pH bağımlı aktivitenin tespiti<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; İn Vitro</em&gt; ve<em&gt; İn Vivo</em

Özet

Bu çalışma, asidik pH koşulları altında E. coli HdeB bir şaperon aktivitesinin karakterize edilmesi için, biyofiziksel, biyokimyasal ve moleküler teknikler tarif eder. Bu yöntemler, örneğin başarılı bir şekilde HdeA gibi diğer asit koruma şaperonlar için uygulanmış ve diğer şaperonlar ve stres koşullarında çalışmak için modifiye edilebilir.

Özet

Bakteriler sıklıkla pH değişiklikleri, sıcaklık, redoks durumu, ışığa maruz kalma veya mekanik güç gibi çevresel değişikliklere maruz kalır. Bu durumların çoğu hücrede açılımı proteini neden organizmanın sağkalım üzerine olumsuz etkisi vardır. olmayan, stres-özel moleküler şaperonlar bir grup, bu stres koşullarında hayatta kalması gerekli roller oynadığı gösterilmiştir. Tamamen katlanmış ve hastabakıcı-inaktif stres önce, bu proteinler hızla açılmak ve spesifik stres koşulları altında hastabakıcı aktif hale iken. Bir kez bu koşullu düzensiz şaperonlar farklı toplama eğilimli proteinin çok sayıda bağlanan, aktive edilmiş, bunların birarada toplanmasını önlemek ve, ya doğrudan ya da dolaylı olarak non-stres koşullarına dönüş üzerine yeniden katlama proteini kolaylaştırır. onların aktivasyonu ve müşteri tanıma mekanizması hakkında daha ayrıntılı bir anlayış kazanıyor için birincil yaklaşım arınma ve subsequen içerirnitro şaperon deneyler kullanılarak bu proteinlerin t karakterizasyonu. In vivo stres deneyleri takip bağımsız in vitro sonuçlar elde onaylamak için kesinlikle gereklidir.

Bu protokol, E. şaperon aktivitesinin karakterize edilmesi için in vitro ve in vivo yöntemlere tarif E. coli HdeB bir asit aktive şaperon. Işık saçılım ölçümleri, in vitro olarak, kurulu bir modeli istemci protein, MDH asit ile indüklenen, toplanmayı önlemek için HdeB kapasitesi için uygun bir okuma olarak kullanılmıştır. Analitik Ultrasantrifügasyon deneyleri non-stres koşullarına döndükten sonra müşteri proteinlerin kaderi içine ışık tutacak, HdeB ve müşteri protein LDH arasındaki karmaşık oluşumunu ortaya çıkarmak için uygulanmıştır. Müşteri proteinlerin enzimatik aktivite deneyleri pH kaynaklı müşteri inaktivasyonu ve reaktivasyon üzerinde HdeB etkilerini izlemek için yapılmıştır. Son olarak, hayatta kalma çalışmaları için kullanılmıştır monitoin vivo HdeB en şaperon fonksiyonunun etkisini r.

