 24 saat boyunca 3 kez. Manyetik bir karıştırma-bar ile PBS nazik pertürbasyon diyaliz artıracaktır.
    26. Bir BCA yöntemi 8 kullanarak DGUC-HDL protein konsantrasyonu belirleyin.
  2. Hızlı protein sıvı chromatography (FPLC) ya da boyut-dışlama kromatografisi (~ 6 saat)
    1. 0.22 mikron mikro santrifüj filtre ile 500 mcL DGUC-HDL (toplam protein) 1.2 mg Filtre enjeksiyondan hemen önce, (Malzeme listesi bakınız).
      Not: 0.22 um'lik bir filtreden önce 0.45 um mikro santrifüj filtre ile DGUC HDL numunenin ilave filtreleme Bazı örnekler için gerekli olabilir.
    2. , Süzülmüş DGUC-HDL örnek toplamak FPLC (dolgu) enjeksiyon şırınga yükleyin ve şırınga hiçbir kabarcıklar FPLC içine enjekte önce olmamasına dikkat edin.
    3. 2.6 MPa bir basınç sınırı 0.3 mL / dak FPLC akış hızını ayarlayın. enjeksiyon örnek önce tampon 0.2 kolon hacmi (yaklaşık 15 mL) ile sütun dengelenmesi. FPLC (enjeksiyon döngü mü?) Aracı haline tampon 3 mL numune enjekte edilir ve çalışma başlatmak. 72 fraksiyonların toplam 1.5 ml'lik kesirleri toplayın.

2. Yüksek verim Küçük RNAArdışık (sRNAseq, ~ 9 gün)

  1. RNA İzolasyon (~ 1 gün)
    1. üreticinin talimatlarına uygun olarak kolorimetrik bir kit kullanılarak total kolesterol seviyelerinin belirlenmesiyle DGUC HDL tekabül FPLC fraksiyonlar tanımlar. DGUC-HDL içeren 7 FPLC kesirler - Bu FPLC set-up kullanarak, 6 bulmak için bekliyoruz.
    2. DGUC HDL FPLC fraksiyonlardan tüm hacmi (yaklaşık 8 -1 0 ml Havuz 1.45 mL fraksiyonunun hacim) toplayın ve kullanılarak konsantre 10 kDa mw kesim santrifüj filtre üniteleri, 1 saat boyunca 4000 x g'de, 4 ° C'de veya HDL konsantre kadar yaklaşık 100 ml.
    3. HDL konsantre toplayın ve BCA yöntemi 8 kullanarak HDL total protein konsantrasyonu ölçmek.
    4. kümesindeki her örnekten aliquoted edilebilir en fazla 1 mg HDL toplam proteinin en yüksek konsantrasyon, belirleyin. Örneğin, her bir örnek için, HDL toplam proteinin aynı miktarda RNA izole eder.
    5. kullanarak RNA izolasyonu gerçekleştirmekdeğiştirilmiş bir protokol (Malzeme listesi bakınız).
      1. 1 dakika boyunca fenol parçalama reaktifi (Malzeme listesi bakınız) örnek ve vorteks 10x hacim ekleyin.
      2. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
      3. kloroform (adım 2.1.5.1 kullanılan fenol liziz reaktifi hacminin% 20) ilave edilir ve 15 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır.
      4. 3 dakika - 2, oda sıcaklığında inkübe edilir.
      5. soğutulmuş bir santrifüj içinde 4 ° C'de 12,000 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj.
      6. interfaz kaçınarak yeni bir tüpe, üst sulu faz transfer.
      7. 1 dakika için sulu faz ve vorteks% 100 etanol 1.5x hacim.
      8. en az 1 saat ya da gece boyunca -80 ° C'de saklayın örnekleri.
      9. sağlanan küçük sütunlar kullanılarak RNA izolasyon protokolü ile devam edin.
      10. 30 mL RNaz içermeyen H2O ile elüte İlk 2 dakika süreyle düşük hızda (2000 xg) frit, spin doğrudan 15 uL H 2 O ekleyin veDaha sonra 1 dakika boyunca yüksek hızda (max) dönerler. H 2 O ek 15 ul ile bu adımı tekrarlayın
    6. Hemen -80 ° C'de Srna kütüphane nesil ya da mağazaya geçin.
  2. Kütüphane Oluşturma (~ 6 saat)
    1. Aşağıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi PCR amplifikasyonu için bir değişiklik ile, üretici talimatlarına uygun olarak, Srna Kütüphane oluşturma kiti protokolü kullanılarak Srna cDNA kütüphaneleri hazırlayın.
