Yöntem makalesi

3D Görüntüleri Hızlı Toplama Yüksek çözünürlüklü Episcopic Mikroskopi kullanma

DOI:

10.3791/54625

⸱

21 Kasım 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Surgery, The Second Affiliated Hospital & Yuying Children's Hospital, Wenzhou Medical University, 2Departments of Urology, Boston Children's Hospital, 3Department of Surgery, Harvard Medical School, 4Department of Cardiovascular Surgery, Guangdong Cardiovascular Institute, Guangdong General Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare embriyolarının üç boyutlu (3D) görüntülerini elde etmek için yüksek çözünürlüklü episkopik mikroskopi kullanan ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Bu geliştirilmiş protokol, floresan boyanın penetrasyonunu arttırmak için modifiye edilmiş bir doku hazırlama yöntemi kullanır, böylece hem küçük hem de büyük boyutlu numunelerin morfometrik analizine izin verir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek çözünürlüklü episkopik mikroskobik (HREM) teknolojisi, yüksek çözünürlüklü dijital hacimsel ve üç boyutlu (3D) morfometrik verilerin hızlı bir şekilde elde edilmesini sağlar. Burada, tüm fare embriyosunu görüntülemek için ayrıntılı protokolü açıklıyoruz. Protokol dört ana bölümden oluşur: numune hazırlama, gömme, görüntü elde etme ve son olarak 3D görselleştirme. Teknoloji, numunelerin floresan bir boya ile boyanmasını gerektirir, bu da büyük veya yoğun numuneler için sorunlu olabilir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, numuneyi üre ve sodyum dodesil sülfat içeren bir çözelti ile ön işleme tabi tutarak boyanın doku penetrasyonunu arttırmak için mevcut protokolü geliştirdik. Protokol, standart laboratuvar ortamlarında kolay adaptasyon için yalnızca rutin laboratuvar ekipmanı ve reaktifleri kullanır. Elde edilen yüksek çözünürlüklü 3D görüntülerin, fare embriyolarının iç organlarının ayrıntılı morfolojik özelliklerini aslına uygun olarak özetlediğini ve böylece morfometrik analizlere izin verdiğini gösteriyoruz. Birlikte, küçük ve büyük boyutlu numunelerin yüksek çözünürlüklü 3D görüntülerini elde etmek için standart laboratuvar ekipmanını kullanarak ayrıntılı ve geliştirilmiş bir protokol sunuyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D görüntüleme teknolojilerinin ortaya çıkışı, fetal gelişim sırasında ayrıntılı morfolojik özelliklerin sistemik analizi olasılığını ortaya çıkarmıştır. Mikro manyetik rezonans görüntüleme (mikro-MRI), mikro bilgisayarlı tomografi, yüksek frekanslı ultrason, optik koherens tomografi, optik proje tomografisi ve episkopik mikroskopi1-4 gibi çeşitli 3D görüntüleme modaliteleri mevcuttur. Her modalitenin çözünürlük, kontrast, hız, maliyet, rahim içi kabiliyet ve kullanılabilirlik açısından kendine özgü özellikleri vardır.

Piskopik floresan görüntü yakalama (EFIC) ve yüksek çözünürlüklü episkopik mikroskopi (HREM) episkopik mikroskopi görüntüleme yöntemleridir4. Burada doku kesitleri yerine blok yüzünden sürekli olarak yüksek çözünürlüklü seri görüntüler yakalanır. Elde edilen görüntüler, minimum doku distorsiyonu ile veya hiç doku distorsiyonu olmadan ayrıntılı morfolojik özellikleri aslına uygun olarak yansıtır. Elde edilen hacimsel veriler, doğru morfometrik analiz için uygun olan yüksek çözünürlüklü 3 boyutlu görüntülere kolayca dönüştürülür. Göreceli olarak düşük maliyet ve yüksek çözünürlük nedeniyle, HREM ve EPIC, insan doğum kusurlarının fare modellerinin sistemik değerlendirmesi için üstün alternatifler haline gelmiştir2,4-8.