Giriş

Mikrobiyal patojenler asit kaynaklı protein elinde tutmasına koşulları tecrübe edildiği bir ortak doğal çevre olan asidik pH gıda kaynaklı patojenler ¹ karşı etkili bir bariyer görevi görür memeli mide (pH aralığı 1-4) 'dir. Amino asit yan zinciri protonasyon nedeniyle protein açılması ve agregasyonu, biyolojik süreçleri, zarar hücresel yapıları etkileyen ve en sonunda hücre ölümüne ^1,2 neden olur. Bakteriyel periplazmaya pH nedeniyle gözenekli dış zar boyunca proton serbest difüzyonuna neredeyse aynı anda, çevre pH dengeye için, Gram-negatif bakterilerin periplazmik ve iç membran proteinleri asit, gerilimli şartlar altında ³ en hassas hücre bileşenleri bulunmaktadır. Hızlı asit aracılı olduğu hasarlara karşı gösterdikleri periplazmik Proteomun korumak için, Gram-negatif bakteriler asit ile aktive edilmiş periplazmik şaperonlar HdeA ve HdeB kullanmaktadır. HdeA bir şartlı bozukluğu şaperonudur ^{4,5: nötr pH'da, HdeA katlanmış, şaperon hareketsiz dimer olarak mevcuttur. PH 3 altında bir pH kayması sırasında, HdeA en şaperon fonksiyonu hızla 6,7 etkinleştirilir. HdeA aktivasyonu monomerlerin 6-8 açılımı derin yapısal monomerlerin içine ayrışma dahil değişiklikleri, ve kısmi gerektirir. Bu işlemden sonra, HdeA asidik koşullar altında açığa proteinlerine bağlanır. Bu etkili bir düşük pH değerlerinde inkübasyon sırasında hem de pH nötrleştirme sırasında hem agregasyonunu engeller. PH 7.0'a dönüş üzerine, HdeA bir ATP-bağımsız bir şekilde, istemci proteinlerinin yeniden katlanmasını kolaylaştırır ve dimerik, refakat-olmayan yapıya 9 geri dönüştürür. Benzer şekilde, benzer şaperon HdeB da refakat hareketsiz pH 7.0 ile kullanılmıştır. HdeA aksine, HdeB en şaperon aktivitesi, pH 4.0 HdeB hâlâ büyük oranda katlanır ve 10 dimerik olduğu koşullar altında, görünür maksimuma ulaşır. Ayrıca, daha fazla pH gevşeyebilir düşürücüHdeB inaktivasyonu es. Bu sonuçlar, büyük bir homoloji rağmen HdeA ve HdeB bunları koruyucu şaperon fonksiyonu ile geniş bir pH aralığı kapsayan sağlayan fonksiyonel bir aktivasyon tarzı açısından farklılık göstermektedir. E. asit direnci implike edilmiştir Diğer bir şaperon E. coli nötr koşullar restore kadar gelişeceğini istemci proteinleri stabilize görünen sitoplazmik Hsp31 vardır. Hsp31 en müdahale durumu net olarak, bununla birlikte, 12 anlaşılmaz kalmıştır. Salmonella gibi diğer enteropatojenik bakteriler hdeAB operonunu eksikliği göz önüne alındığında, diğer henüz kimliği belirlenemeyen periplazmik şaperonlar bu bakterilerin 11 asit direnci dahil olduğunu var olabilir kuvvetle muhtemeldir.}

Burada yer alan protokol vivo ¹⁰ in vitro ve in HdeB pH bağımlı şaperon etkinliğini izlemek için izin diğer şaperonlar araştırmak için uygulanabilirHsp31 gibi. Seçenek olarak ise, hdeAB ifadesini kontrol transkripsiyon faktörleri karmaşık ağ potansiyel in vivo gerilme testi ile araştırılabilir. In vivo olarak, proteinlerin şaperon işlevini karakterize etmek için, farklı deney düzenekleri uygulanabilmektedir. Birinci yol proteinin açılımı stres koşullar uygulanır ve fenotipik iki ilgili geni aşırı ifade eden ya da genin bir silme taşıyan mutant türünü nitelendirilmesidir. Proteomik çalışmalar chaperone mevcut olduğu zaman, gerilimli şartlar altında, toplam artık bu proteinleri belirlemek için yapılabilir, ya da belirli bir enzimin bir şaperon etkisi Enzimatik ^14-16 kullanılarak stres şartlarında belirlenebilir. Bu çalışmada, tüm büyük E. ekspresyonunu kontrol RpoH ısı şoku sigma faktörü 32. yoksun bir rpoH delesyon suşu içinde HdeB aşın tercih E. coli chaperones ve silme sens arttırdığı bilinmektedirprotein ¹⁵ açılımı neden olan çevresel stres koşullarına iTivity. HdeB in vivo şaperon aktivitesi Δ rpoH soyunun pH duyarlılığı bastırmak için kabiliyetini izleyerek tespit edilmiştir. Özet olarak, burada sunulan protokoller in vitro hem de in vivo bağlamında bir asit ile aktive edilmiş cinsten aktivitesinin karakterize edilmesi için hızlı ve basit bir yaklaşım sağlar.