      1. 0.5 mL DNaz / RNaz ücretsiz H 2 O içeren buz üzerinde PCR MasterMix hazırlayın, 15 uL PCR Mix (PML) ve 1 uL RNA PCR Primer (RP1) numune başına (hata pipetle için ek bir% 10 dahil).
      2. PCR 16.5 uL her (cDNA) örnek karıştırın ekleyin.
      3. çoğullama için her bir örnek için bir dizin / barkod numarası atamak ve örnek (ilgili numaraya) 1 uL PCR Primer Endeksi ekleyin.
      4. mikrofuge'de kullanarak hızlı bir spin gerçekleştirin.
        NOT: Toplam hacim gerekirŞimdi örnek başına 30 uL olacak.
      5. Tablo 2 ve 3'te açıklandığı gibi PCR amplifikasyonu için döngü şartları yerine.
  3. Boyut Srna Kütüphane Adaptörü çıkarmak için seçin: Adaptörler (~ 1.5 saat)
    1. Hedef: aşağıdaki boyut parametreleri ile üreticinin talimatlarına göre otomatik DNA boyutu seçici kullanarak kütüphane boyut seçimi gerçekleştirmek 156 bp Başlangıç: 135 bp, End: 177 bp, Menzil Flag: Geniş.
  4. DNA Clean Up (~ 0.5 saat)
    1. temizlemek boyut seçimine, üreticinin talimatlarına uygun olarak Srna cDNA.
    2. Temiz Zehir ve 2 x 7 uL DNaz / RNaz ücretsiz H2O ile Srna cDNA konsantre
  5. Ölçmek ve değerlendirmek Srna cDNA Library Verim ve Kalite (~ 1 saat)
    1. İmalat başına (Malzeme Listesi) bir Bioanalyzer üzerinde yüksek hassasiyetli DNA çip kullanan Srna cDNA kütüphanesi kalitesini ve boyutunu değerlendirmekÜrer talimatları.
    2. üreticinin talimatlarına göre, yüksek hassasiyetli DNA tahlili (Malzeme Listesi) kullanarak bireysel Srna cDNA kütüphanesi konsantrasyonlarını ölçmek.
      NOT: Bu akış hücresi mümkünse aynı kulvarda çalıştırılacak farklı endeksleri tüm örnekleri olması tavsiye edilir. Birden fazla şeritli gerekli ise, uygun bir durumda, kontrol numuneleri karıştırın.
  6. Yüksek verimli Srna Dizi (~ 7 gün)
    1. Havuz bireysel denk molar konsantrasyonlarda dayalı Srna kütüphaneleri endeksli.
    2. 2.5.2 - Ekran Bioanalyzer yüksek hassasiyetli DNA çip kullanan ve 2.5.1 gibi kütüphane DNA konsantrasyonunu belirlemek kalite Srna kütüphaneleri toplanmış.
    3. üreticinin talimatlarına (Malzeme listesi) göre dizi kütüphanesi qPCR Niceleme Kiti kullanılarak uygun sıralama derinliğini sağlamak için bağdaştırıcı içeriği kantitatif PCR (qPCR) uygulayın.
    4. Tek bir okuma kullanarak sıralamayı gerçekleştirmek, 50 b25 M üreticinin talimatlarına göre, / örnek okur - p protokolü yaklaşık 20 derinliğe ulaşmak için.

3. Veri Analizi (~ 1 gün)

  1. çoklaması örneklerin önişlem ham fastq dosyaları (Malzeme listesi) kullanım kılavuzu talimatlarına göre, bcl2fastq2 kullanın.
  2. Adaptörleri 9 Döşeme ve kaldırmak için Cutadapt kullanın
  3. Kullanım kılavuzu talimatlarına (Malzeme Listesi) uyarınca, NGSPERL çerçevesinde removeSequenceInFastq işlevini kullanarak ve adaptör carry-over (CTACAGTCCGACGATC): stop çözüm dizisi de dahil olmak üzere Srna kütüphaneler, mevcut kirlilik dizileri (CCACGTTCCCGTGG STP) sökün.
  4. Kullanım kılavuzu talimatlarına (Malzeme Listesi) uyarınca, FastQC Sayısal Bilimler Merkezi (CQS) araçlarını kullanarak kalite kontrol ölçümleri gerçekleştirin.