Hem EFIC hem de HREM yöntemleri, numunelerin uygun ortama gömülmesini gerektirir. EFIC, gömülü dokudan yayılan otofloresanı algılar. Bu nedenle, yüksek düzeyde otofloresan yayan örneklerle sınırlıdır, ancak erken evre embriyolar gibi nispeten zayıf otofloresan yayan örneklerle sınırlı değildir9. Otofloresan bağımlılığının üstesinden gelmek için, numuneler HREM görüntüleme için eozin gibi bir floresan boya ile boyanır. Boya ve boyama yöntemlerinin seçimleri, HREM'i doku mimarisi ve morfolojisi bağlamında moleküler sinyalleri tespit etmek için daha uyumlu hale getirir4,10.

Bu makalede, geç evre fare embriyolarının tüm vücut değerlendirmesi için uygun geliştirilmiş bir HREM protokolü sunuyoruz. Boyamayı kolaylaştırmak için, doku penetrasyonunu artırmak için bir ön işlem adımı ekliyoruz, böylece yaşlı fare embriyolarının HREM görüntülemesini sağlıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan kullandığı Boston Çocuk Hastanesi'nde Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.

1. Numune Hazırlama

  1. Zamanlı çiftleşme
    1. Aynı kafeste birlikte C57BL6 vahşi tip erkek ve bir dişi koyun.
    2. Bir çiftleşme fiş oluşumu sonraki sabah erken olup olmadığını kontrol edin. Çiftleşme fişi (aka vajinal veya çiftleşme fişi) bloke vajina sertleştirilmiş jelatinli birikmesidir.
    3. embriyonik gün 0.5 (E0.5) olarak fiş tarihini ayarlayın.
  2. Fare embriyolarının izolasyonu
    1. CO 2 boğulma hamile kadın öldürülür.
    2. emici ped sırtüstü fareler koyun ve% 70 etanol ile karın bölgesini püskürtün.
    3. Cildi kaldırın ve cerrahi makas kullanarak kaudal karın bölgesinde bir ilk 5 mm kesi yapmak. Kes ve tam iç organları maruz karın cilt kaldırmak
    4. va yakın Cutgina tüm rahim kaldırmak için.
    5. uterin horn boyunca implantasyon siteleri arasında kesin. Her segment veya konseptus içinde sadece tek bir embriyo olmalıdır.
    6. 1x buz soğukluğunda fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde uterus segmentleri tutun.
  3. embriyo diseksiyonu
    1. Stereoskop altında buz soğukluğunda PBS ile ayrı bir kapta, her bir konseptus yerleştirin.
    2. sırayla ince diseksiyon forseps kullanarak rahim dokuları, plasenta ve sonra fetal membranlar çıkarın.
    3. 1x soğuk PBS büyük transfer pipeti kullanılarak 50 ml'lik bir tüpe parçalara embriyo transferi. doku hasarı en aza indirmek için forseps ile doğrudan embriyo toplayıp kaçının.
  4. tespit
    1. fiksatif en az 10 numunelerle fazla 24 saat boyunca 4 ° C'de% 10 nötr tamponlu formalin çözeltisinde kesildi embriyolar düzeltildi.
  5. Tedavi öncesi
    1. Takas Çözüm hazırlayın: 4M üre, çift damıtılmış su içinde% 10 gliserol,% 4 sodyum dodesil sülfat (SDS).
    2. Takas Çözümü ile fiksatif değiştirin.
    3. 2 hafta - yavaşça 1 oda sıcaklığında bir rocker örnek döndürün. İkinci ve üçüncü gününde bir kez Takas Çözüm alışverişi. Numune yavaş yavaş açık ve saydam hale gelir.
    4. % 10 formalin ile Takas değiştirin Çözüm ve 2 gün boyunca bir rocker bırakın.
  6. kurutma
    1. Her biri 5 dakika için 1 x 3 defa PBS ile muamele edilmiş numune yıkanır.
    2. yumuşak bir rocker oda sıcaklığında artan etanol seri örnekleri kurutmak. E15.5 embriyo için,% 50,% 60,% 70,% 80,% 85,% 90,% 95 ve% 100 etanol, 2 saat her bir aşama dahil olmak üzere yükselen etanol serisi kullanır. büyük embriyolar için inkübasyon süresi arttırılması gerekir.
  7. boyanma
    1. Eosin Y Disodyum Tuz ve 0.02 0,1375 gram ekleyin: Boyama Çözüm hazırlayınAkridin Portakal Hemi (çinko klorür)% 100 etanol içinde 50 ml tuz 75 gram. 2 saat boyunca karıştırın. Bir filtre kağıdı ile filtre. Oda sıcaklığında saklayın ve alüminyum folyo ile kaplanarak ışık kaçının.
    2. 1 saat Boyama Çözüm örnek aktarın.
    3. Taze Boyama Çözüm ve leke gecede ile değiştirin.
  8. Süzülme
    1. Sızma çözeltisi hazırlayın: JB-4 gömme kiti çözeltisi bir 100 ml, C Katalizörünün 1.25 g, Eosin Y disodyum tuzunun 0.275 g ve Akridin Portakal Hemi (çinko klorür) tuzunun 0.055 g 'ını. 2 saat boyunca, bir buz kova içinde (200 rpm) karışımı karıştırılmış ve bundan sonra filtre kağıdı ile süzülür.
    2. 4 ° C'de Sızma Çözüm saklayın ve alüminyum folyo ile kaplanarak ışık kaçının.
    3. (1: 1) Boyama Çözüm: Çözüm infiltrasyon embriyo transferine ve 4 ° C'de bir rocker en az 3 saat süreyle inkübe.
    4. Çözüm infiltrasyonuna embriyo transferi ve 3 saat süre ile inkübeSoğuk bir odada bir rocker r.
    5. bir zamanlar her gün Sızma değiştirin Çözüm ve üç gün daha nazik bir rocker soğuk bir odada bırakın.