Protokol

1. Ekspresyonu ve periplazmik HdeB saflaştırılması

Not: HdeB E. ifade edildi polimiksin lizizi sonrasında periplazma plazmid pTrc- hdeB ¹⁰ ve saflaştırılmış barındıran E. coli hücreleri.

1. E. bir gecede kültürü hazırlayın 200 ug / ml ampisilin (LB _Amp) içeren 30 ml LB plazmidden pTrc- hdeB ¹⁰ barındıran E. coli hücreleri. 0.7 OD _600nm ulaşılana kadar LB _Amp dört adet 1 L kültürlerinin aşılanması ve 37 ° C 'de büyümek ve 200 rpm'de. Daha sonra, HdeB ifadesinin sağlanması ve 30 ° C'ye kadar bir büyüme sıcaklığı azaltmak için 300 uM IPTG ilave edin.
2. 30 ° C'de protein ekspresyonu 5 saat sonra, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 8000 x g'de santrifüj ile hücreler hasat edilir.
3. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 8000 x g'de Hücreler tekrar A (50 mM Tris / HCl, 50 mM NaCI, pH 7.5) ve santrifüj ml tampon 100 hücre pelletini yıkayın.
4. Daha sonra, tekrar süspansiyon80 hücre peleti mi, 1 mg / ml polimiksin sülfat içeren bir tampon. Dış membran etkin bozulması için, hafifçe 4 ° C 'de 1 saat süre ile süspansiyon karıştırılmıştır.
5. sitoplazmik bölümünü ve hücre artıkları çıkarmak için 4 ° C'de 15,000 x g'de 20 dakika süre ile süspansiyon santrifüj. Bu ~ çözünür HdeB ihtiva eden 60 ml süpernatant sonuçlanır.
6. 6 kDa MW bir diyaliz membranı kullanılarak B tamponu (20 mM Tris / HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8.0) 150X birim karşı gece boyunca periplazmik özü ihtiva eden üst sıvıyı Dialyze cut-off. 3 kDa'lık bir molekül ağırlığı kesmesi olan santrifüj filtre birimleri kullanarak 15 ml proteinleri konsantre edilir. 0.2 mikron gözenek filtre kullanarak protein çözüm Filtre.
7. 2.5 ml / dakika bir akış oranı ile 5 kolon hacmi tampon B ile dengelenmiş olan bir anyon değiştirme kromatografisi kolonuna (kolon hacmi 5 mi) üzerine protein uygulanır. Protein kolonuna yüklenir sonra, 10 dakika ile için tampon B ile sütun yıkama/ Dakika 2.5 ml'lik bir akış oranı. 2.5 mL / dakika ⁶ bir akış oranı ile 50 dakika arasında bir zaman süresi içinde tampon B içinde 0.5 M NaCI, 0 ila bir doğrusal gradyan ile elüte HdeB.
8. % 15 SDS-PAGE kullanılarak HdeB ihtiva eden fraksiyonlar tanımlar. 5 ul 5x indirgenmiş SDS yükleme tamponu ile 20 ul örnek karıştırın. Yük 10 jel üzerine ul Tris-glisin tamponu (14.4 g / L glisin, 2.9 g / L Tris, 1 g / L sodyum dodesil sülfat, pH 8.3) 'de çalışır. Bromophenol bant jel (~ 45 dk) tabanına yakın göç kadar 150 V jel çalıştırın.
9. Havuz Tüm HdeB içeren fraksiyonlar, 4 L HdeB depolama tamponuna karşı gece boyunca 4 ° C'de diyalize (50 mM Tris / HCI, 200 mM NaCI, pH 8.0) ve bir moleküler ağırlığa sahip santrifüj filtre birimleri kullanılarak, yaklaşık 300 uM proteini konsantresi cut-off 3 kDa. Sönümleme katsayısı ε _280nm = 15595 M kullanılarak 280 nm'de HdeB konsantrasyonunu belirlemek ^-1 cm ^-1. 100 ul hacimde ve flaş ücretsiz hazırlayınsıvı azotta ze.
   Not: HdeB en az 6 ay boyunca -70 ° C 'de muhafaza edilebilir.