  5. "Özdeş" olmayan gereksiz liste oluşturmak (çökme redunda okurnt okur) ve kayıt kopya sayıları kullanım kılavuzunun talimatları Malzeme (Liste) uyarınca, CQSTools kullanarak.
  6. Kullanım kılavuzu talimatlarına (Malzeme Listesi) uyarınca, (-a -m 100 --best --strata -v 1 seçenekleri) hizalayın Bowtie1.1.2 1 uyumsuzluğu izin kullanarak insan genomuna okur.
  7. hizalama, sayma okuma gerçekleştirmek ve kullanım kılavuzu talimatına göre, NGSPERL kullanarak özetleme görevleri sonuçlanır.
  8. Bir tablo dosyasına ihraç sayım tabloya dönüştür.
  9. Başına Haritalı miRNA (RPMM) okur olarak o sınıfın (örn miRNA'lar sayısı okur) ve rapor sinyalleri için okur Normale toplam sayısı belirli bir sınıfın (örn miRNA'ların) okur. (Örneğin, RPMM = (miR-X / miRNA toplam # * 1000000) okur).
  10. düşük seviye ve üst düzey diferansiyeli için yazılımı içine jenerik tek renk teknolojisi olarak girdi normalize sayım tablosu kullanım kılavuzu talimatlarına (Malzeme Listesi) göre analiz eder.
    NOT: Şu anda, hiçbir iyi karakterize temizlik genler vardır / SRNHDL-Srna gelince. Bir başak-kontrol kullanılabilir, ancak sorunlu olabilir. toplam protein giriş veya hacim HDL normalize tavsiye edilir. En önemlisi, gerçek zamanlı PCR veya kantitatif PCR kullanılarak miRNA'lar ve sRNAs ölçmek için çeşitli stratejiler biri tarafından sıralama sonuçlarını doğrulamak için tavsiye edilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, yüksek verimli sekanslama veya gerçek zamanlı PCR (Şekil 1), son derece saf HDL sRNAs ölçümü sağlamak için birbirine bağlanmış edilmiş yöntemlerden dizisidir. fizibilite ve bu protokol etkisini göstermek için, HDL ikili DGUC ve FPLC yöntemi ile insan plazmasından saflaştırılmıştır. HDL (kolesterol dağılımı) karşılık gelen toplanan FPLC fraksiyonlar konsantre edildi ve toplam RNA HDL (toplam protein), 1 mg izole edilmiştir. Srna kütüphaneleri n = 4 sağlıklı i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, yüksek derecede saf HDL, yüksek verimli sekanslama ya da gerçek-zamanlı PCR ile miRNA'lar ve sRNAs ölçmek için tasarlanmıştır. Herhangi bir yaklaşımla olduğu gibi, özel durumlar arındırıcı HDL ve RNA sürecinde her adımda verilen ve daha sonra sRNAs ölçülmesi gerekir. Bu protokol, plazma ≥ 2 mL başlayarak projeler için tasarlanmıştır. Bununla birlikte, yüksek kalitede RNA analizleri başarılı afinite kromatografisi kullanılarak, insan ya da fare plazması az 80, uL saflaştırılmış HDL ile tamamlanabilir; An...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü'nden K.C.V. HL128996, HL113039 ve HL116263'a verilen ödüllerle desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda Amerikan Kalp Derneği'nden K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003 ve R.M.A. POST25710170'a verilen ödüllerle de desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ultrasantrifüj Beckman CoulterA99839Optima XPN-80
Ultrasantrifüj RotoruBeckman Coulter331362SW-41Ti
AKTA Saf FPLC SistemiGE Healthcare29018224
3x FPLC Superdex 200 Sıralı Sütunları ArtırınGE Healthcare2899094410/300 gl
SynergyMxBioTek Instruments7191000
Masaüstü santrifüjThermo Scientific75004525Sorvall ST40R
Soğutmalı santrifüjEppendorf226298675417R (USA Scientific aracılığıyla satın alındı)
Mikrofüj ve nbsp;ABD Bilimsel2631-0006
PippenPrepAdaçayı BilimPIP0001
2100 Biyoanalizör AgilentG2938B
Yüksek Hassasiyetli DNA TestiAgilent5067-4626
Sıralama Kitaplığı qPCR Miktar Belirleme KitiIlluminaSY-930-1010
4484073ProFlex Termal DöngüleyiciUygulamalı Biyosistemler
12k FlexUygulamalı Biyosistemler
9600001115070
Ultra şeffaf santrifüj tüpleriBeckman Coulter344059
Potasyum BromürFisher ChemicalsP205-500
15 mL konik tüpThermo Scientific339650
Mikro santrifüj filtreler 0.45 ve mikro; mMillipore UFC30HV00
Mikro santrifüj filtreler 0.22 & mMillipore UFC30GV00
miRNAEasy Toplam RNA İzolasyon KitleriQiagen217004
Total Kolesterol kolometrik kitiCliniqa (Raichem)R80035
10.000 mw kesme santrifüj filtresiAmiconUFC801024Millipore
PCR şerit tüpleriAxygenPCR-0208-CFisher aracılığıyla satın alındı
microRNA RT kitiYaşamTeknolojileri 43665971000 reaksiyon için