2. gömülmesi

  1. buz üzerinde Çözüm B ve Sızma Çözüm tutun.
  2. hemen gömmeden önce (Çözüm Yatak ve Sızma Çözüm 1:25) gömülmesi Çözüm olun.
  3. Bir gömme kalıp Orient örnek, daha sonra yavaşça gömme kalıp içine soğuk katıştırma Çözüm dökün. Yeniden yönlendirmek gerekirse bir iğne ile.
  4. Gömme Çözüm katılaşmış olup olmadığını incelemek için bir iğne kullanın. Numune bloğu dışarı itmek, ve gerekirse düzeltin.
  5. çapraz yönlendirme elde etmek için ayrı kalıp kullanılarak örnek blok yönünü değiştirin.
  6. gömme kalıp üstünde bir blok tutucu koyun. Kalıp ve blok tutucu Çözüm gömülmesi ile batık kadar yavaşça kalıp içine gömülmesi Çözüm dökün.
  7. ikincil kapta numune tutun ve bırakınBir çeker ocak içinde 4 saat - 3 boyunca buz üzerinde.
  8. 4 ° C'de katılaştırıldı örnekleri saklayın.
  9. gömme kalıp uzak soyun. bloğundaki numunenin konumunu incelemek için eğik aydınlatma ile stereomicroscope altında blok koyun. numune etrafında blok yüzünde işaretleyiniz ızgara çizgileri.
  10. referans olarak işaretlenmiş kılavuz çizgileri kullanarak gömülü malzemenin erişim miktarını kaldırmak için blok Trim.