2. Şaperon Aktivite Deneyi Malat Dehidrogenaz Unfolding Termal Kullanma (MDH)

Not: termal farklı pH değerlerinde domuz mitokondriyal malat dehidrojenaz (MDH) açılma agregasyonu üzerinde saflaştırıldı HdeB etkisi aşağıda tarif edildiği gibi gözlenmiştir. Listelenen tüm protein konsantrasyonları monomer konsantrasyonunun bakın.

1. MDH hazırlanması için, bir gece boyunca 4 L tampon C (50 mM potasyum fosfat, 50 mM NaCI, pH 7.5) karşı 4 ° C'de diyaliz MDH ve 30 arasında bir molekül ağırlığı kesmesi olan santrifüj filtre birimleri kullanılarak, yaklaşık 100 um proteini konsantresi kDa.
   NOT: MDH amonyum sülfat çözeltisi olarak teslim edilir olarak MDH dikkatli diyaliz gereklidir.
2. birikimlerin çıkması için, 4 ° C'de 20,000 x g'de 20 dakika boyunca santrifüj protein. ε <(280 nm'de absorbans ile MDH konsantrasyonunu belirleyinalt> 280 nm = 7,950 ^{M-1 cm-1).} MDH 50 ul hacimde hazırlayın ve depolama için alikotları flaş dondurma.
3. Sıcaklık kontrollü numune tutucu ve bir karıştırıcı ile donatılmış bir floresan spektrofotometrede 1 ml kuartz küvet yerleştirin. Set λ _{eski / em} 350 nm.
4. küvete ve ayarlamak için: (pH 2.0, pH 3.0, pH 4.0 ve pH 5.0 buradan) istenen pH değerlerinde önceden ısıtılmış (43 ° C) tampon D (150 mM potasyum fosfat, 150 mM NaCl), uygun hacimleri ekleme 43 ° C'ye kadar bir küvet taşıyıcısına sıcaklık. toplam hacmi 1000 ml.
5. 0.5 uM MDH ilave edildi tampon 12.5 uM HdeB (ya da seçenek olarak bir tampon kontrol HdeB depolama, aynı hacimde tampon) ekleyin. ışık saçılması izleme başlayın. MDH açılma yeterli olacak şekilde 360 ​​saniye boyunca reaksiyon inkübe edin.
6. HPO ₄ 2 M tamponsuz K ₂ 0,16-0,34 hacmi eklenerek 7 pH değerini arttırmak ve yeniden devamBaşka bir 440 sn için ışık saçılması Cording.
7. nötralizasyon sonra belli bir zaman noktasında hastabakıcı yokluğunda kaydedilen MDH agregasyon derecesini ayarlamak% 100 (burada MDH maksimal ışık saçılması gözlendi 500 saniye sonra). Her belirtilen pH değeri HdeB yokluğunda MDH ışık saçılması sinyaline HdeB etkinliğini normalleştirmek.

Analitik Ultrasantrifügasyon tarafından HdeB-LDH Kompleks Oluşumunun 3. Algılama (AUC)

Not: HdeB tek başına ya da termik olarak laktat dehidrojenaz (LDH) açılma ile kompleks içinde çökelme hızı deneyleri analitik ultrasantrifüj kullanılarak yapıldı.