PCR ana karışımıYaşam Teknolojileri444004150 mL şişe
Pierce BCA kitiThermo Scientific23225
Temiz ve Yoğunlaştırıcı KitiZymoD4014
Diyaliz tüpüSpectrum Labs132118Fisher aracılığıyla satın alındı
bcl2fastq2Illuminan/aYazılım
Cutadapthttps://github.com/marcelm/cutadaptn/aYazılım
NGSPERLgithub.com/shengqh/ngsperln/aYazılım
CQSToolsgithub.com/shengqh/CQS.Toolsn/aYazılım
Bowtie 1.1.2 http://bowtie-bio.sourceforge.netn/aYazılımı
GeneSpringGX13.1.1Agilentn/aYazılımı
QuantStudio 4471134 EpMotion Robot Eppendorf aracılığıyla satın alındı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome. Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).
  2. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  3. Haussecker, D., et al. Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing. RNA. 16, 673-695 (2010).
  4. Li, Z., et al. Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs. Nucleic Acids Res. 40, 6787-6799 (2012).
  5. Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Lett. 340, 201-211 (2013).
  6. Maute, R. L., et al. tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1404-1409 (2013).
  7. Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).
  8. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
  9. Chen, C., Khaleel, S. S., Huang, H., Wu, C. H. Software for pre-processing Illumina next-generation sequencing short read sequences. Source Code Biol Med. 9, 8(2014).
  10. Vickers, K. C., Remaley, A. T. Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication. Curr Opin Lipidol. 23, 91-97 (2012).
  11. Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods. Methods Mol Biol. 1295, 179-209 (2015).
  12. Sung, B. H., Ketova, T., Hoshino, D., Zijlstra, A., Weaver, A. M. Directional cell movement through tissues is controlled by exosome secretion. Nat Commun. 6, 7164(2015).
  13. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  14. Jung, R., Lubcke, C., Wagener, C., Neumaier, M. Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens. Biotechniques. 23, (1997).
  15. Johnson, M. L., Navanukraw, C., Grazul-Bilska, A. T., Reynolds, L. P., Redmer, D. A. Heparinase treatment of RNA before quantitative real-time RT-PCR. Biotechniques. 35, 1140-1142 (2003).
  16. Garcia, M. E., Blanco, J. L., Caballero, J., Gargallo-Viola, D. Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis. J Clin Microbiol. 40, 1567-1568 (2002).
  17. Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13, 133-140 (1999).
  18. Bai, X., et al. Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients. J Mol Diagn. 2, 191-201 (2000).
  19. McShine, R. L., Sibinga, S., Brozovic, B. Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume. Clin Lab Haematol. 12, 277-285 (1990).
  20. Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circ Res. 107, 677-684 (2010).
  21. Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat Rev Genet. 13, 358-369 (2012).
  22. Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, e24145(2011).
  23. Kannan, M., Atreya, C. Differential profiling of human red blood cells during storage for 52 selected microRNAs. Transfusion. 50, 1581-1588 (2010).
  24. Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS One. 3, e2360(2008).
  25. Balzano, F., et al. miRNA Stability in Frozen Plasma Samples. Molecules. 20, 19030-19040 (2015).
  26. Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
  27. Cheung, M. C., Wolf, A. C. Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations. J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).
  28. Kunitake, S. T., Kane, J. P. Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge. J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).
  29. Laurent, L. C., et al. Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium. J Extracell Vesicles. 4, 26533(2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

K k Kodlamayan RNAYo unluk Gradyanl Ultrasantrif jH zl Protein S v KromatografisiHDL zolasyonuLipoprotein ProfillemesiPlazma FraksiyonlamaKolesterol l mBCA Protein Analizi

İlgili makaleler