3. Görüntü Alma

  1. mikrotom numune bloğu Kelepçe ve taze kesilmiş bir yüzey elde. Set kesit kalınlığı (örneğin, e9.5-10.5, 1.5 um; e11.5-12.5, 2.0 um; e13.5-15.5, 2.5 mikron; e16.5-yaşlı, 3 um). microtome ev pozisyonunda numune / blok tutun.
  2. yatay numunenin blok yüzeyine bakan stereo zoom mikroskop monte edin.
  3. Bilgisayar ve mikroskop açın ve görüntü elde etme yazılımı başlatmak.
  4. Görselleştirmek ve blok yüze optik odakgörüntüleme yazılımı "canlı görüntü" modunda.
  5. Blok-yüz vizörün merkezde olacak şekilde gerekirse mikroskop ve mikrotom hizalayın.
  6. Tüm blok yüz vizör içinde olacak şekilde zoom ayarlayın.
  7. Yeşil floresan proteini (GFP) filtre (uyarma 470 ± 20 nm, dikroik 495 nm, emisyon 525 ± 25 nm) seçin ve gerekirse tekrar odaklayın.
  8. Tedbir ve manuel pozlama süresi ayarlayın (örneğin, 80-400 küçük sn).
  9. Her taze kesilmiş sonra blok-yüz görüntüleri elde etmek ve mümkünse otomatik olarak görüntüleri kaydetmek.
  10. çözünürlük, kesit kalınlığı ve zoom dahil Tutanak önemli parametreler.
  11. Tüm örnek, ihracat terbiye ve gerekirse JPEG formatına tüm resim dosyalarını dönüştürdükten sonra.
  12. Bir görüntü işleme yazılımı kullanarak tüm orijinal görüntüleri haricindekileri ve parlaklık ve kontrastı ayarlayın.
  13. Ayrı bir klasördeki tüm işlenmiş görüntüler kaydedin.

4. 3Dgörüntüleme

  1. talimatları izleyerek bir 3B görselleştirme yazılımı tüm işlenmiş görüntüleri yükleyin.
  2. Giriş hassasiyeti ve kesit kalınlığı hacimsel veri (yani voksel boyutu) tüm görüntüleri dönüştürmek ve 3B dosyayı kaydedin.
  3. Otomatik modu kullanarak tüm görüntüleri hizalayın. Gerekirse elle tek tek görüntüleri ayarlayın.
  4. yeni bir dosya adı hizalanmış görüntü kaydetme.
  5. 3D görselleştirme yazılımı kullanarak numunenin morfometrik özelliklerini analiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz E9.5 ve E13.5 8 arasında fare embriyoları yüksek kaliteli HREM görüntüler bildirdi. Geç sahnelenen embriyoların Görüntü kalitesi, ancak, önemli ölçüde, çünkü floresan boya eozin sınırlı doku penetrasyonu tehlikeye düşer. Boyama verimini artırmak için, biz floresan görüntüleme 11 uyumlu birkaç ön yöntemleri test ettik. Özel olarak, E15.5 fare embriyo Sca / e A2 12 veya tüm vücut 13 KÜP ile tedavi edildi. Ayrıca aşağıdaki basitleştirilmiş for...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, hızlı 3 boyutlu görselleştirme ve karmaşık yapıların morfometrik analizi için uyumlu seri HREM görüntüleri elde etmek için rutin laboratuvar ekipmanı kullanılarak modifiye edilmiş bir protokol mevcut. yüksek çözünürlüklü görüntüler yerine bireysel bölümlerin blok yüzüne doğrudan alınır, çünkü ince morfolojik özellikleri korunmuş ve hızla bir 3B görselleştirme programında dijital olarak yeniden yapılandırılmaktadır.