1. 4 L tampon C (50 mM potasyum fosfat, 50 mM NaCI, pH 7.5) karşı bir gece boyunca 4 ° C 'de LDH diyaliz, LDH hazırlanması ve 30 arasında bir molekül ağırlığı kesmesi olan santrifüj filtre birimleri kullanılarak, yaklaşık 200 uM protein yoğunlaştırmak kDa.
   NOT: LDH dikkatli diyaliz LD olarak gereklidirH, amonyum sülfat solüsyon olarak iletilir.
2. 4 ° C'de 20,000 x g'de 20 dakika süre ile agrega santrifüj LDH kaldırın. 280 nm'de absorbans ile LDH konsantrasyonunu belirlemek (ε _{280 nm} = 43.680 ^{M-1 cm-1).} LDH 50 ul hacimde hazırlayın ve depolama için alikotları flaş dondurma.
3. 41 ° C'de 15 dakika süre ile tampon D 30 uM HdeB varlığında ve yokluğunda (sırasıyla pH 4 ve 7), 3 uM LDH inkübe edin.
   Not: komple agregasyonda yükseltilmiş sıcaklıkta LDH inkübasyon ve HdeB hiç şaperon etkisi gözlemlenebilir.
4. Numuneler oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Sonra, standart sektörünü içeren hücrelerin içine yük numuneleri 1.2 cm uzunluğunda bulunan 2 kanallı centerpieces şeklinde. ultrasantrifüjdeki içine hücreleri yükleyin ve önceki çökelme, en az 1 saat boyunca 22 ° C'ye kadar dengeye getirin.
5. Sıkma 22 ° C 'de numuneler, 12 saat süre ile, ilgili rotor 167.000 x g ve sed izlemekSürekli 280 nm'de protein imentation. Daha önce gösterildiği gibi, her kanalın geçen ışık şiddeti Absorbans yerine ölçüldüğü zaman, sinyal gürültü oranı artırıldı. Bu, daha sonra veri uydurma kalitesini arttırır.
6. Sürekli c (ler) dağıtım modeli ¹⁷ kullanılarak, SEDFIT (sürüm 15.01b 2015 Aralık) veri analizi yapıyoruz. Nasıl SEDFIT kullanmayı anlatan bir öğretici referans ¹⁸ bulunabilir.
   1. 0,7 ME (Maksimum Entropi) regularization için güven seviyesini ayarlayın.
7. SEDNTERP ¹⁹ kullanılarak tampon yoğunluğunu yanı sıra viskoziteyi hesaplayın. , Toplu müşteri protein miktarını tahmin referans olarak pH 7 pH 4'te tortulaşmış LDH integral karşılaştırmak için.
   NOT: sedimantasyon dağılımın Entegrasyon SEDFIT doğrudan yapılabilir. Sedimantasyon hızı verilerini analiz etmek için alternatif bir yazılım son inceleme ²⁰ bulunabilir.

HdeB Varlığında 4. İzleme MDH inaktivasyonu ve Yeniden

Not: pH katlanmamış MDH yeniden katlanması ile saflaştınldı HdeB etkisi nötralizasyondan sonra MDH faaliyeti gözlenerek belirlenmiştir.

1. ya da yokluğunda 25 uM HdeB mevcudiyetinde 37 ° C 'de, 1 saat boyunca (pH 2.0, pH 3.0, pH 4.0 ve pH 5.0 buradan) istenen pH değerlerinde tampon D 1 uM MDH inkübe edin. Daha sonra, 10 dakika boyunca 20 ° C'ye kadar bir sıcaklık geçişi.
   Not: MDH 37 ° C'den daha yüksek sıcaklıklarda kuluçkaya zaman Resim MDH yeniden katlama da HdeB mevcudiyetinde gözlenmiştir.
2. Asit denatüre MDH yeniden katlanması başlatma 0.5 M sodyum fosfat, pH 8.0 0,13-0,42 hacminin ilavesiyle pH 7'ye örnekleri etkisiz hale getirir.
3. 20 ° C 'de 2 saat süre ile inkübasyondan sonra, 340 nm ^9'da NADH düşüş gözlenerek MDH aktivitesi belirlenir.
   NOT: MDH L-malat içine oksaloasetat ve NADH bağımlı bir azalma katalize eder.
   1. 950 deney tamponu ul (50 mM sodyum fosfat, pH 8.0, 1 mM oksaloasetat ve 150 uM NADH) ile inkübasyon reaksiyon 50 ul karıştırın.
      Not: Deney tamponunda MDH nihai konsantrasyon 44 nM olması gerekir.
   2. 20 ° C olarak ayarlanmış bir Peltier sıcaklık kontrol bloğu ile donatılmış bir spektrofotometre kullanılarak absorbans değişikliği, izleyin.
   3. pH 7.0 tutuldu 44 nM yerli MDH için MDH aktivitesi göreli bildirin.

E. tarihinde HdeB aşırı ifadesinin 5. Etkisi Asit Stres altında coli Survival

NOT: E. E. coli MG1655 genomik DNA yayınlanmış bir protokol ²¹ kullanılarak izole edilmiştir.

1. E. hdeB yükseltin BamH I-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG CAA GTC ATT ve hdeB - - EcoR I-fw GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC C. PCR primerleri hdeB kullanarak coli MG1655
2. Aşağıdaki şekilde 50 ul PCR reaksiyonu başlatacak: 10 ul 5x polimeraz tamponu, 200 uM dNTP, 0.5 uM primer JUD2, 0.5 uM primer JUD5, 150 ng genomik DNA, MG1655, 0.5 ul DNA polimeraz, GKD ₂ O 50 ul ekle.
3. Şöyle hdeB amplifikasyonunu yapmak: Aşama 1: 95 ° C, 1 döngü, 5 dakika; Adım 2: 95 ° C'de 30 saniye, 55 ° C'de 30 saniye, 72 ° C, 40 döngü 30 saniye; Aşama 3: 72 ° C'de 10 dakika.
4. Sınırlama mevkisi klonlama için, standart yöntemler kullanılarak plazmid pBAD18 EcoR I ve BamH I bölgeleri içine PCR fragmanı elde Klon. üreticinin talimatlarına uygun olarak bir plazmid arındırma kiti kullanılarak plazmid saflaştırılır. Sıralama ¹⁰ ile sonuçlanan plazmid doğrulayın.
5. HdeB veya zorlanma BB7224 içine boş vektör kontrolü pBAD18 (Δ rpoH) (genotip ifade plazmid Dönüşümü: F ^- λ ^- e14 ^- [araD139] _{B / r} [6 (argF-lac) 169 flhD5301 Δ (FRUK-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (Sm ^R) rbsR22 Δ (fimB-fimE) 632 (:: IS1) ptsF25 zhf :: TN 10 (Tc ^S) suhX401 deoC1 Arad ⁺ rpoH :: kan ^{+; 16)} kimyasal yetkili hücreleri kullanılarak.
   NOT: Bu gerginlik ısıya duyarlı olduğunu.
6. 45 saniye 42 ° C'de ısı şoku ve önceki kaplama için Sonra, 30 ° C ve 200 rpm'de inkübe hücreleri. Pozitif klonların tek bir koloni çizgi-çıkışları gerçekleştirin ve gece boyunca 30 ° C kuluçkaya yatmaktadır. 50 mi LB _Amp bir gece boyunca kültür Hazırlama 200 rpm ve 30 ° C 'de hücrelerin kültive edilmesi.
7. Bir gecelik kültürler 25 mi LB _Amp 40. kat seyreltilir ve HdeB protein ifadesini uyarmak üzere 30 ° C ve bir OD _{600 Nm} 200 rpm = 1.0, 0.5,% arabinoz (ARA) mevcudiyetinde bakterilerin yetiştirilmesi.
8. pH değişim deneyler için, LB kullanmakAmp + Ara 0.5 OD _600Nm hücreleri sulandırmak ve (burada: pH 2.0, pH 3.0 ve pH 4.0) ilgili pH değerlerine ayarlamak için 5 M HCl uygun hacimleri ekleyerek.
9. Belirtilen zaman noktalarında (pH 3, 2.5 dakika; pH 2, 1 dakika, pH 4, 30 dakika) sonra, 5 M NaOH uygun hacimleri ilave edilerek kültürleri nötralize eder.
10. OD ölçümleri kullanılarak, 30 ° C'de 12 saat süre ile sıvı kültürde etkisiz hale kültürlerin büyümesini izlemek.