3D görüntü görselleştirmek ve karmaşık morfolojik özellikleri anlaşıl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Teknik destekleri için Dr. Yichen Huang, Chunming Guo ve Zhenfang Zhou'ya teşekkür ederiz. Bu araştırma NIH/NIDDK (1R01DK091645-01A1, XL) ve Amerikan Kalp Derneği (AHA, 13GRNT16950006, XL) tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
FarelerJackson LaboratuvarıC57BL6
Etil AlkolPharmco-Aaper111000200200 Kanıt, Mutlak, ACS/USP/Koşer Sınıfı
FormalinSigmaHT501128-4L
ÜreSigmaU5128Temizleme Çözeltisi
GliserolFisher bilimselG33-4Temizleme Çözeltisi
Sodyum Dodesil SülfatInvitrogen15525-017Temizleme Çözeltisi
Eosin Y Disodyum TuzuFisher bilimselBP241925Sızma Çözeltisi
Akridin Portakal hemi (çinko klorür) tuzuSigmaA6014Sızma Çözeltisi
Whatman kağıdıGE3030-153
JB-4 Gömme Kiti - Çözüm APolysciences, Inc.0226A-800Sızma Çözümü
JB-4 Gömme Kiti - Çözüm BPolysciences, Inc.0226B-30Gömme Çözümü
JB-4  Gömme Kiti - CatalystPolysciences, Inc.02618-12Sızma Solüsyonu
Gömme KalıplarıPolysciences, Inc.23185-116 x 8 mm
Soyulabilir Keskin Gömme KalıplarıPolysciences, Inc.18986-122 mm x 22 mm kare, 12 mm x 12 mm olarak kesilmiş
JB-4  Plastik Blok TutucularPolysciences, Inc.15899
Tek Kullanımlık Dereceli Transfer BorularıVWR414004-014
Petrl ÇanakVWR25384-088Embriyo diseksiyonu
Forseps Inox Ucu  ROBOZRS-5015Embriyo diseksiyonu
Graefe Doku Forsesip  ROBOZRS-5153Embriyo diseksiyonu
Hassas Ameliyat Makası  ROBOZRS-6700Embriyo diseksiyonu
14 ml Polipropilen Yuvarlak Tabanlı TüplerFalcon352059
50 ml Polipropilen Konik TüplerFalcon352098
Buz KovasıMagic Touch Iceware International Corp.R19-343
100 ml (3,4 oz.) Antistatik Polistiren Tartı TekneleriVWR89106-766
330 ml (11,2 oz.) Antistatik Polistiren Tartı TekneleriVWR89106-770
Sodyum KlorürMP Biyomedikal102892PBS Çözeltisi
Potasyum KlorürSigmaP0662PBS Çözeltisi
Potasyum fosfat monobazikSigmaP5405PBS Çözeltisi
Sodyum fosfat dibazik heptahidratSigma-AldrichS9390PBS Çözeltisi
Dijital KameraHamamatsu FotonikC11440-10C
MikrotomLeicaRM2265
AydınlatıcıCarl ZeissHXP 200C
Floresan Stereo Zoom MikroskopCarl ZeissAxio Zoom.V16
Stereo MikroskopOlympusSZX16
Fiber Optik Işık KaynağıLeicaKL 1500 LCD
Tek Kullanımlık Mikrotom BıçağıVWR95057-832
Tek Kenarlı DağıtıcıPersonna62-0330-0000
ZENCarl Zeisspro 2012
PhotoshopAdobeCS6 v13.0
Amira 3D YazılımıVisage Imaging5.4
BilgisayarDell T7600, 2x900 GB SAS sabit sürücü ve 64 GB DDR3 RDIMM bellek
Sallanan Platform ÇalkalayıcılarVWR40000-304
Standart Sıcak Plaka KarıştırıcıVWR12365-382
Analitik TeraziMettler ToledoAB54-S

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gregg, C. L., Butcher, J. T. Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges. Differentiation. 84, 149-162 (2012).
  2. Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth defects Res C. 99, 93-105 (2013).
  3. Norris, F. C., et al. A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse. Trends Genet. 29, 700-711 (2013).
  4. Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis model mech. 7, 1143-1152 (2014).
  5. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 641-646 (2012).
  6. Sizarov, A., et al. Three-dimensional and molecular analysis of the arterial pole of the developing human heart. J Anat. 220, 336-349 (2012).
  7. Anderson, R. H., et al. Normal and abnormal development of the intrapericardial arterial trunks in humans and mice. Cardiovasc Res. 95, 108-115 (2012).
  8. Huang, Y. C., Chen, F., Li, X. Clarification of mammalian cloacal morphogenesis using high-resolution episcopic microscopy. Dev Biol. 409, 106-113 (2016).
  9. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb protoc. , 675-677 (2012).
  10. Weninger, W. J., Mohun, T. J. Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Methods mol biol. 411, 35-46 (2007).
  11. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
  12. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  13. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
  14. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 681-682 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

3B G r nt lemeFare Embriyosu G r nt lemeNumune Haz rlamaDoku effafla t rmaFloresan BoyamaEtanol ile DehidrasyonG mme lemiMikrotom ile Kesit Alma3B G rselle tirme

İlgili makaleler