Sonuçlar

HdeA ve HdeB E. homologdur asit stres koşulları ¹⁰ karşı periplazmik proteinlerin korumak için bilinen E. coli proteinleri. Çalışmalarımız bir asit moleküler koruyucuya aktif olarak HdeA benzer HdeB da işlev ortaya koydu. Bununla birlikte, potansiyel olarak bakteri ama HdeA ^6,9,10,22 optimum pH değeri önemli ölçüde daha yüksek olan bir pH değerinde HdeA, HdeB işlevleri tersine. In vitro HdeB en şaperon aktivitesinin pH optimumu araştırmak ...

Tartışma

aktivasyonu ve HdeB bir şaperon fonksiyonu mekanizmasını araştırmak için, HdeB büyük miktarlarda ifade edilmiş ve saflaştırılmış gerekir. sentezleme vektör sistemleri bir dizi bu çalışmada kullanılmıştır, her ikisi de pTrc ya pBAD vektörleri de dahil olmak üzere, bir hedef proteinin yüksek seviyeleri üretimi için kullanılabilir. Destekleyiciler E. için kolayca erişilebilir E. coli RNA polimerazı ve bir E. HdeB böylece güçlü yukarı regüle getirilmesine olanak tanıyan ifade coli s...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
NEB10-beta E. coli< / em> hücreleri	New England Biolabs	C3019I
Ampisilin	Altın Biyoteknoloji	A-301-3
LB Et suyu karışımı, Lennox	LAB Express	3003
IPTG	Altın Biyoteknoloji	I2481C50
Sodyum klorür	Fisher Scientific	S271-10
Tris	Amresco	0826-5kg
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
Polimiksin B sülfat ve nbsp;	ICN Biyomedikal A.Ş.
0.2 ve mikro; m gözenekli steril Şırınga Filtresi	Corning	431218
HiTrap Q HP (CV 5 ml)	GE Healthcare Life Sciences	17-1153-01
Mini-Protean TGX, %15	Bio-Rad	4561046
Malat dehidrojenaz (MDH)	Roche	10127914001
Potasyum fosfat (Monobazik)	Fisher Scientific	BP362-500
Potasyum fosfat (Dibazik)	Fisher Scientific	BP363-1
F-4500 floresan spektrofotometresi	Hitachi	FL25
Oksaloasetat	Sigma	O4126-5G
NADH	Sigma	N8129-100MG
Sodyum fosfat monobazik	Sigma	S9390-2.5KG
Sodyum fosfat dibazik	Sigma	S397-500
Laktat dehidrojenaz (LDH)	Roche	10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I analitik Ultrasantrifüj	Beckman Coulter	392764
Merkez parçası, 12 mm, Epon Kömür dolgulu	Beckman Coulter	306493
AN-50 Ti Rotor, Analitik, 8'li	Beckman Coulter	363782
Wizard Plus Miniprep Kiti	Promega	A1470	plazmit saflaştırması için kullanılır (Protokol 5.1)
L-arabinoz	Altın Biyoteknoloji	A-300-500
Glisin	DOT Scientific Inc	DSG36050-1000
Floresan Hücre küveti	Hellma Analytics	119004F-10-40
Oligonükleotidler	Invitrogen
Phusion Yüksek Kaliteli DNA polimeraz	New England Biolabs	M0530S
dNTP seti	Invitrogen	10297018
Hidroklorik Asit	Fisher Scientific	A144-212
Sodyum Hidroksit	Fisher Scientific	BP359-500
Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL	Milipore	UFC900324
Santrifüj Avanti J-26XPI	Beckman Coulter 393127
Varian Cary 50 spektrofotometre	Agilent Tech
Spectra/Por 1 Diyaliz Membranı MWCO: 6 kDa	Spektrum Laboratuvarları	132650
Amicon Ultra Santrifüj Filtre Üniteleri 30K	Millipore	UFC803024
SDS	Fisher Scientific	bp166-500
Veriti 96 Kuyulu Termal Döngüleyici	Termo Fisher	4375786